一种利用高压脉冲电场精准控制分级提取紫花山奈生物活性物质的方法

技术领域：

本发明涉及一种利用高压脉冲电场精准控制分级提取紫花山奈生物活性物质的方法。

背景技术：

以药食同源植物山奈为代表的姜科山奈属植物是广东特色植物。目前，国内外很多专家学者对山奈的化学成分、营养价值进行了研究，发现其根茎中主要含有二萜类、二苯基烷庚类、简单芳烃类、苯丙素类、脂肪酸脂类、黄酮类、酚酸类等化学成分。其中多酚黄酮类物质具有抗氧化等活性，精油具有杀菌抑虫的作用。此外，山奈具有较高的营养价值，含有大量碳水化合物和蛋白质，少量脂肪。在姜科山奈属植物中，花朵呈淡紫色的品种为紫花山奈，学名：Kaempferia elegans(Wall.)Bak.，其根茎气味芳香，味道辛辣，含有丰富的多酚黄酮类物质、精油和活性多糖，并且栽培繁育简单快速，具有开发的潜在价值。

目前对于植物多酚黄酮类生物活性物质的提取常使用水提或有机溶剂提取、超临界流体萃取等。但是均存在一定的缺陷，水提或有机溶剂提取高温破坏其活性且效率低，超临界流体萃取价格昂贵，不适于工业生产。对于精油的提取常采用水蒸气蒸馏法、溶剂提取法、超临界萃取法等，水蒸气蒸馏时间较长，溶剂提取法用到的溶剂易燃易爆较为危险，超临界萃取法由于成本较高无法规模化生产。植物多糖常使用热水提取法、酸碱提取法、酶法等，但是热水提取耗时长且提取率低，酸碱提取法容易破坏多糖片段的结构，酶法价格较为昂贵，均不适合工业化的大规模生产。

目前关于脉冲电场提取植物活性物质的研究局限于使用脉冲电场的作用破坏细胞壁与细胞膜，再结合超声、热水、溶剂萃取等方法来提取单一的活性物质，例如CN103665177 B公开了一种采用高压脉冲电场提取马齿苋多糖的方法。CN113354749A公开了一种利用高压脉冲电场协同超声提取豆渣中水溶性大豆多糖的方法，上述方法虽然提高了活性物质的提取效率，但都未实现精准控制提取，对于植物具有的多种活性物质并未完全开发利用，有待进一步改进。

发明内容：

本发明的目的是提供一种利用高压脉冲电场精准控制分级提取紫花山奈生物活性物质的方法，通过调节脉冲电场能量的大小精准控制植物细胞壁的孔径大小范围，先后实现了对紫花山奈中多酚黄酮、精油、多糖的分级提取，高效率地得到了高得率、高纯度、高活性的生物活性物质，具有广阔的应用前景，解决了现有技术未实现精准控制提取，对于植物具有的多种活性物质并未完全开发利用的问题。

本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种利用高压脉冲电场精准控制分级提取紫花山奈生物活性物质的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将紫花山奈植株采摘后，取其根茎，洗净，置于40-45℃热风干燥箱中干燥过夜，然后粉碎、过筛，得到山奈粉；

(2)按料液比1:10-1:40加入紫花山奈粉和乙醇水溶液，搅拌均匀后，连接好蠕动泵，调节流速为5-20L/h并排除气泡，使样品充分流经脉冲电场处理室，进行脉冲电场处理，然后离心，得到上清液经冷冻干燥后得到多酚黄酮类生物活性物质；脉冲电场处理条件为：场强1-8kV/cm，频率100-1000Hz，脉冲数10-60；

(3)步骤(2)离心得到的沉淀物中按料液比1:10-1:40加入水，搅拌均匀后，连接好蠕动泵，调节流速并排除气泡，使样品充分流经脉冲电场处理室，进行脉冲电场提取，处理后的样品使用水蒸气蒸馏3-5小时，经过油水分离器分离，得到紫花山奈精油；脉冲电场提取条件为：场强20-40kV/cm，频率100-1000Hz，脉冲数10-60；

(4)将步骤(3)的剩余的料液离心得到上清液，加入3-5倍体积的无水乙醇，3-5℃醇沉24h后，在5000r/min条件下离心15-25min，取沉淀并烘干，加入适量去离子水复溶得到多糖溶液；

(5)步骤(4)得到的多糖溶液加入多糖溶液1/4-1/3体积的Sevage试剂，常温下搅拌15-30min后，在5000r/min条件下离心8-15min，除去上层清液、中层蛋白相，取下层水相，加入下层水相1/4-1/3体积的Sevage试剂重复上述除上层清液、中层蛋白相步骤，重复5次以上直至中层无变性蛋白；得到的下层水相溶液冷冻干燥后得到多糖。

步骤(2)和(3)处理过程要确保乳浊液的稳定流动，流速为5-20L/h。

优选地，步骤(2)料液比1:30-1:40。

优选地，步骤(2)乙醇水溶液质量分数为40-50wt％。

优选地，步骤(3)料液比1:30-1:40。

优选地，步骤(2)脉冲电场处理条件为：场强5-8kV/cm，频率500-1000Hz，脉冲数30-60。

优选地，步骤(3)脉冲电场处理条件为：场强30-40kV/cm，频率500-1000Hz，脉冲数30-60。

本发明通过调节脉冲电场能量的大小精确控制使细胞壁形成不同孔径的小孔，首先在1-8kV/cm低场强下形成5-10nm的小孔，在脉冲电场和自由基的作用下，使得多酚黄酮类物质沿着植物细胞的运输通道定向通过细胞壁小孔流到细胞外，脉冲电场处理为低温物理场处理，能够很好地保留多酚黄酮类物质的活性；然后在20-40kV/cm高场强下使细胞壁形成40-60nm的小孔，加速水蒸气蒸馏法提取精油的效率，得到高纯度的精油；经过上述的精准分级提取后，剩下的料液用来提取高活性、高纯度的多糖。该方法可以有效地精准控制植物细胞壁的孔径大小范围，实现了对紫花山奈中多酚黄酮、精油、多糖的分级提取，高效率地得到了高得率、高纯度、高活性的生物活性物质，节约了生物活性物质提取后的大量分离成本，实现了紫花山奈生物活性物质的全利用，提取的生物活性物质可用于开发功能性食品、保健品等，还可应用于医药、临床治疗等领域，具有广阔的应用前景。

本发明的有益效果如下：

1)本发明通过调节脉冲电场能量的大小精确控制植物细胞壁的孔径大小范围，实现了对紫花山奈中多酚黄酮、精油、多糖的分级提取，高效率地得到了高得率、高纯度、高活性的生物活性物质，节约了生物活性物质提取后的大量分离成本，实现了紫花山奈生物活性物质的全利用。

2)本发明采用栽培繁育简单快速、成本低的紫花山奈为原料精准调控、分级提取生物活性物质，对提高产品附加值和扩大经济效益具有重要意义。

3)本发明提取的紫花山奈的多酚黄酮类物质和挥发性精油具有良好的抗氧化活性、抑菌性等特性，紫花山奈多糖可以良好地抑制α-葡萄糖苷酶活性，具有潜在的控制血糖的能力，具有很大的药用价值，还可以用于功能性食品和化妆品等的开发。

具体实施方式：

以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

(1)将紫花山奈植株采摘后，取其根茎，洗净，置于40℃热风干燥箱中干燥过夜，用万能高速粉碎机将干燥好的原料粉碎、过筛，得到山奈粉；按料液比1:10加入紫花山奈粉和40wt％乙醇水溶液，搅拌均匀后，连接好蠕动泵，调节流速为20L/h并排除气泡，使样品充分流经脉冲电场处理室，进行脉冲电场处理，条件为：场强1kV/cm，频率100Hz，脉冲数10；离心得到上清液，冷冻干燥后得到多酚黄酮类生物活性物质；测试吸光度并根据标准曲线计算多酚黄酮类物质含量为5.8mg/g，纯度为87％；

(2)步骤(1)离心得到的沉淀物中按料液比1:10加入水，搅拌均匀后，连接好蠕动泵，调节流速为20L/h并排除气泡，使样品充分流经脉冲电场处理室，进行脉冲电场提取，条件为：场强20kV/cm，频率100Hz，脉冲数10；处理后的样品使用水蒸气蒸馏3小时，经过油水分离器分离，得到紫花山奈精油，精油的得率为20mg/g；

(3)将上一步剩余的料液离心得到上清液，加入4倍体积的无水乙醇，4℃醇沉24h后，在5000r/min条件下离心20min，取沉淀并烘干，加入适量去离子水复溶得到多糖溶液；

(4)步骤(3)得到的多糖溶液中加入多糖溶液1/4体积的Sevage试剂，常温下搅拌20min后，在5000r/min条件下离心10min，除去上层清液、中层蛋白相，取下层水相，加入下层水相1/4体积的Sevage试剂重复上述除上层清液、中层蛋白相步骤，重复5次以上直至中层无变性蛋白；得到的下层水相溶液冷冻干燥后得到多糖。采用苯酚-硫酸法分别对提取液中多糖含量进行测定，多糖的得率为306mg/g，纯度为88％。

对比例1：

参考实施例1，不同之处在于步骤(1)脉冲电场处理条件跟步骤(2)相同，为20kV/cm，频率100Hz，脉冲数10。测试吸光度并根据标准曲线计算多酚黄酮类物质含量为7.6mg/g，由于场强较大使细胞壁破孔较大，使得较多的杂质流出，影响了多酚黄酮的纯度，纯度仅为58％，后续需要繁琐的分离步骤。

对比例2：

参考实施例1，不同之处在于步骤(1)脉冲电场处理条件0.5kV/cm，频率100Hz，脉冲数10。测试吸光度并根据标准曲线计算多酚黄酮类物质含量为0.3mg/g，由于场强过小无法使细胞壁破能够使多酚黄酮类物质出来的孔。

实施例2

(1)将紫花山奈植株采摘后，取其根茎，洗净，置于43℃热风干燥箱中干燥过夜，用万能高速粉碎机将干燥好的原料粉碎、过筛，得到山奈粉；按料液比1:30加入紫花山奈粉和45wt％乙醇水溶液，搅拌均匀后，连接好蠕动泵，调节流速为10L/h并排除气泡，使样品充分流经脉冲电场处理室，进行脉冲电场处理，条件为：场强5kV/cm，频率1000Hz，脉冲数30；离心得到上清液，冷冻干燥后得到多酚黄酮类生物活性物质；测试吸光度并根据标准曲线计算多酚黄酮类物质含量为6.9mg/g，纯度为88％；

(2)步骤(1)离心得到的沉淀物中按料液比1:30加入水，搅拌均匀后，连接好蠕动泵，调节流速为10L/h并排除气泡，使样品充分流经脉冲电场处理室，进行脉冲电场提取，条件为：场强20kV/cm，频率100Hz，脉冲数30；处理后的样品使用水蒸气蒸馏4小时，经过油水分离器分离，得到紫花山奈精油，精油的得率为27mg/g；

(3)将上一步剩余的料液离心得到上清液，加入4倍体积的无水乙醇，4℃醇沉24h后，在5000r/min条件下离心20min，取沉淀并烘干，加入适量去离子水复溶得到多糖溶液；

(4)步骤(3)得到的多糖溶液加入多糖溶液1/4体积的Sevage试剂，常温下搅拌20min后，在5000r/min条件下离心10min，除去上层清液、中层蛋白相，取下层水相，加入下层水相1/4体积的Sevage试剂重复上述除上层清液、中层蛋白相步骤，重复5次以上直至中层无变性蛋白；得到的下层水相溶液冷冻干燥后得到多糖。采用苯酚-硫酸法分别对提取液中多糖含量进行测定，多糖的得率为368mg/g，纯度为90％。

实施例3

(1)将紫花山奈植株采摘后，取其根茎，洗净，置于45℃热风干燥箱中干燥过夜，用万能高速粉碎机将干燥好的原料粉碎、过筛，得到山奈粉；按料液比1:40加入紫花山奈粉和50wt％乙醇水溶液，搅拌均匀后，连接好蠕动泵，调节流速为5L/h并排除气泡，使样品充分流经脉冲电场处理室，进行脉冲电场处理，条件为：场强8kV/cm，频率1000Hz，脉冲数60；离心得到上清液，冷冻干燥后得到多酚黄酮类生物活性物质；测试吸光度并根据标准曲线计算多酚黄酮类物质含量为8.1mg/g，纯度为91％；

(2)步骤(1)离心得到的沉淀物中按料液比1:40加入水，搅拌均匀后，连接好蠕动泵，调节流速为5L/h并排除气泡，使样品充分流经脉冲电场处理室，进行脉冲电场提取，条件为：场强40kV/cm，频率1000Hz，脉冲数60；处理后的样品使用水蒸气蒸馏5小时，经过油水分离器分离，得到紫花山奈精油，精油的得率为35mg/g；

(3)将上一步剩余的料液离心得到上清液，加入4倍体积的无水乙醇，4℃醇沉24h后，在5000r/min条件下离心20min，取沉淀并烘干，加入适量去离子水复溶得到多糖溶液；

(4)步骤(3)得到的多糖溶液加入多糖溶液1/4体积的Sevage试剂，常温下搅拌20min后，在5000r/min条件下离心10min，除去上层清液、中层蛋白相，取下层水相，加入下层水相1/4体积的Sevage试剂重复上述除上层清液、中层蛋白相步骤，重复5次以上直至中层无变性蛋白；得到的下层水相溶液冷冻干燥后得到多糖。采用苯酚-硫酸法分别对提取液中多糖含量进行测定，多糖的得率为403mg/g，纯度为93％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。