一株高产α-半乳糖苷酶的黑曲霉诱变菌株及其选育方法和应用

技术领域

本发明属于微生物发酵和酶催化水解技术领域，具体涉及一株高产α-半乳糖苷酶的黑曲霉诱变菌株及其选育方法和应用。

背景技术

α-半乳糖苷酶属于外切糖苷酶类，具有较强的水解能力，能水解棉子糖家族寡糖，其广泛存在于微生物、植物和动物中。α-半乳糖苷酶在食品、饲料工业中，该酶可作为一种外源添加酶，从而消除豆类食品和饲料中由α-半乳糖苷类物质引起的抗营养作用。出于从经济方面考虑，如今一部分研究在现有菌种的基础上利用成本低的农副产品为发酵基质来生产α-半乳糖苷酶，而另一部分研究则致力于改良菌种。具有高活性的α-半乳糖苷酶生产菌的选育以及获得优良的水解能力是目前所亟需的。

发明内容

为了解决α-半乳糖苷酶活性低，产量少的问题，本发明旨在获得一株高产α-半乳糖苷酶的黑曲霉诱变菌株，以提高该酶在工业生产中的应用潜能。采用紫外线(UV)-硫酸二乙酯(DES)复合诱变技术处理原始出发菌株黑曲霉，筛选出一株高产α-半乳糖苷酶的黑曲霉诱变菌株。该菌株所产的α-半乳糖苷酶活性高于原始菌株，在最佳固态发酵条件下能显示出较高的酶活，提高了生产效益，此外还具有良好的水解性能，在食品、饲料工业具有极为广阔的应用前景。

主要工艺路线：以黑曲霉菌株Aspergillus sp.C18为初始菌株，通过紫外线和硫酸二乙酯复合诱变手段对菌株进行诱变，最终筛选得到α-半乳糖苷酶酶活高的目的菌株，该菌株分类学命名为Aspergillus sp.D-23，保藏号为CGMCC No.40330，已于2022年10月17日保藏于中国普通微生物菌种保藏中心(简称CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明中的原始出发菌株为本实验室保藏的黑曲霉菌株Aspergillus sp.C18.

具体选育方法包括如下步骤：

(1)将黑曲霉菌株活化培养在PDA固体培养基上，培养3天，用无菌生理盐水将黑曲霉孢子洗脱下来，置于已灭菌的含有玻璃珠的离心管中，充分震荡，将孢子打散，取无菌纱布过滤孢子悬液，利用血球计数板，计算孢子个数，并取生理盐水进行稀释，使孢子浓度为1×10

其中，PDA固体培养基成分：土豆20％，葡萄糖2％，琼脂2％，加水定容至100mL，115℃灭菌30min。

(2)将步骤(1)所得孢子悬液在15W的紫外灯下垂直照射30cm处，在搅拌状态下，分别照射1、2、3、4、5、6、7、8、9、10min，各取1mL于装有无菌生理盐水的试管中，梯度稀释至10

其中，初筛筛选培养基成分：葡萄糖2％，KNO

X-α-Gal溶液配制方法：取4mg X-α-Gal溶于1mL DMF中，避光保存在-20℃；

X-α-Gal溶液的使用方法：倾倒平板后，取100μL经0.22μm无菌过滤器除菌的X-α-Gal溶液，涂布于平板上。

(3)将步骤(2)中初筛培养基上显蓝色的单菌落挑选出，接种到液体PDA培养基中，28℃，培养2d；再接种于固态发酵培养基中，以未诱变的初始菌株为对照，28℃，培养5d，测α-半乳糖苷酶的酶活，选择酶活高的菌株为下一步化学诱变的出发菌株。

其中，液体PDA培养基成分：土豆20％，葡萄糖2％，加水定容至100mL，115℃灭菌30min。

发酵培养基配方：麸皮32％，蛋白胨2％，(NH

(4)将步骤(3)中复筛发酵所得酶活最高的紫外诱变菌株制成孢子悬液，取硫酸二乙酯和95％乙醇制成不同浓度的DES溶液(v/v:10％、20％、30％、40％和50％)，将不同浓度的DES溶液与孢子悬液按体积比(DES/孢子悬液)1％混合，在28℃振荡处理20、40、60、90、120、150、180、210min，加入0.5mol/L硫代硫酸钠溶液2mL终止反应；各取1mL于装有无菌生理盐水的试管中，梯度稀释至10

其中，0.5mol/L硫代硫酸钠溶液：0.124g/mL硫代硫酸钠，0.45μm无菌过滤器除菌。

(5)对化学诱变后的菌株进行复筛，复筛方法同上述步骤(3)。

本发明还对筛选出的一株高产α-半乳糖苷酶的黑曲霉诱变菌株进行进一步固态发酵：从诱变育种得到的黑曲霉诱变菌株Aspergillus sp.D-23出发，对其产α-半乳糖苷酶的固态发酵进行优化。

固态发酵培养基成分如下：以麸皮为固体基质，以豆粕、蛋白胨、酵母粉、硫酸钠、柠檬酸三铵以及蛋白胨和硫酸铵作为氮源，其中，酵母粉添加量为2.8％、3.8％、4.8％、5.8％、6.8％，以Na

固态发酵培养条件如下：培养温度为22℃-34℃，培养pH为4.0-8.0，接种方式菌球和孢子，接种量2％-10％，装料量20g-70g，发酵时长5d。

将发酵后得到的α-半乳糖苷酶粗酶液进行纯化，并于棉子糖溶液进行水解，分析其水解能力。

本发明有益的技术效果在于：

本发明提供了一株高产α-半乳糖苷酶的黑曲霉诱变菌株，具有工业应用潜力；且采用的诱变方法成本低，诱变效果理想，本发明中采用固态发酵培养菌株，产生的α-半乳糖苷酶活性高，操作过程中具有操作简便、能耗低、对无菌要求相对较低、不易发生大面积污染等优点；该菌株产生的α-半乳糖苷酶具有良好的水解棉子糖家族寡糖的能力，未来在食品和饲料中有广阔的发展前景。

附图说明

图1为紫外诱变致死率曲线；在图1中，横坐标为紫外灯照射时间，纵坐标为致死率；

图2为化学诱变致死率曲线；在图2中，横坐标为终浓度0.4％的DES溶液处理时间，纵坐标为致死率；

图3为复合诱变后各菌株的α-半乳糖苷酶酶活力；在图3中，横坐标为初始菌株和各诱变菌株编号，纵坐标为α-半乳糖苷酶的酶活力；

图4为不同氮源对黑曲霉产α-半乳糖苷酶酶活力的影响；在图4中，横坐标为不同氮源的种类，纵坐标为α-半乳糖苷酶的酶活力；

图5为酵母粉添加量对黑曲霉产α-半乳糖苷酶酶活力的影响；在图5中，横坐标为酵母粉的添加量，纵坐标为α-半乳糖苷酶的酶活力；

图6为金属离子的种类对黑曲霉产α-半乳糖苷酶酶活力的影响；在图6中，横坐标为金属离子的种类，纵坐标为α-半乳糖苷酶的酶活力；

图7为金属离子(Fe

图8为含水量对黑曲霉产α-半乳糖苷酶酶活力的影响；在图8中，横坐标为含水量，纵坐标为α-半乳糖苷酶的酶活力；

图9为pH对黑曲霉产α-半乳糖苷酶酶活力的影响；在图9中，横坐标为pH，纵坐标为α-半乳糖苷酶的酶活力；

图10为温度对黑曲霉产α-半乳糖苷酶酶活力的影响；在图10中，横坐标为温度，纵坐标为α-半乳糖苷酶的酶活力；

图11为接种量和接种方式对黑曲霉产α-半乳糖苷酶酶活力的影响；在图11中，横坐标为接种量和接种方式，纵坐标为α-半乳糖苷酶的酶活力；

图12为装料量对黑曲霉产α-半乳糖苷酶酶活力的影响；在图12中，横坐标为装料量，纵坐标为α-半乳糖苷酶的酶活力；

图13为纯化的α-半乳糖苷酶的SDS-PAGE；在图13中，泳道3为目标蛋白条带；

图14为α-半乳糖苷酶水解棉子糖的薄层色谱层析法(TLC)分析；

图15为20U/mL的α-半乳糖苷酶水解棉子糖的高效液相色谱法(HPLC)分析；在图15中，横坐标为保留时间，纵坐标为峰面积。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进行具体描述。

实施例1高产α-半乳糖苷酶的黑曲霉菌株的诱变选育

(1)将黑曲霉菌株活化培养在PDA固体培养基上，培养3天，用无菌生理盐水将黑曲霉孢子洗脱下来，置于已灭菌的含有玻璃珠的离心管中，充分震荡，将孢子打散，取无菌纱布过滤孢子悬液，利用血球计数板，计算孢子个数，并取生理盐水进行稀释，使孢子浓度为1×10

所述PDA固体培养基成分：土豆20％，葡萄糖2％，琼脂2％，115℃灭菌30min。

(2)将步骤(1)制备孢子悬液在15W的紫外灯下垂直照射30cm处，在搅拌状态下，分别照射1、2、3、4、5、6、7、8、9、10min，各取1mL于装有无菌生理盐水的试管中，梯度稀释至10

所述初筛筛选培养基成分：葡萄糖2％，KNO

0.1％,MgSO

X-α-Gal溶液配置方法：取4mg X-α-Gal溶于1mL DMF中，避光保存在-20℃；

所述X-α-Gal溶液使用方法：倾倒平板后，取100μL经0.22μm无菌过滤器除菌的X-α-Gal溶液，涂布于平板上。

(3)将步骤(2)中致死率达到80％的初筛培养基上显蓝色的单菌落挑选出，接种到液体PDA培养基中，28℃，培养2d；再接种于固态发酵培养基中，以未诱变的初始菌株为对照，28℃，培养5d，测α-半乳糖苷酶的酶活，选择酶活高的菌株为下一步化学诱变的出发菌株(UV-5)。

所述液体PDA培养基成分：土豆20％，葡萄糖2％，115℃灭菌30min。

所述固态发酵培养基成分为：麸皮32％，蛋白胨2％，(NH

(4)将步骤(3)中复筛发酵所得酶活最高的紫外诱变菌株制成孢子悬液，取2mLDES和3mL 95％乙醇制成DES溶液，将DES溶液与孢子悬液按体积比(DES/孢子悬液)1％混合，在28℃振荡处理20、40、60、90、120、150、180、210min，加入0.5mol/L硫代硫酸钠溶液2mL终止反应；各取1mL于装有无菌生理盐水的试管中，梯度稀释至10

所述0.5mol/L硫代硫酸钠溶液：0.124g/mL硫代硫酸钠，0.45μm无菌过滤器除菌。

(5)化学诱变后的初筛培养和固态发酵复筛同上述步骤(3)，检测各诱变菌株的α-半乳糖苷酶酶活力，选取酶活力相对原始菌株最高的诱变菌株为最终的目的菌株即Aspergillus sp.D-23。

实施例2α-半乳糖苷酶的诱变菌株的酶活测定

α-半乳糖苷酶酶活力的测定方法为：以pNPG为底物测定α-半乳糖苷酶各诱变菌株的酶活力。用pH 4.5的磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲液配置8mM pNPG溶液，作为底物溶液。在试管中依次加入1.0mL稀释酶液，于50℃恒温水浴锅中平衡15min，接着快速加入5.0mL pNPG底物溶液(使用前需要在50℃平衡)，摇匀。在50℃恒温条件下，精确反应10min后，迅速加入2mL 0.5M的碳酸钠溶液，晃动混合，静置。将添加pNPG底物和碳酸钠溶液的顺序颠倒，其余步骤与样品处理方式相同，作为空白对照。在30min内，用1cm的石英比色皿，在420nm处测定样品试验液和空白液的吸光度。酶活单位的定义：在50℃，pH4.5条件下，每分钟催化底物释放1μmol对硝基酚所需的酶量为一个酶活单位，U。

将各诱变菌株接种于固态发酵培养基(麸皮32％，蛋白胨2％，(NH

实施例3α-半乳糖苷酶发酵工艺的优化

对实施例2中选育得到的黑曲霉进行进一步固态发酵，考察发酵条件对α-半乳糖苷酶的影响，具体步骤如下：

(1)氮源的种类及其添加量对黑曲霉产α-半乳糖苷酶的影响

确定麸皮为单一固体基质，以豆粕、蛋白胨、酵母粉、硫酸钠、柠檬酸三铵以及蛋白胨和硫酸铵作为氮源，28℃，静置发酵5d，测定α-半乳糖苷酶酶活力，结果如图4所示。由图4可以看到，当以酵母粉为氮源时，α-半乳糖苷酶酶活力有最大值。因此选择酵母粉作为氮源。

为进一步确定酵母粉添加量对黑曲霉产α-半乳糖苷酶的影响，选取添加量为2.8％、3.8％、4.8％、5.8％、6.8％五个水平进行试验，28℃，静置发酵5d，测定α-半乳糖苷酶酶活力，结果如图5所示。由图5可以看到，当酵母粉的添加量为5.8％时，α-半乳糖苷酶酶活力有最大值。因此，选择酵母粉的添加量为5.8％。

(2)金属离子及其添加量对黑曲霉产α-半乳糖苷酶的影响

以Na

为进一步确定金属离子(Fe

(3)含水量对黑曲霉产α-半乳糖苷酶的影响

以含水量为50％、55％、60％、65％、70％，28℃，静置发酵5d，测定α-半乳糖苷酶酶活力，结果如图8所示。由图8可以看到，当含水量为60％时，α-半乳糖苷酶酶活力有最大值。因此，选择含水量为60％。

(4)pH对黑曲霉产α-半乳糖苷酶的影响

以pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，28℃，静置发酵5d，测定α-半乳糖苷酶酶活力，结果如图9所示。由图9可以看到，当pH为5.0时，α-半乳糖苷酶酶活力有最大值。因此，选择pH5.0。

(5)温度对黑曲霉产α-半乳糖苷酶的影响

以温度为22℃、25℃、28℃、31℃、34℃，静置发酵5d，测定α-半乳糖苷酶酶活力，结果如图10所示。由图10可以看到，当温度为28℃时，α-半乳糖苷酶酶活力有最大值。因此，选择培养温度为28℃。

(6)接种方式以及接种量对α-半乳糖苷酶的影响

分别以菌球和孢子悬液两种方式接种，以接种量为2％、4％、6％、8％、10％，静置发酵5d，测定α-半乳糖苷酶酶活力，结果如图11所示。由图11可以看到，当接种方式为菌球，接种量为6％时，α-半乳糖苷酶酶活力有最大值。因此，选择接种方式为菌球，接种量为6％。

(7)装料量对黑曲霉产α-半乳糖苷酶的影响

以装料量为20g、30g、40g、50g、60g、70g，静置发酵5d，测定α-半乳糖苷酶酶活力，结果如图12所示。由图12可以看到，当装料量为30g时，α-半乳糖苷酶酶活力有最大值。因此，选择装料量为30g。

实施例4培养基成分的正交试验

通过实施例3中的单因素试验，为更好的探究菌株产酶的条件，选择酵母粉添加量，金属离子添加量和含水量三个因素，设计培养基成分的正交实验。正交试验的具体因素水平见表1。根据正交设计软件设计正交表进行试验，实验结果见表2。

表1培养基成分正交试验因素水平表

表2培养基成分正交试验结果表

三因素方差分析结果

本实施例说明影响α-半乳糖苷酶酶活力的培养基成分由主到次分别为：含水量，金属离子添加量，酵母粉添加量。诱变菌株黑曲霉的最佳产酶发酵培养基为：麸皮32％，酵母粉5.8％，Fe

实施例5α-半乳糖苷酶水解棉子糖溶液

具体包括如下步骤：

(1)棉子糖溶液的制备：称取0.04g棉子糖于10mL缓冲液中制成棉子糖溶液备用。

(2)α-半乳糖苷酶的纯化：将固态发酵物浸提于缓冲液中，过滤后的滤液即为粗酶液，将收集到的粗酶液利用Q阴离子柱的方法纯化，利用0.05M、0.1M、0.2M NaCl洗脱，收集0.2M洗脱液为部分纯化蛋白，如图13所示，目标蛋白在约125kDa处。

(3)取纯化后5、10和20U/mL的α-半乳糖苷酶酶液1mL，和棉子糖溶液1mL，分别于50℃下反应2，4，6，8，10小时，采用薄层色谱层析法(TLC)分析产物成分，如图14所示。使用高效液相色谱法(HPLC)分析水解产物的含量，在酶量为20U/mL时，在4小时时棉子糖几乎被降解完全，如图15所示。

本实例说明该黑曲霉诱变菌株所产的α-半乳糖苷酶具有良好的水解能力，是食品和饲料工业中降解棉子糖家族寡糖的良好候选者。

以上的实施例是对本发明的具体描述，仅用于说明本发明的技术方案，并非本发明技术方案的穷举，故不限制用于本发明的保护范围。