一种格木种子提取物及其制备方法与在制备具有镇痛和/或抗肿瘤作用的药物中的应用

技术领域

本发明涉及天然药物化学技术领域，具体涉及一种格木种子提取物及其制备方法与在制备具有镇痛和/或抗肿瘤作用的药物中的应用。

背景技术

格木(Erythrophleum fordii)是豆科格木属植物，具有丰富的化学成分和生物学作用。格木的种子和树皮可以入药，具有抗肿瘤、强心等功效。据文献报道格木的活性成分主要为卡萨因型生物碱，这类生物碱具有类似洋地黄的强心作用。

格木种子是格木E.fordii的种子，研究表明，其具有益气活血之功效，可治疗心气不足所致气虚血瘀之症，即心悸、气短、乏力、下肢及全身浮肿等症状。发明人前期从格木种子中分离得到一系列结构新颖的卡萨因二萜糖苷类化合物，并发现其主成分3β-羟基去甲格木苏胺-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对乳腺癌具有很好的抑制作用，具体见发明专利ZL201810087503.5。现有技术虽然公开了格木种子中具有抗肿瘤的活性成分，但是现有技术对于格木种子中的有效成分是否对耐药性肿瘤具有抑制作用并未有过报道；同时对于镇痛作用也未有过报道。

因此，以格木种子为原料，开发一种具有更好抗肿瘤作用的有效部位；尤其是开发一种具有抗耐药性肿瘤作用，或同时具有抗肿瘤作用和镇痛作用的有效部位具有重要的应用价值。

发明内容

为了克服现有技术中存在的至少之一的技术问题，本发明首先提供了一种格木种子提取物的制备方法。

本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：

本发明首先提供了一种格木种子提取物的制备方法，其包含如下步骤：

(1)取格木种子粉碎，用乙醇进行提取，将提取液减压浓缩得浸膏；

(2)将浸膏加水混悬，然后依次用二氯甲烷和正丁醇萃取，萃取结束后将二氯甲烷萃取液或正丁醇萃取液减压浓缩后得二氯甲烷部位或正丁醇部位；

取二氯甲烷部位或正丁醇部位即得所述的格木种子提取物。

发明人在研究中惊奇的发现，通过本发明上述方法制备得到的二氯甲烷部位和正丁醇部位具有一定的镇痛作用同时还具有抗癌作用。

优选地，步骤(1)中所述的乙醇是指体积分数为70～95％的乙醇。

优选地，步骤(1)中乙醇的重量用量为格木种子重量的8～15倍。

最优选地，步骤(1)中乙醇的重量用量为格木种子重量的10倍。

优选地，步骤(1)中的提取具体是指在35～50℃下进行超声提取30～60min。

最优选地，步骤(1)中的提取具体是指在40℃下进行超声提取40min。

优选地，步骤(2)中水的重量为浸膏重量的15～30倍。

最优选地，步骤(2)中水的重量为浸膏重量的20倍。

优选地，步骤(2)中水、二氯甲烷和正丁醇的体积比为1～2:1～2:1～2。

最优选地，步骤(2)中水、二氯甲烷和正丁醇的体积比为1:1:1。

本发明进一步将正丁醇部位进行大孔树脂柱层析的步骤。

优选地，将正丁醇部位进行大孔树脂柱层析的步骤具体为：

将正丁醇部位上样大孔树脂柱，然后依次用水、体积分数为10％、30％、50％、70％、90％以及无水乙醇进行洗脱，将各洗脱液减压浓缩去除溶剂后得水洗脱部位、10％洗脱部位、30％洗脱部位、50％洗脱部位、70％洗脱部位、90％洗脱部位以及无水乙醇洗脱部位；

将10％洗脱部位、30％洗脱部位、50％洗脱部位、70％洗脱部位以及90％洗脱部位混合后即得所述的格木种子提取物。

发明人在研究中进一步惊奇的发现，进一步通过上述大孔树脂柱方法制备得到的格木种子提取物，其镇痛作用得到了进一步增强；其镇痛作用要大幅高于二氯甲烷部位；同时，实验研究还表明，其镇痛作用也要明显强于阳性对照药阿司匹林，具有十分显著的镇痛作用，取得了预料不到的镇痛效果。

此外发明人还惊奇的发现，进一步通过上述大孔树脂柱方法制备得到的格木种子提取物其抗肿瘤作用要大幅高于发明专利ZL201810087503.5公开的3β-羟基去甲格木苏胺-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。这可能是由于通过本发明所述方法制备得到的格木种子提取物其中含有多种抗肿瘤活性成分，这些抗肿瘤活性成分之间产生了协同抗肿瘤作用的缘故。

更进一步的，发明人在研究中还惊奇的发现，进一步通过上述大孔树脂柱方法制备得到的格木种子提取物，其还具有抗耐药性肿瘤作用，并且其抗耐药性肿瘤作用也大幅高于发明专利ZL201810087503.5公开的3β-羟基去甲格木苏胺-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

优选地，所述的大孔树脂柱为D101型大孔树脂柱。

本发明还提供了一种由上述制备方法制备得到的格木种子提取物。

本发明还提供了一种上述格木种子提取物在制备具有镇痛作用的药物中的应用。

本发明还提供了一种上述格木种子提取物在制备具有抗肿瘤作用的药物中的应用。

优选地，所述的肿瘤为乳腺癌、肝癌、盲肠癌和/或卵巢癌。

优选地，所述的抗肿瘤作用是指抗耐药性肿瘤作用。

进一步优选地，所述的耐药性肿瘤为耐药性乳腺癌。

最优选地，本发明还提供一种上述格木种子提取物在制备同时具有抗肿瘤作用以及镇痛作用的药物中的应用。

有益效果：本发明提供了一种全新方法制备得到的格木种子提取物；研究表明，通过本发明所述方法制备得到的格木种子提取物其不仅具有抗肿瘤作用，同时还具有镇痛作用；因此，将其作为有效成分可以用于制备同时具有抗肿瘤以及镇痛作用的药物，使用该药物在治疗癌症的同时还有利于缓解癌痛，具有重要的应用价值。

尤其是，通过本发明所述方法制备得到的格木种子提取物其还具有抗耐药性肿瘤作用；并且其抗肿瘤作用以及抗耐药性肿瘤作用要大幅高于发明专利ZL201810087503.5公开的3β-羟基去甲格木苏胺-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；取得了预料不到的抗肿瘤效果。

附图说明

图1为采用本发明所述方法制备得到的格木种子提取物对疼痛斑马鱼运动的影响实验结果图(图中，*p<0.05,***p<0.001)。

图2为采用本发明所述方法制备得到的格木种子提取物对的镇痛实验结果图(图中，*p<0.05,***p<0.001)。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。

实施例1格木种子提取物的制备

(1)取格木种子粉碎，用10倍重量的体积分数为95％的乙醇在40℃下进行超声提取40min，提取结束后将提取液减压浓缩得浸膏；

(2)将浸膏加20倍重量的水混悬，然后依次用与水等体积的二氯甲烷和正丁醇萃取，萃取借宿后得二氯甲烷萃取液、正丁醇萃取液以及水萃取液；将二氯甲烷萃取液、正丁醇萃取液以及水萃取液减压浓缩后得二氯甲烷部位、正丁醇部位以及水部位；

(3)将正丁醇部位上样大孔树脂柱(大孔树脂柱中装填有正丁醇部位重量30倍的D101型大孔树脂)，然后依次用5倍柱体积的水、体积分数为10％、30％、50％、70％、90％以及无水乙醇进行洗脱，将各洗脱液减压浓缩去除溶剂后得水洗脱部位、10％洗脱部位、30％洗脱部位、50％洗脱部位、70％洗脱部位、90％洗脱部位以及无水乙醇洗脱部位；

(4)将10％洗脱部位、30％洗脱部位、50％洗脱部位、70％洗脱部位以及90％洗脱部位混合后即得所述的格木种子提取物。

实验例1镇痛实验

测试对象为按照实施例1所述方法制备得的水部位(以下简写为EF-W)、二氯甲烷部位(以下简写为EF-DC)以及格木种子提取物(以下简写为EF-BUM)；同时选用阿司匹林作为阳性对照药。

随机选取3dpf野生型AB品系斑马鱼180尾于六孔板中，分别水溶给予“EF-W”100μg/mL、“EF-DC”100μg/mL、“EF-BUM”100μg/mL，阳性对照品阿司匹林100μg/mL浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔斑马鱼为30尾，每孔容量为3mL，给予供试品1h后，用0.003％冰乙酸诱导建立斑马鱼疼痛模型，之后立即用行为分析仪观察记录各实验组斑马鱼在30min内的运动次数，并与模型对照组比较进行统计分析，以统计学意义分别评价“EF-W”、“EF-DC”、“EF-BUM”对斑马鱼的镇痛作用，按以下公式计算镇痛作用：

用方差分析和Dunnett’s T-检验进行统计学分析，p<0.05表明具有显著性差异，提供具有代表性的实验图谱。实验结果见表1和图1以及图2。

表1.镇痛实验结果(n＝10)

与模型对照组比较，*p<0.05，***p<0.001

从上述实验结果可以看出，模型对照组斑马鱼运动次数为648次，与正常对照组(12次)比较p<0.001，表明模型建立成功。阳性对照品阿司匹林在100μg/mL浓度下斑马鱼运动次数为354次，与模型对照组比较p<0.001，镇痛作用为45％，说明阿司匹林能缓解冰乙酸诱导的斑马鱼疼痛。“EF-W”、“EF-DC”、“EF-BUM”100μg/mL浓度下，其斑马鱼运动次数分别为630、469和324次，与模型对照组比较，“EF-W”组p>0.05，“EF-DC”组p<0.05，“EF-BUM”组p<0.001，镇痛作用分别为3％、28％和50％。

上述实验结果说明：通过本发明上述方法制备得到的二氯甲烷部位具有一定的镇痛作用；尤其是正丁醇部位进一步通过本发明上述大孔树脂柱方法制备得到的格木种子提取物，其镇痛作用要大幅高于二氯甲烷部位；同时，其镇痛作用也要明显强于阳性对照药阿司匹林，具有十分显著的镇痛作用，取得了预料不到的镇痛效果。

实施例2抗肿瘤实验

运用MTT法考察了提取物对多种肿瘤细胞株的细胞毒活性：

1)种细胞：收集对数生长期的细胞，用台盼蓝染液计数，用完全培养基配制细胞浓度为1ⅹ10

2)用完全培养基配制不同浓度的药物后，在加药孔中依次加入对应浓度的药物100μL至细胞中，对照孔加入不含药物的相同培养液，每个浓度6个复孔，在37℃，5％CO

3)每孔加入20μL的浓度为5mg/mL的MTT，将96孔板置于37℃，5％CO

4)取出96孔板，去除MTT溶液，吸走溶液时，注意操作，尽量避免吸走壁底的紫色结晶；

5)每孔加入150μL的DMSO，放置于摇床上振摇5分钟，至紫色结晶完全溶解；

6)用酶标仪检测各孔的吸光度值，检测波长为570nm，记录实验值，再根据公式计算细胞的增殖抑制率。测试结果见表2。

计算公式为：细胞增殖抑制率(％)＝(A

(A

测试药物为按照实施例1所述方法制备得的二氯甲烷部位(以下简写为EF-DC)以及格木种子提取物(以下简写为EF-BUM)；同时选用发明专利ZL201810087503.5公开的3β-羟基去甲格木苏胺-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(以下简写为化合物1)作为对照。

测试肿瘤细胞为：耐药性乳腺癌细胞(MCF-7/ADR)、乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、肝癌细胞(BEL-7402)、盲肠癌细胞(HCT-8)以及卵巢癌细胞(A2780)。

表2.各测试药物对不同癌细胞的IC

从表2实验数据中可以看出，将正丁醇部位采用本发明所述大孔树脂柱层析方法制备得到的格木种子提取物，其对乳腺癌、肝癌、盲肠癌以及卵巢癌等癌细胞的IC

上述实验结果说明：正丁醇部位采用本发明所述大孔树脂柱层析方法制备得到的格木种子提取物具有十分优异的抗肿瘤作用；其抗肿瘤作用要大幅高于发明专利ZL201810087503.5公开的3β-羟基去甲格木苏胺-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；同时，其抗耐药性肿瘤作用也大幅高于发明专利ZL201810087503.5公开的3β-羟基去甲格木苏胺-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；取得了预料不到的抗肿瘤效果。