双交联羧甲基壳聚糖基水凝胶及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种双交联羧甲基壳聚糖基水凝胶及其制备方法与应用，属于生物材料、天然高分子材料领域。

背景技术

皮肤受伤后，伤口会出现大量液体流失的情况，可能出现感染而引起严重的组织坏死，因此，伤口护理极为重要。伤口敷料的开发以尝试保护正在愈合的伤口免受到外界环境的侵袭并对伤口愈合的过程本身提供帮助为目标。起初，纱布或棉质敷料被使用，能够快速吸收血液，在伤口与外界间形成屏障，但在棉纱布使用过程中，可能因其会过度地吸收水分，粘附到伤口及新生组织上，从而在将其移除时会引起疼痛以及继发性损伤，在更换敷料时也可能遭到外部细菌侵袭而导致伤口受到感染。随着医学的发展，“湿润伤口环境”利于皮肤伤口修复的理念得到了广泛的研究和认同，从而提出理想的生物伤口敷料。由于水凝胶结构类似于天然细胞外基质，可满足生物伤口敷料的需求，同时可掺入各种药物或生长因子赋予水凝胶更多特性从而加速伤口愈合，基于这些特性，水凝胶被认为是有前途的生物伤口敷料材料之一。

壳聚糖是自然界中甲壳素脱乙酰过程后的一类产物，作为一种天然类多糖，具有无毒性、生物相容性等多种性能。通常天然多糖基水凝胶的机械性能较差，为保证敷料具有适当的机械性能，往往引入合成高分子来保持敷料的完整性，但在这个过程中可能存在引发剂过量或不能除去的问题。

细菌感染使炎症反应持续存在并阻碍伤口的正常修复，严重威胁到人类的健康。长期以来，抗生素一直被用于预防和治疗细菌感染，但广泛过度地使用抗生素会增加细菌的抗生素耐药性，银纳米粒子因其具有低毒性地广谱抗菌活性和能够满足低耐药性的需求而受到关注，但由于其存在偶极-偶极吸引而倾向于聚集，导致抗菌活性的减弱甚至丧失。因此，需要开发合适的载有银纳米粒子的天然多糖基抗菌敷料来缓解这些问题。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种双交联羧甲基壳聚糖基水凝胶、抗菌水凝胶。本发明通过将羧甲基壳聚糖与硅烷和钙离子进行化学-物理双交联，得到具有较好力学性能的天然多糖基水凝胶载体，同时可负载银纳米粒子，赋予该水凝胶抗菌及抗炎特性。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种双交联羧甲基壳聚糖基水凝胶，是以羧甲基壳聚糖、硅烷交联剂和钙离子为原料制成的化学-物理双交联水凝胶，是通过以下方法制备得到的：室温下，向羧甲基壳聚糖溶液中加入硅烷交联剂、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐（DMT-MM）和可溶性钙盐，混匀，静置至不再出现流动现象，即得到双交联羧甲基壳聚糖基水凝胶。

一种双交联羧甲基壳聚糖基抗菌水凝胶，是在上述双交联羧甲基壳聚糖基水凝胶及其上负载的银纳米粒子组成的，可通过以下方法制备得到：室温下，向羧甲基壳聚糖水溶液中加入银纳米粒子、硅烷交联剂、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐（DMT-MM）和可溶性钙盐，混匀，静置至不再出现流动现象，即得到双交联羧甲基壳聚糖基抗菌水凝胶。

进一步地，所述硅烷交联剂选自3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）。

进一步地，所述可溶性钙盐选自氯化钙。

进一步地，所述羧甲基壳聚糖与硅烷交联剂的用量关系为：每7～8克羧甲基壳聚糖添加1 mmol硅烷交联剂，优选每7.4克羧甲基壳聚糖添加1 mmol硅烷交联剂。

进一步地，所述4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐（DMT-MM）与硅烷交联剂的摩尔比为1.0～1.5:1，优选1.25:1。

进一步地，所述硅烷交联剂与钙离子的摩尔比为1.2～1.8:1，优选1.5:1。

进一步地，所述银纳米粒子的加入量为：每1克羧甲基壳聚糖加入60～65 mg银纳米粒子，优选62.5 mg。

进一步地，所述羧甲基壳聚糖溶液的浓度为4%（质量体积比，单位g/ml），溶剂为0.1%的醋酸溶液（质量体积比，单位g/ml）。

进一步地，所述硅烷交联剂、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐和可溶性钙盐均以溶液的形式加入；所述溶液的溶剂为MES缓冲溶液（MES缓冲溶液为现有技术中的商品化产品）。

进一步地，所述银纳米粒子以溶液的形式加入；所述溶液的溶剂为MES缓冲溶液。

具体地，双交联羧甲基壳聚糖基水凝胶的制备方法为：室温下，向1.5 ml的浓度为4%的羧甲基壳聚糖水溶液中加入75µL的 DMT-MM溶液，75µL的APTES溶液和75µL的CaCl

具体地，双交联羧甲基壳聚糖基抗菌水凝胶的制备方法为：室温下，向1.5 ml的浓度为4%的羧甲基壳聚糖水溶液中加入75µL的AgNPs溶液、75µL的 DMT-MM溶液，75µL的APTES溶液和75µL的CaCl

所述双交联羧甲基壳聚糖基水凝胶在制备促进伤口愈合的医用敷料中的应用。

所述双交联羧甲基壳聚糖基抗菌水凝胶在制备促进伤口愈合的医用敷料中的应用。

本发明的双交联羧甲基壳聚糖基水凝胶，是以羧甲基壳聚糖、硅烷交联剂和钙离子为原料制成的化学-物理双交联水凝胶，力学性能好，具有良好的细胞相容性、韧性和可变形性，制备时无需添加合成高分子材料和引发剂。本发明的双交联羧甲基壳聚糖基水凝胶可负载银纳米粒子制成双交联羧甲基壳聚糖基抗菌水凝胶，具有良好的抗菌作用，可保证银纳米粒子在16天的时间内稳定释放，可作为伤口愈合医用敷料来应用，可有效抑制细菌感染。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。

附图说明

图1：羧甲基壳聚糖基水凝胶凝胶化状态图。

图2：双交联羧甲基壳聚糖基抗菌水凝胶敷料的合成机理图。

图3：羧甲基壳聚糖基水凝胶的力学性能曲线图。

图4：双交联羧甲基壳聚糖基抗菌水凝胶敷料中银离子释放曲线图。

图5：双交联羧甲基壳聚糖基水凝胶不负载银纳米粒子和负载银纳米粒子的抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的效果图。

图6：图5的琼脂板上的菌落数量统计图。

图7：双交联羧甲基壳聚糖基水凝胶的体外细胞毒性效果图。

图8：小鼠创面修复过程图。

图9：小鼠未闭合的伤口面积比例变化示意图。

图10：小鼠创面的H&E染色组织形态学检测图。

图11：双交联羧甲基壳聚糖基抗菌水凝胶敷料的生物降解曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

本发明的所有数据结果均以平均值±标准差表示。统计学意义的测量采用单因素方差分析（One-way，ANOVA），

实施例1 羧甲基壳聚糖/硅烷单交联水凝胶的制备

（1）称取3.6 g羧甲基壳聚糖（CMC），置于90 mL 0.1%的醋酸溶液中，室温下搅拌，溶解，待至体系呈现出透明状的液体状态，室温下静置消泡，得到浓度为4%(w/v)的CMC溶液。

（2）称量0.096 g的4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐（DMT-MM），置于配制好的3 mL MES缓冲溶液中溶解形成DMT-MM溶液（0.136 M）；吸取96 µL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）于2.04 mL MES缓冲溶液中溶解形成APTES溶液（0.108 M）。

（3）采用倒置瓶法制备水凝胶：取1.5 mL CMC溶液，向其中依次加入75 µL DMT-MM溶液和75 µL APTES溶液，搅拌均匀，在室温下静置，待不再出现流动现象，即制备得到羧甲基壳聚糖/硅烷单交联水凝胶（CMCs-APTES），水凝胶凝胶化状态图如图1所示，其中，图1中最左侧的瓶是单独的羧甲基壳聚糖溶液，没有加入交联剂，此浓度下的羧甲基壳聚糖溶液虽然粘稠，但并没有形成凝胶。

实施例2 羧甲基壳聚糖/硅烷/钙离子双交联水凝胶的制备

（1）称量0.128 g的氯化钙置于4 mL的MES缓冲溶液中，溶解形成CaCl

（2）采用倒置瓶法制备水凝胶：取实施例1中制备的浓度为4%(w/v)的CMC溶液1.5mL，向其中依次加入75 µL的CaCl

实施例3 羧甲基壳聚糖/硅烷/钙离子双交联水凝胶敷料的制备

（1）称量25 mg银纳米粒子于500 µL MES缓冲溶液中，超声对其进行分散，获得AgNPs溶液。

（2）取实施例1中制备的CMC溶液1.5 mL，加入75 µL AgNPs溶液，缓慢搅拌至均匀，得混合溶液。

（3）采用倒置瓶法制备水凝胶敷料：向上述混合溶液中依次添加75µL的DMT-MM溶液（实施例1制备）、75µL的APTES溶液（实施例1制备）和75µL的CaCl

实施例4 水凝胶的拉伸性能检测

水凝胶的拉伸性能测试方法为：按照实施例1、实施例2及实施例3的方法制备4.8cm×2.5 cm的矩型水凝胶，去除表面水分，设置拉伸速度为20 mm/min，拉伸的初始长度为5mm，厚度为0.75 mm，拉伸实验在万能试验机上进行并重复进行三次。结果如图3所示，双交联羧甲基壳聚糖基水凝胶CMCs-APTES-Ca的拉伸应力可达到46.87±2.50 KPa，较单交联羧甲基壳聚糖基水凝胶CMCs-APTES的拉伸应力增加，且变形程度也有所增强，韧性得到提高，加入负载AgNPs后依旧保持着一个较好的应力情况，可以承受更多的外界力量。

实施例5 水凝胶敷料的体外银离子释放检测

水凝胶敷料的体外银离子释放检测方法为：取200µL CMC溶液，按照实施例3的比例制备CMCs-APTES-Ca-AgNPs水凝胶，将水凝胶分别置于装有25 mL 10mM pH=6.0和 pH=8.0的PB溶液的50 mL离心管中，放入37℃恒温振荡器中16天，在释放第1、2、4、8、12、16天时，分别从各离心管中取1.5 mL溶液于2 mL EP管中，并及时向各离心管中补充1.5 mL 相应pH值的 PB溶液，对在不同天数下获得的溶液稀释、过膜，并采用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）来测定释放的银离子含量。结果如图4所示，Ag

实施例6 水凝胶敷料的体外抗菌性能检测

水凝胶敷料的体外抗菌性能检测方法为：将实施例2和实施例3制备的水凝胶进行冻干处理，分别置于1×10

实施例7 水凝胶敷料的体外细胞毒性检测

准备水凝胶样品，分别为：实施例2制备得到的CMCs-APTES-Ca水凝胶，以及实施例3制备得到的CMCs-APTES-Ca-AgNPs水凝胶。将准备好的样品使用医用酒精进行消毒，并使用无菌磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）冲洗；将水凝胶样品分别完全浸没到含有0.1%双抗的DMEM无血清培养基的离心管中，其中，水凝胶材料的质量（g）与DMEM无血清培养基的体积（mL）比例为1:5，将离心管放到恒温振荡器中震荡，设置温度为37℃，转速为100 rpm；在第1、3、5天时，从离心管中分别取出2 mL供试溶液，并向离心管中补充2 mL含有0.1%双抗的DMEM无血清培养基；将取出的2 mL供试溶液加入125µL胎牛血清，并使用针式过滤器（0.22µm）过膜，得到第1、3、5天的水凝胶浸提液。

将100 µL细胞密度为5×10

实施例8 水凝胶敷料的体内愈合实验

使用6周龄的雄性昆明小鼠进行抗菌水凝胶敷料的体内安全性实验，体重为18～22 g，预饲7天，室温20～25℃，湿度40%～70%，换气频次为10～20次/小时，12 h明暗光交替。

伤口感染造模方法为：使用水合氯醛（7 wt%，0.05 mL/10 g）对小鼠实施麻醉，采用电动及脱毛膏的方式深度去除小鼠背部的毛发。通过D=5 mm的皮肤活检开孔装置，在小鼠背部区域造成圆形的皮肤创口，并通过感染金黄色葡萄球菌(1×10

治疗方法为：随机将小鼠分为三组，分别为Control组（不放置任何水凝胶）、CMCs-APTES-Ca水凝胶组（实施例2制备的水凝胶）、CMCs-APTES-Ca-AgNPs水凝胶组（实施例3制备的水凝胶敷料），敷料每2天更换一次，在第2、6和14天用数码相机拍摄伤口的照片，观察伤口愈合程度，结果如图8所示，并以建立伤口感染模型的面积百分比来表示，结果见图9。由图可见，第2天各组伤口已被金黄色葡萄球菌感染并造成创口腐烂。在治疗第6天，对照组和实验组的小鼠伤口均出现闭合的情况，CMCs-APTES-Ca-AgNPs组较CMCs-APTES-Ca组与对照组闭合情况更为明显，伤口未闭合率约达到40.45%，而CMCs-APTES-Ca组与对照组的伤口未闭合率分别约为74.52%和69.27%。在治疗第14天时，CMCs-APTES-Ca-AgNPs组未闭合的伤口面积比例降低到约仅6.37%，而CMCs-APTES-Ca组与对照组未闭合的伤口区域约为28.24%和15.76%，由此可见，CMCs-APTES-Ca-AgNPs水凝胶组在三组治疗方式中对创面伤口的愈合效果最好。

小鼠创面愈合的组织形态学分析方法为：取第6天和第14天小鼠背部创口的皮肤组织，用10%的福尔马林固定液对组织进行固定并进行石蜡包埋，开展H&E染色组织形态学检测，检测方法为标准检测方法。结果如图10所示，可观察到CMCs-APTES-Ca-AgNPs水凝胶组的炎症现象较CMCs-APTES-Ca水凝胶组和Control组减弱，这与负载的AgNPs释放出的银离子有关，银离子能够抑制金黄色葡萄球菌的生长，从而减弱并加速了炎症细胞浸润的现象，在第14天，CMCs-APTES-Ca-AgNPs水凝胶组不再观察到炎症情况，在CMCs-APTES-Ca水凝胶组和Control组中仍存在少量的炎症情况。

实施例9 双交联羧甲基壳聚糖基水凝胶敷料的生物降解性检测

生物降解性检测方法为：对实施例3制备的水凝胶敷料进行冷冻干燥，记录其质量m

Degradation of residual（%）=（m

图11表明，CMCs-APTES-Ca-AgNPs干燥水凝胶在自然环境下，降解一周后，水凝胶残余重量率约为91.46%，在整体的降解过程中，呈现出持续降解的趋势，同时在五周的降解时间内，残余重量率约为77.34%，质量减少率约为22.66%。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。