一种抗肿瘤的化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于天然产物提取技术领域，涉及一种抗肿瘤的化合物以及该化合物的制备方法与应用。

背景技术

癌细胞，是一种变异的细胞，是产生癌症的病源。癌细胞与正常细胞不同，有无限增殖、可转化和易转移三大特点，能够无限增殖并破坏正常的细胞组织。

癌症是影响人类健康的重大疾病之一，其中肝癌是发病率和死亡率增长较快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。目前常用的抗肿瘤药物主要有以下几类：烷化剂类、抗代谢药、抗生素、植物药、激素及内分泌类药物、生物治疗药、中药类单方、中成药、海洋药物等。

以天然产物为来源的抗肿瘤药物具有活性显著、结构独特、作用机制不同于一般小分子化学治疗药物的优势。在抗肿瘤药物的研究与开发中的具有举足轻重的地位。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种抗肿瘤的化合物，其结构式如式Ⅰ所示：

本发明的第二目的是提供式(I)所述化合物的制备方法，包括如下步骤：

活化蓝状菌(Talaromyces sp.)ZHS32，在固体培养基中进行发酵，用乙酸乙酯浸提得到发酵产物，从发酵产物中分离纯化得到式(I)所述化合物。

本发明提供的化合物具有较好的抗肝癌肿瘤细胞活性，适宜于制备抗肝癌肿瘤药物。

附图说明

图1为化合物(1)的

图2为化合物(1)的

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均来自常规生化试剂商店。以下实施例中的定量试验，均设置3次重复实验，结果取平均值。

实施例1

菌株ZHS32的分离和鉴定

1.菌株ZHS32的采集与分离

2018年7月从舟山东海海洋沉积物中分离到一株菌，命名为菌株ZHS32。

菌株ZHS32为一种海洋来源的真菌。

2.菌株ZHS32的鉴定

分子鉴定

菌株ZHS32的18S ribosomal RNA部分序列见序列表的序列1(SEQ ID NO.1)，与GENBANK ACCESSION NO.LC434644.1的序列相似性最高，相似性为98.59％。

根据以上鉴定结果，菌株ZHS32属于蓝状菌(Talaromyces sp.)。

3.菌株ZHS32的保藏

菌株ZHS32，属于蓝状菌(Talaromyces sp.)，已于2021年06月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.21473。

实施例2

化合物的制备

大米培养基：将200g大米在200mL水中浸泡过夜，121℃高压蒸汽灭菌30min。

PDA培养基：将马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g和水1000mL混匀，121℃高压蒸汽灭菌30min。

1.菌株ZHS32的固体发酵

1.1菌株ZHS32的活化

将甘油管中保藏的菌株ZHS32在PDA平板上培养5d，等待菌落长满平板。

1.2菌株ZHS32的固体发酵

当菌落长满平板后，将5个3cm

2.化合物的提取

2.1在步骤1.2得到的三角瓶(含固体发酵物)中加入等体积有机试剂(乙酸乙酯)，室温浸提24h，收集第一次上清液。

2.2在步骤2.1的三角瓶中再次加入等体积有机试剂(乙酸乙酯)，室温浸提24h，收集第二次上清液。

2.3在步骤2.2的三角瓶中再次加入等体积有机试剂(乙酸乙酯)，室温浸提24h，收集第三次上清液。

2.4将步骤2.1的第一次上清液、步骤2.2的第二次上清液、步骤2.3的第三次上清液合并，减压蒸馏至干燥，得到19.5g粗提物。

3.化合物的分离纯化

3.1减压硅胶柱层析得到洗脱液

将步骤2.4得到的粗提物进行减压硅胶柱层析。

柱子型号为：6×35cm；

填充物为：薄层层析硅胶H；

洗脱过程为：用500mL洗脱液(由2体积份石油醚和8体积份乙酸乙酯组成)进行洗脱，流速为50mL/min，收集过柱后的洗脱液。

3.2将层析洗脱液进行中压ODS反相柱层析分离得到反相洗脱液

所述中压反相柱层析分离的参数具体如下：

柱子型号为：3×50cm；

填充物为：YMC GEL ODS-A；

以甲醇-水(20％甲醇-100％甲醇)梯度洗脱，流速为15mL/min；

收集体积为70％甲醇流动相的过柱后洗脱液，得反相洗脱液。

3.3将反相洗脱液进行反相HPLC分离得HPLC洗脱液

所述反相HPLC分离的参数具体如下：

柱子型号为：Reprosil-Pur Basic-C18(5μm；10×250mm)；

洗脱过程为：用体积百分含量为30–65％的乙腈水溶液梯度洗脱60min，流速为2mL/min。

收集保留时间为43.7–44.3min(峰值的保留时间t

3.4将步骤3.3收集的HPLC洗脱液减压蒸馏至干燥，得到3.0mg产物。

4.化合物的表征

将步骤3.4的产物进行有机质谱和核磁共振谱分析。

产物的表征数据如下：

黄色固体状；

分子式：C

依据以上表征数据上述化合物的理化数据和图谱，步骤3.4的产物为式(I)所示的化合物：

实施例3

式(I)所示化合物抗肿瘤作用。

采用MTS法检测式(I)所示化合物抗肿瘤作用。

将顺铂作为化合物的阳性对照，进行平行实验。

本实施例所用肿瘤细胞为：人肝癌细胞(HepG2)(购自中国医学科学院医学细胞中心)。

实验具体步骤如下：

1.细胞复苏

从液氮中取出冻存的人肝癌细胞(HepG2)，于37℃水浴中融化2分钟。离心2分钟后弃去上清，加入含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，轻轻吹打使细胞混合均匀，移入10cm培养皿中。加入RPMI-1640培养基10mL，置于37℃、5％CO

2.细胞传代

37℃预热PBS、培养基、胰酶。用PBS冲洗细胞培养液一次，弃掉PBS，加入0.25％的胰酶(含EDTA)，37℃消化2分钟。细胞消化后，加入与胰酶等量的含有血清的完全培养基，终止胰酶反应，用移液管轻轻吹打，使细胞脱离皿底成为单细胞悬液，进行细胞计数。按1:3–1:4分入新培养皿中，再加入10mL培养基，置于37℃、5％CO

3.细胞毒活性检测

取对数期生长的人肝癌细胞(HepG2)，消化后计数，3×10

4.结果判断

酶标仪490nm测定各孔光吸收值，记录结果，计算抑制率。

抑制率(％)的计算公式：(1-OD

用prism 6.0软件计算IC

式(I)所示化合物对人肝癌细胞(HepG2)的作用需重复3次试验。

式(I)所示化合物对人肝癌细胞(HepG2)的IC

顺铂对人肝癌细胞(HepG2)的IC

结论：式(I)所示化合物具有较好的抗肝癌细胞活性，可用于制备抗肝癌药物。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一种抗肿瘤的化合物及其制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 564

<212> DNA

<213> 蓝状菌(Talaromyces sp.)

<400> 1

ccgcactcgg taatgatcct tccgtagggg gacctgcgga aggatcatta ccgagtgcgg 60

gccctcgcgg cccaacctcc cacccttgtc tctatacacc tgttgctttg gcgggcccac 120

cggggccacc tggtcgccgg gggacgcacg tctccgggcc cgcgcccgcc gaagcgcact 180

gtgaaccctg atgaagatgg gctgtctgag tactgtgaaa attgtcaaaa ctttcaacaa 240

tggatctctt ggttccggca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataag taatgtgaat 300

tgcagaattc cgtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt gcgccccctg gcattccggg 360

gggcatgcct gtccgagcgt catttctgcc ctcaagcacg gcttgtgtgt tgggtgtggt 420

ccccccgggg acctgcccga aaggcagcgg cgacgtccgt ctggtcctcg agcgtatggg 480

gctctgtcac tcgctcggga aggacctgcg ggggttggtc accaccatgt tttaccacgg 540

tgacctcgga tcaggtagga gtct 564