一种简单安全快速的罗汉果组培外植体入瓶方法
文献发布时间：2023-06-19 18:32:25
技术领域
本发明涉及植物组织培养，涉及罗汉果的组织培养方法，具体涉及一种简单安全快速的罗汉果组培外植体入瓶方法。
背景技术
野外采集的罗汉果枝条表面存在大量细菌和真菌等其它微生物，而最难去除的是各种真菌污染，需要在截取茎段后进行消毒处理，才能入瓶。现有罗汉果组培外植体入瓶方法主要有以下问题：
1)升汞(HgCl
2)即使采用升汞表面消毒处理，对于那些受到严重环境微生物污染的罗汉果外植体，采用茎段直接入瓶还是很难获得无菌组培苗系。
发明内容
本发明的目的是提供简单安全快速的罗汉果组培外植体入瓶方法，消毒效果好，成株效率高。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种简单安全快速的罗汉果组培外植体入瓶方法，取罗汉果的茎段，表面清洁后浸泡于70％以上的酒精中进行表面消毒0.5-5分钟，剥取0.5-2毫米茎尖，接种至培养基中，即完成罗汉果组培外植体入瓶。
进一步地，所述茎尖长度为0.5-1毫米。
所述的酒精纯度70-75％。
所述茎段为1-3厘米的带节茎段。
所述茎段在酒精中浸泡的时间为0.5-5分钟。
所述培养基中还含有6-BA0.1-1ppm和NAA 0.01-0.1ppm。
进一步地，对于取自污染特别严重的罗汉果藤蔓的茎尖，所述培养基中还包含植物组培抗菌剂(PPM)，其含量为0.1-0.5％，优选为，0.1-0.2％。
所述培养基为MS培养基。
本发明的优点：
1.本发明针对野外采集罗汉果枝条材料的组培入瓶的微生物污染问题，提供上述罗汉果组培外植体入瓶方法，以酒精对罗汉果茎段外植体进行消毒处理，且剥取0.5-2毫米的茎尖转移至培养基中，完成罗汉果组培外植体入瓶。在消毒处理中，避免使用剧毒化学品升汞，对操作人员和环境都非常安全，操作简单，而且消毒效果好，成株率高。
2.本发明针对从严重污染的罗汉果枝条剥取的茎尖，培养基添加PPM1-2ml/L(0.1-0.2％)以后无菌苗成株率提高效果更佳，成株率提高1.5-4倍多。
3.本发明提供的罗汉果组培外植体入瓶方法，茎尖经过培养能够在5-6周后获得罗汉果无菌苗。
具体实施方式
实施例一
1.从野外采集罗汉果藤蔓适当保鲜处理后带回。把藤蔓修剪成1-3厘米带节茎段，自来水冲洗10-30分钟，然后置于70％酒精浸泡2分钟，然后用无菌水冲洗1-2次，用灭菌处理过的滤纸吸去多余水分。在显微镜下剥取1毫米大小茎尖，茎尖数30个，接种到含有6-BA0.1-1ppm和NAA0.01-0.1ppm的MS培养基上进行茎尖培养。
2.从野外采集罗汉果藤蔓适当保鲜处理后带回。把藤蔓修剪成1-3厘米带节茎段，自来水冲洗10-30分钟，然后置于0.1％HgCl
3.从野外采集罗汉果藤蔓适当保鲜处理后带回。把藤蔓修剪成1-3厘米带节茎段，自来水冲洗10-30分钟，然后置于0.1％HgCl
表1.不同消毒方法对外植体消毒效果及成株率的影响
注：发明人将酒精浓度提高至75％对消毒效果及成株率和70％相仿。
实施例二
1.从野外采集罗汉果藤蔓适当保鲜处理后带回。把藤蔓修剪成1-3厘米带节茎段，自来水冲洗10-30分钟，然后置于70％酒精浸泡0.5分钟，然后用无菌水冲洗1-2次，用灭菌处理过的滤纸吸去多余水分。在显微镜下剥取1毫米大小茎尖，茎尖数70个，接种到含有6-BA0.1-1ppm和NAA0.01-0.1ppm的MS培养基上进行茎尖培养。
2.从野外采集罗汉果藤蔓适当保鲜处理后带回。把藤蔓修剪成1-3厘米带节茎段，自来水冲洗10-30分钟，然后置于70％酒精酒精浸泡1分钟，然后用无菌水冲洗1-2-次，用灭菌处理过的滤纸吸去多余水分。在显微镜下剥取1毫米大小茎尖，茎尖数70个，接种到含有6-BA0.1-1ppm和NAA0.01-0.1ppm的MS培养基上进行茎尖培养。
3.从野外采集罗汉果藤蔓适当保鲜处理后带回。把藤蔓修剪成1-3厘米带节茎段，自来水冲洗10-30分钟，然后置于70％酒精浸泡2分钟，然后用无菌水冲洗1-2次，用灭菌处理过的滤纸吸去多余水分。在显微镜下剥取1毫米大小茎尖，茎尖数70个，接种到含有6-BA0.1-1ppm和NAA0.01-0.1ppm的MS培养基上进行茎尖培养。
表2.酒精消毒时间对消毒效果及茎尖成株率的影响
注：发明人将酒精浓度提高至75％对消毒效果及成株率和70％相仿。
实施例三
本实施例中，野外采集的是污染特别严重的罗汉果藤蔓。
1.从野外采集罗汉果藤蔓适当保鲜处理后带回。把藤蔓修剪成1-3厘米带节茎段，自来水冲洗10-30分钟，然后置于75％酒精浸泡2分钟，然后用无菌水冲洗1-2次，用灭菌处理过的滤纸吸去多余水分。在显微镜下剥取1毫米大小茎尖，茎尖数34个，接种到含有6-BA0.1-1ppm和NAA0.01-0.1ppm的MS培养基进行茎尖培养。
2.从野外采集罗汉果藤蔓适当保鲜处理后带回。把藤蔓修剪成1-3厘米带节茎段，自来水冲洗10-30分钟，然后置于75％酒精浸泡2分钟，然后用无菌水冲洗1-2次，用灭菌处理过的滤纸吸去多余水分。在显微镜下剥取1毫米大小茎尖，茎尖数34个，接种到含有6-BA0.1-1ppm和NAA0.01-0.1ppm的MS培养基进行茎尖培养。MS培养基中包含1ml/L的植物组培抗菌剂(PPM)。
3.从野外采集罗汉果藤蔓适当保鲜处理后带回。把藤蔓修剪成1-3厘米带节茎段，自来水冲洗10-30分钟，然后置于75％酒精浸泡2分钟，然后用无菌水冲洗1-2次，用灭菌处理过的滤纸吸去多余水分。在显微镜下剥取1毫米大小茎尖，茎尖数33个，接种到含有6-BA0.1-1ppm和NAA0.01-0.1ppm的MS培养基进行茎尖培养。MS培养基中包含2ml/L的植物组培抗菌剂(PPM)。
表3.植物组培抗菌剂(PPM)对外植体消毒效果及茎尖成株率的影响