一种尖刺拟菱形藻的快速显色检测方法

技术领域

本发明属于微藻检测技术领域，具体涉及一种尖刺拟菱形藻的快速显色检测方法。

背景技术

尖刺拟菱形藻属于硅藻门，菱形藻科，是全球近岸水域常见的浮游藻类，也是我国海域常见的赤潮灾种，在大连、青岛、长江口、厦门港及南海北部多个港湾都有其爆发藻华的报道；此外，尖刺拟菱形藻可以产生藻毒素，对海洋生物以及人体造成巨大危害。因此，对于尖刺拟菱形藻赤潮爆发机理、过程及监测预警等方面的研究一直是人们关注的热点之一。其中，如何能在野外环境中准确快速识别尖刺拟菱形藻是首要任务。

现阶段，用于检测尖刺拟菱形藻的方法主要是通过显微镜观察其形态学特征或利用其核酸信息进行分子鉴定，但是前者需要观测者具有丰富的分类经验，而后者则需要贵重、精密的仪器参与，这些操作较为繁琐、费时费力，均不适合现场样品的快速检测。所以，亟待寻求一种快速、准确、灵敏、便捷的尖刺拟菱形藻现场检测方法。

发明内容

本发明提供一种尖刺拟菱形藻的快速显色检测方法，从而能够实现快速准确的检测尖刺拟菱形藻。

本发明首先提供一组用于尖刺拟菱形藻检测的引物组，包含如下序列的引物：

F3:5′-ATTGCGCTGTACTGGTCT-3′(SEQ ID NO.1)、

B3:5′-TAGTGCGCAAACCAACAA-3′(SEQ ID NO.2)、

FIP:5′-GTAAACGATGGGCACCCTCACATGTTTGGGTGGAATCTGT-3′

(SEQ ID NO.3)、

BIP:5′-TTAGAGTGTTCAAAGCAGGCTTATAGGTCCTATATCATTATTC CATGC-3′(SEQ IDNO.4)、

LF:5′-GTACGACAACTTAATGC-3′(SEQ ID NO.5)；

上述的引物组用于检测尖刺拟菱形藻。

本发明再提供一种快速检测尖刺拟菱形藻的方法，包括如下的步骤：

1)将待检测的藻类样品离心收集后，去除上清液后用TE缓冲液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH＝8.0)重悬；将悬液加入裂解液中进行裂解；取裂解上清液加入稀释液中进行稀释，稀释液作为检测对象；

所述的裂解液成分如下：50mM Tris,100mM EDTA,50mM NaCl,1％(w/v)SDS,80％(v/v)甲酰胺,pH＝8.0。

所述的稀释液成分如下：0.1％ Tween 20。

2)将步骤1)制备的检测对象加入到含有羟基萘酚蓝(HNB)染料和Bst DNA聚合酶的恒温扩增反应液中，使用上述的引物组，在63℃反应30到40分钟后，通过颜色变化对结果进行判定。

3)结果判定：

阴性对照显紫罗兰色不变，阳性对照由紫罗兰色变为天蓝色，则试验过程正常。如果待测样本为紫罗兰色，则为阴性；如果待测样本为天蓝色，则为阳性；

所述的阳性对照，一般是以目标藻种的DNA作为反应模板，

阴性对照则以双蒸水代替DNA，加入到反应体系之中。

本发明提出了一种尖刺拟菱形藻的快速检测方法，在核酸提取阶段无需复杂的DNA提取步骤，在常温条件下，30分钟内即可实现藻种核酸的粗提；针对尖刺拟菱形藻的18SrDNA V4区序列，设计出了一组特异性引物，利用该引物组配合羟基萘酚蓝(HNB)染色剂，在63℃恒温条件下，可以对靶序列在30到40分钟实现扩增并完成检测。该方法特异性好，灵敏度高，且无需复杂的变温过程以及精密仪器，仅一个水浴锅或者恒温仪即可完成分析，大大简化了赤潮藻分子检测的流程，适合现场样品的快速检测。

附图说明

图1是不同株系的尖刺拟菱形藻18S rDNA(V4)比对结果图，选择不同株系的尖刺拟菱形藻18S rDNA(V4区)序列进行基因的保守性比对，目的是确定该段基因的保守性。

图2是尖刺拟菱形藻靶序列的特异性比对结果图，对微型原甲藻、东海原甲藻、米氏凯伦藻等12种常见赤潮藻种的18S rDNA序列进行比对，确定所选的保守区段具有良好的特异性，以保证设计引物的特异性；

图3是尖刺拟菱形藻引物初步筛选结果图，选择V4区作为靶序列，利用PrimerExplorer V5软件设计8套引物，并在美国国家生物技术信息中心(NCBI)进行特异性验证，然后于63℃反应50min，反应后用2％的琼脂糖凝胶电泳进行产物的检测，挑选出能成功扩增的引物组。图中，M:DL2000 DNA marker，后续每三个泳道对应一套引物，前两个泳道是添加DNA的实验组，第三个泳道是以等量双蒸水代替尖刺拟菱形藻DNA的阴性对照组。

图4是重构引物组位置示意图，对验证成功的常规引物组(包含两条外引物F3和B3，两条内引物FIP和BIP)，添加一条环引物LF；

图5是对重构引物组进行可行性检测结果图，图中M:DL2000 DNA marker，泳道1-3分别是两个添加目标基因组DNA的平行组以及阴性对照。

图6是尖刺拟菱形藻引物特异性验证结果图，其中图a是电泳检测结果，图b是HNB可视化显色结果。图a中，泳道1添加包含尖刺拟菱形藻在内的共12种常见赤潮藻种的混合基因组DNA(包含微型原甲藻、东海原甲藻、米氏凯伦藻、红色赤潮藻、链状裸甲藻、利玛原甲藻、太平洋亚历山大藻、链状亚历山大藻、中肋骨条藻、尖刺拟菱形藻、球形棕囊藻、浒苔)，泳道2添加除尖刺拟菱形藻之外的11种赤潮藻的混合基因组DNA(包含微型原甲藻、东海原甲藻、米氏凯伦藻、红色赤潮藻、链状裸甲藻、利玛原甲藻、太平洋亚历山大藻、链状亚历山大藻、中肋骨条藻、球形棕囊藻、浒苔)，泳道3以等量双蒸水代替泳道1、2的DNA，作为阴性对照；图b的泳道与图a对应。

图7是尖刺拟菱形藻引物组灵敏度检测结果图，其中图a是电泳检测结果；b-HNB可视化显色结果。泳道1-4DNA模板浓度分别为100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、0.1pg/μL，泳道5为阴性对照；图b和图a中泳道对应。

图8是尖刺拟菱形藻快速检测电泳图a和HNB可视化显色结果图b，其中M:DL2000DNA marker，泳道1、3、5、7、9依次是在63℃条件下，经过20min、30min、40min、50min、60min反应的阳性样品组(添加尖刺拟菱形藻基因组DNA，若产生扩增产物，则实物图呈天蓝色，对应的电泳图产生阶梯状条带)；泳道2、4、6、8、10依次是在63℃条件下，经过20min、30min、40min、50min、60min反应的阴性对照组(以等量双蒸水代替尖刺拟菱形藻基因组DNA，实物图呈紫罗兰色，电泳图只有引物二聚体条带)。在63℃条件下，本引物组仅需要30min至40min即可实现靶序列的扩增，样品管呈现出天蓝色，阴性对照为紫罗兰色。

图9是利用尖刺拟菱形藻自然海水样品进行检测的可视化检测结果图：阳性对照也即直接在配好的反应体系中添加尖刺拟菱形藻的基因组DNA，阴性对照则是以等量双蒸水代替基因组DNA，样品1和2分别是以粗提核酸(样品1-无尖刺拟菱形藻自然海水，2-含尖刺拟菱形藻自然海水)为模板进行扩增反应的产物。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。

实施例1：筛选用于引物设计的基因区域

1.靶序列的选择

本发明选择尖刺拟菱形藻18S rDNA基因的V4区作为靶序列区域，首先是确定所选基因区段具有较高保守性，从而使设计出的引物对于尖刺拟菱形藻不同株系均能实现扩增，不会因为株系区别而导致扩增失败；另外尖刺拟菱形藻18SrDNA V4可变区基因具有一定的特异性，方便与其他藻种区分。

选择不同株系的尖刺拟菱形藻18S rDNA(V4区)序列进行基因的保守性比对，比对结果如图1所示。由图1可知，本发明选择的尖刺拟菱形藻靶序列具有良好的保守性，不同株系之间几乎无差别，可以应用于特异性引物的设计，所有的基因序列均从美国国家生物技术信息中心(NCBI)下载，并利用Clustal X软件进行序列比对，所用序列GenBankAccession Number如下：MW336959、MW336967、MW336961、KP709004、GU373968、MZ267111、U18240、JN091724、GU373966、GU373967、JN091728。

2、基因目的区段特异性验证

从美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站上下载12种常见赤潮藻18S rDNA序列，藻种名称以及对应的GenBank Accession Number如下：微型原甲藻(Y16238)、东海原甲藻(AY551272)、米氏凯伦藻(FJ587220)、红色赤潮藻(AB183672)、链状裸甲藻(GU362426)、利玛原甲藻(AB189780)、太平洋亚历山大藻(KF908800)、链状亚历山大藻(AJ535392)、中肋骨条藻(JN676163)、尖刺拟菱形藻(KP709004)、球形棕囊藻(AJ278035)、浒苔(HQ850569)，并通过Clustal X软件进行序列比对，以确定靶序列的特异性，比对结果如图2所示。

图2比对结果表明本发明所选择的尖刺拟菱形藻18S rDNA V4区的保守区域相比于其他11种常见赤潮藻18S rDNA基因差别较大，也即有较强的特异性，可以用于特异性引物设计。

实施例2：引物设计

根据实施例1中选定的特异性目标区段，设计多组引物，并进行引物初步验证。设计好的待筛选引物如下：

表1：待筛选引物组的序列信息表

/>

利用上述设计好的引物组，在美国国家生物技术信息中心((NCBI)进行特异性验证。引物验证时，将4条引物的6段进行分组，F3和B3为一组，F2和B2一组，F1c和B1c一组，分别进行引物的特异性验证，F2和B2的特异性相对关键，F1c和B1c结合区通过Clustal X软件进行比对验证即可，尽量保证F3和B3特异性良好，否则电泳检测时可能会产生浅色拖尾带干扰检测。理论上，四条引物共6个区域有一个区域不能匹配成功，就不能实现成功扩增。

以引物组4为例，外引物比对结果如表2所示(F3,B3)。

表2：外引物BLAST比对结果表

表2给出了利用尖刺拟菱形藻设计出的引物组4中的外引物(F3,B3)在上文提到的12种常见赤潮藻(微型原甲藻、东海原甲藻、米氏凯轮藻、红色赤潮藻、链状裸甲藻、利玛原甲藻、太平洋亚历山大藻、链状亚历山大藻、中肋骨条藻、尖刺拟菱形藻、球形棕囊藻、浒苔)的基因库中进行比对的结果，表中只给出了和目标引物相似度相对高的基因区段，对于差距特别大的，表中没有给出。可以看到外引物的特异性良好，能与尖刺拟菱形藻对应区段完全匹配，可以与球形棕囊藻叶绿体基因部分匹配，但是差异较大，而且理论PCR产物长度长达4000bp，几乎不会对球形棕囊藻引起扩增，这再次印证了外引物的高度特异性。

内引物比对结果如表3所示(F2,B2)。

表3：内引物BLAST比对结果表

表3的比对结果显示，F2和B2具有非常高的特异性，在BLAST结果显示，该段引物只能与各种株系的尖刺拟菱形藻18S rDNA基因实现匹配，与其余11种目标藻基因差异显著，这进一步保证了引物组4的特异性。

初步验证引物特异性之后，使用设计出的多组引物进行扩增反应，反应体系和条件如下：0.1μM的F3和B3，各0.8μM的FIP和BIP，1.4mM的dNTP，6mM MgSO

扩增反应由于引物数量较多，阴性对照容易产生背景扩增信号，应该挑选出较长时间内阴性对照无背景信号产生且样品组能扩增出目的条带的引物组，如图3所示，引物组4扩增成功。

对于筛选出的引物组4，为了增强其扩增效率，在四条常规引物(F3,B3,FIP,BIP)的基础上，增加一条环引物LF。相关引物位置如图4所示。

环引物的添加是把双刃剑，在提高扩增速度的同时也可能会导致非特异性扩增的出现，所以需要对重构后的引物组进行重新检测。反应体系和条件如下：0.1μM的F3和B3，各0.8μM的FIP和BIP，0.2μM的LF，1.4mM的dNTP，6mM MgSO

阴性对照组没有阶梯状条带产生，证明该条环引物与已选常规引物组(表1中引物组4)适配度好，未引起非特异性扩增，该重构引物组可用。

实施例3：筛选的引物的检测效果

1、引物特异性

利用12种目标藻种的基因组DNA，将其等体积混合，作为模板1，将尖刺拟菱形藻之外的11种赤潮藻种基因组DNA等体积混合，作为模板2。实验时，按照如下体系配置好三份反应液(0.1μM的F3和B3，各0.8μM的FIP和BIP，0.2μM的LF，1.4mM的dNTP，6mM MgSO

2、引物灵敏度

利用尖刺拟菱形藻的标准阳性克隆质粒为模板，初始浓度为100pg/μL，以十倍梯度稀释，分别稀释10倍，100倍，1000倍，按照实施例3-1的反应体系和条件进行扩增，并通过2％的琼脂凝胶电泳进行检测，灵敏度可达到1pg/μL阳性克隆质粒。

由图7可知，使用浓度为100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL的质粒作为反应模板时，电泳检测结果显示均产生了扩增条带，比色法显示前三个管为天蓝色，与电泳结果一致，为阳性，使用浓度为0.1pg/μL质粒为模板时，电泳结果显示没有扩增条带产生且比色结果为紫罗兰色，为阴性，也即本引物组检测灵敏度可达1pg/μL尖刺拟菱形藻质粒DNA。

3、反应所需时间

以尖刺拟菱形藻基因组DNA为模板，按照实施例3-1体系于63℃进行扩增反应，设置反应时间梯度：20、30、40、50、60min，为了防止非特异性扩增的产生，每个梯度样品增加阴性对照(以等量双蒸水代替DNA)，产物利用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

检测结果如图8所示，扩增时间为30min时，图8(a)3号泳道，也即添加DNA的反应组，开始出现扩增产物条带，对应的实物图呈现天蓝色；图8(a)4号泳道，也即扩增时间为30min的阴性对照组，没有扩增条带产生，对应的实物图为紫罗兰色。反应时间为40、50、60min时，添加DNA的反应组均产生了亮度相近的阶梯状条带，对应的实物图开始呈现天蓝色，阴性对照均没有背景信号产生，实物图为紫罗兰色。所以经过40min的扩增反应，即可实现产物的检测。

实施例4：检测的基本流程

1.试验材料以及设备

a)试剂：

i扩增反应体系：Bst DNA聚合酶，缓冲液，dNTPs，硫酸镁，引物，双蒸水及羟基萘酚蓝染剂(HNB)；根据尖刺拟菱形藻18S rDNA(V4)基因序列设计并合成5条引物，分别是一对外引物(F3和B3)，一对内引物(FIP和BIP)和一条环引物(LF)。上述引物序列见表4。

表4：尖刺拟菱形藻引物序列信息表

/>

ii裂解体系：

裂解液成分：50mM Tris，100mM EDTA，50mM NaCl，1％(w/v)SDS，80％(v/v)甲酰胺pH＝8.0。裂解液每管1mL预装于裂解管中。

稀释液成分：0.1％ Tween 20。稀释液每管0.5mL预装于稀释管中。

b)仪器：

恒温仪

2.反应体系

检测体系组分及各组分浓度如表5所示，总反应体系25μL。

表5：反应体系表

*上述Buffer的成分包括：200mM Tris-HCl，100mM(NH

3.实验过程

a)收集与裂解藻细胞

将含有尖刺拟菱形藻的自然海水用0.45μm孔径滤膜过滤，然后用灭菌海水冲洗滤膜，达到浓缩富集藻细胞的作用；将含有尖刺拟菱形藻的海水12000×g离心5min，去除上清液后用250μL TE缓冲液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH＝8.0)重悬，充分振摇，涡旋30s，取200μL悬液加入裂解液管进行裂解(裂解管中预装1mL裂解液)；取上述裂解上清液10μL加入稀释液管中充分混匀(稀释管预装0.5mL稀释液)。此时，稀释管中的液体即可作为检测对象使用。

b)检测

取200μL离心管若干，按照表5反应体系配方配置反应体系，体系配置完毕之后，将加样后的反应体系置于恒温仪中，63℃反应30到40分钟，通过颜色变化对结果进行判定。

c)结果判定

当阴性对照显紫罗兰色，阳性对照由紫罗兰色变为天蓝色，则试验过程正常。如果待测样本为紫罗兰色，则为阴性；如果待测样本为天蓝色，则为阳性。

典型的检测效果如图9所示：阳性对照(直接在体系中添加尖刺拟菱形藻DNA进行扩增)、样品2(含尖刺拟菱形藻的自然海水粗提核酸为模板进行扩增)为天蓝色；阴性对照(以等量双蒸水代替DNA为模板进行扩增)、样品1(不含尖刺拟菱形藻的自然海水粗提核酸为模板进行扩增)为紫罗兰色。

综上，本发明设计筛选出了一组(共五条，包括四条常规引物和一条环引物)特异性引物，利用该引物组配合羟基萘酚蓝(HNB)染色剂，在63℃恒温条件下，可以对靶序列在30到40分钟实现扩增并完成检测，特异性好，灵敏度高，且无需复杂的变温过程以及精密仪器，仅一个水浴锅或者恒温仪即可完成分析，大大简化了赤潮藻分子检测的流程，适合现场样品的快速检测。