OSBPL3作为生物标志物在结直肠癌预后评估中的应用

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及OSBPL3作为生物标志物在结直肠癌预后评估中的应用。

背景技术

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是世界上最常见的消化系统癌症，其发病率位居全休恶性肿瘤的第三位，且死亡率位居第二。正因为它较高的死亡率(9.4％)，2020年，CRC在全世界造成了193万例新确诊病例和93.5万例死亡。手术是CRC的关键技术，但术后复发和转移导致预后不良。此外，由于症状出现较晚及转移发生较早，许多CRC患者初诊时已经为肿瘤晚期。化疗和放疗是晚期CRC的重要治疗手段，然而由于其非特异性细胞毒性，它们具有副作用，如中性粒细胞减少、腹泻、呕吐和放射性肠炎。免疫疗法已成为晚期CRC治疗的一种新选择，尤其是对化疗耐药患者，但由于遗传异质性，不同免疫治疗患者的预后不确定。因此，识别能够预测免疫治疗效果和CRC患者存活率的潜在预后生物标志物对于CRC的治疗和预后评价具有重要作用。

氧化甾醇结合蛋白样蛋白3(Oxidative sterol binding protein like protein3，OSBPL3)作为氧化甾醇蛋白结合蛋白(oxidative sterol binding proteins，OSBP)家族之一，是一组细胞内脂质受体。它具有C端OSBP结构域和N端pleckstrin homology(PH)结构域。OSBPL3主要在人的内质网和质膜中表达，已证实参与一些生理过程，如细胞粘附和脂质信号。此外，转录组分析显示OSBPL3与肿瘤发生有关，包括CRC、胰管癌、胰头癌、胃癌和转移性乳腺癌。目前，OSBPL3基因异常表达对CRC的预后评估意义尚不清楚。因此，从临床角度来看，研究OSBPL3基因在CRC中的异常表达，对CRC的预后评价极其重要。

发明内容

本发明第一方面的目的，在于提供OSBPL3作为生物标志物的应用。

本发明第二方面的目的，在于提供检测OSBPL3的物质在制备产品中的应用。

本发明第三方面的目的，在于提供OSBPL3作为靶点在筛选治疗或预防结直肠癌的药物中的应用。

本发明第四方面的目的，在于提供用于结直肠癌早期诊断、预后评估的甲基化位点。

本发明第五方面的目的，在于提供本发明第四方面的甲基化位点在制备诊断结直肠癌预后和/或预测结直肠癌患者死亡风险的试剂中的用途。

本发明第六方面的目的，在于提供一种用于结直肠癌诊断、预后和/或预测结直肠癌患者死亡风险的检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供OSBPL3作为生物标志物的应用，所述应用包括(1)～(6)中的至少一种；

(1)制备用于评价或预测结直肠癌的预后风险的产品；

(2)制备用于预测结直肠癌免疫治疗适用性的产品；

(3)制备用于预测结直肠癌患者生存率的产品；

(4)筛选用于结直肠癌治疗的产品；

(5)制备用于结直肠癌早期筛选的产品；

(6)结直肠癌的药物敏感性评估。

优选地，所述结直肠癌包括结肠癌和/或直肠癌。

本发明的第二个方面，提供检测OSBPL3物质在(7)～(11)中任一项中的应用；

(7)制备用于评价或预测结直肠癌的预后风险的产品；

(8)制备用于预测结直肠癌免疫治疗适用性的产品；

(9)制备用于预测结直肠癌患者生存率的产品；

(10)制定结直肠癌患者的治疗/用药方案；

(11)制备用于结直肠癌早期筛选的产品。

优选地，所述结直肠癌包括结肠癌和/或直肠癌。

优选地，所述检测OSBPL3的物质包含定量检测OSBPL3的物质。

优选地，所述检测OSBPL3的物质包括在基因和/或蛋白水平上检测OSBPL3的物质。

优选地，所述物质包括通过酶联免疫吸附试验、免疫荧光法、放射免疫测定法、免疫共沉淀法、免疫印迹法、高效液相色谱法、毛细管凝胶电泳法、近红外光谱法、质谱法、免疫化学发光法、胶体金免疫技术、荧光免疫层析技术、表面等离子共振技术、免疫-PCR技术、生物素-亲和素技术、PCR或生物芯片法检测所述OSBPL3表达量的物质。

优选地，所述检测OSBPL3的物质选自：对OSBPL3具有特异性的物质、OSBPL3特异性的探针、基因芯片、PCR引物。

优选的，所述PCR引物的上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述对OSBPL3具有特异性的物质为(b1)～(b3)中的任一种：

(b1)特异性结合OSBPL3的抗体；

(b2)特异性结合OSBPL3的配体蛋白或多肽；

(b3)特异性识别OSBPL3的非蛋白类化合物。

优选地，所述的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、功能性抗体片段、抗体Fab区，纳米抗体、嵌合抗体、多特异性抗体中的至少一种。

优选地，所述产品包括但不限于试剂、试剂盒、试纸、芯片。

优选地，所述产品的受试样品选自待测对象的体液、组织、细胞、排泄物中的至少一种。

本发明的第三个方面，提供OSBPL3作为靶点在筛选治疗或预防结肠癌的药物中的应用。

优选地，所述结直肠癌包括结肠癌和/或直肠癌。

本发明的第四个方面的，提供用于结直肠癌早期诊断、预后评估的甲基化位点，所述甲基化位点包括cg10661002、cg23191354、cg20455570和cg15041658中的一种或多种的组合。

本发明的第五个方面，提供本发明第四个方面的甲基化位点在制备诊断结直肠癌预后和/或预测结直肠癌患者死亡风险的试剂中的用途。

本发明的第六个方面，提供用于结直肠癌诊断、预后和/或预测结直肠癌患者死亡风险的检测试剂盒，包括：用于扩增本发明第四方面所述甲基化位点的特异性引物和探针。

优选的，所述试剂盒还包括转化液、结合液、洗涤液、纯化液、洗脱液、DNA提取试剂、PCR扩增试剂。

本发明的有益效果是：

本发明探讨了OSBPL3表达与CRC的预后和临床病理特征之间的关系，结果表明，与正常组织相比，OSBPL3在CRC肿瘤组织中表达明显增加。OSBPL3的分析和验证揭示了其与临床预后价值、DNA甲基化、免疫细胞浸润和药物敏感性的相关性，提示OSBPL3可作为CRC早期筛查或预后的生物标志物，作为临床试验的治疗靶点。

OSBPL3的高表达预示着更差的OS、DFS和FPS，GSE17538队列和自测验证数据验证了OSBPL3与结直肠癌不良预后相关，提示OSBPL3对结直肠癌有预后价值。虽然OSBPL3可能受到分期和体重的影响，但高表达组和低表达组的OS在分期和体重亚组中有显著性差异。为了进一步探索OSBPL3的临床价值，使用独立的预后因素(pT和OSBPL3)构建了一个列线图，结果表明，OSBPL3可能是一种有效的结直肠癌预后生物标志物。

附图说明

图1为OSBPL3在CRC中的表达情况；其中，A为OSBPL3在结直肠癌中的表达；B为OSBPL3在CRC中的配对关系；C为临床分期亚组中OSBPL3的表达，图中，nsP代表>0.05，*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001。

图2为结直肠癌中OSBPL3的多重组学分析结果；其中，A为OSBPL3突变组与非突变组的生存曲线；B为OSBPL3扩增组和正常二倍体组的生存曲线；C为OSBPL3甲基化位点在不同临床亚组中的分布情况；D为OSBPL3中甲基化位点的生存曲线。

图3为OSBPL3在结直肠癌中与生存状态的相关性；其中，A为TCGA-CRC数据集中OSBPL3的OS、PFS、DFS和DSS生存曲线；B为OSBPL3在TCGA-CRC数据集中的表达曲线及患者生存状态的散点图；C为GSE17538数据集中OSBPL3的OS、DFS和DSS生存曲线；D为GSE17538数据集中OSBPL3的表达曲线及患者生存状态的散点图；E为临床病例资料中OSBPL3的OS和DFS生存曲线。

图4为不同临床亚组的分层生存分析以及OSBPL3的预后评估；其中，A为T3、T4、体重均小于80kg患者的生存曲线；B为结直肠癌OS的单因素和多因素Cox回归分析；C预测结直肠癌患者生存率的列线图；D为预测患者1、3、5年生存率的校准图。

图5为差异表达基因的功能富集分析结果；其中，A为OSBPL3差异表达基因的火山图；B为OSBPL3的前10个差异表达基因热图；C为OSBPL3中差异表达基因的GO含量；D为OSBPL3中差异表达基因的KEGG；E为OSBPL3中差异表达基因的Metascape预测结果。

图6为SBPL3的免疫细胞浸润分析结果；其中，A为分类免疫细胞比例堆积条形图；B为OSBPL3高表达组和低表达组免疫细胞的差异；C为OSBPL3与免疫细胞的相关性。

图7为药物敏感性分析结果；其中，A为FDA批准药物OSBPL3与半抑制浓度的相关性，B为OSBPL3高表达组和低表达组之间药物的半抑制浓度。

图8为OSBPL3表达的临床验证结果；其中，A为CRC组织(肿瘤)和癌旁组织(正常)的IHC染色(n＝100；比例尺为500mm和200mm)；B为OSBPL3 IHC染色强度的散点图；C为采用qRT-PCR(n＝8)检测OSBPL3(CRC)和匹配癌旁组织(NC)中OSBPL3的表达结果，以平均±标准差(SD)表示，图中**代表p＜0.01，*代表p＜0.05。

图9为OSBPL3的cut-off值分析结果。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。

数据来源：CRC转录组数据(肿瘤＝616，正常＝51)、拷贝数变异(CNV)数据(肿瘤＝616，无正常样本)、单核苷酸变异(SNV)数据、甲基化数据(肿瘤＝381，无正常样品)、甲基化数据(肿瘤＝309，正常＝38)和临床数据从癌症基因组图谱(TCGA)数据库下载(https://portal.gdc.cancer.gov/)。从临床数据中移除无存活状态和存活时间的样本后，共获得612名CRC患者进行后续分析。此外，从基因表达综合数据库(GEO)中的GSE17538数据集下载了233个CRC转录组数据和存活数据(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)以验证患者的存活率。

本发明的实验中所有基因表达数据均使用log2转化标准化进行标准化。为了比较正常组织和恶性组织之间的差异，采用了两组t检验。使用Kaplan–Meier分析、Cox比例风险模型和对数秩检验进行所有生存分析。使用Spearman检验或Pearson检验检验两个变量之间的相关性；显著性差异定义为p＜0.05。所有统计研究均使用R编程语言进行。

实施例1

发明人从GDC(https://gdc.cancer.gov/about-data/publications/pancanatlas)的泛癌数据库中获得在CRC、COAD(结肠腺癌)和READ(直肠腺癌)肿瘤组织和正常组织中的表达数据然后，采用wilcox.t比较CRC肿瘤与正常组织中OSBPL3的表达情况，绘制框线图可视化结果，显示OSBPL3在配对样本中存在差异表达(图1中B)。采用COAD和READ联合数据，比较肿瘤样本和正常样本中OSBPL3的表达情况，结果显示OSBPL3在CRC样本和正常样本中存在差异表达(图1中A)。进一步比较CRC不同临床分期亚组中OSBPL3的表达情况，结果显示OSBPL3与CRC肿瘤T分期、N分期有一定的相关性，其中T4的表达显著高于T1，N2的表达显著高于N0(图1中C)，表明OSBPL3在CRC中的表达发生了变化。

实施例2结直肠癌中OSBPL3的多重组学分析

从癌症基因组图谱(TCGA)数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)下载结直肠癌(CRC)转录组数据(肿瘤＝616，正常＝51)、拷贝数变异(CNV)数据(肿瘤＝616，没有正常样本)、单核苷酸卵巢(SNV)数据(肿瘤＝381，没有正常样本)、甲基化数据(肿瘤＝309，正常＝38)和临床数据，提取OSBPL3的SNV数据和CNV数据，比较患者的OS，甲基化位点使用ChAMP软件包(version2.20.1)进行注释，分析CRC与正常组织间甲基化位点的差异(P<0.05，|deltaβ|>0.1)，并将差异表达的甲基化位点与OSBPL3进行相关性分析。然后，对甲基化位点与患者进行生存相关性分析。采用survminer计算甲基化的最佳阈值，根据最佳阈值将患者分为两组(突变组和野生组)，两组间进行OS分析。

根据SNV的数据，381个样本中只有9个发生了突变。通过分析突变组和野生组患者的OS，结果显示OSBPL3突变对患者生存没有影响(图2中A)；根据CNV数据，在616个样本中，扩增出361个样本，只有3个样本缺失，分析扩增组和二倍体组之间患者的OS，发现OSBPL3的CNV状态并不影响患者的生存(图2中B)；OSBPL3的甲基化位点在不同临床亚组中的分布，注释后获得了8个差异表达的甲基化位点(图2中C)。甲基化位点与OSBPL3表达的相关性分析显示，有7个甲基化位点与OSBPL3呈显著负相关(表1)。高甲基化位点组和低甲基化位点组之间的生存分析显示，4个甲基化位点(cg10661002、cg23191354、cg20455570和cg15041658)与患者的生存显著相关(图2中D)。表明OSBPL3与结直肠癌中的SNV无显著相关性，但与CNV和甲基化作用有显著相关性，OSBPL3的表达与不同的CNV突变模式显著相关，尽管CNV事件似乎与OS不相关，提示OSBPL3可能通过调节结直肠癌的甲基化过程来影响结直肠癌患者的预后。

表1OSBPL3甲基化与其表达的相关性

实施例3OSBPL3与CRC患者的预后评估

提取OSBPL3的表达数据，并与患者的生存时间和生存状态(总生存期(OS)、无进展生存期(PFS)、无病生存期(DFS)和疾病特殊生存期(DSS))进行合并，使用survminer软件包(0.4.9版)确定最佳阈值，并根据阈值将患者分为OSBPL3高表达组和低表达组，然后使用生存包(版本3.2-11)绘制生存曲线，比较两组的生存情况，最后，利用GSE17538数据集和自检数据来验证患者的生存情况。

生存曲线显示，OSBPL3与CRC患者的OS、DSS、DFS、PFS显著相关，OSBPL3的高表达预示着更差的OS、DFS和FPS，即OSBPL3表达量越高，CRC患者预后越差(图3中A)。通过绘制OSBPL3的表达曲线和患者状态的散点图，结果显示OSBPL3高表达组死亡的患者更多(图3中B)。在GSE17538验证集中，OSBPL3与CRC患者的OS、DSS显著相关(图3中C)，OSBPL3表达谱和患者状态散点图显示，OSBPL3高表达组患者死亡更多(图3中D)。在自测验证数据中，OSBPL3与CRC患者的OS和DFS显著相关(图3中E)。

进一步采用卡方检验比较不同临床亚组中OSBPL3高表达组和OSBPL3低表达组之间的差异，发现OSBPL3可能受体重、生命期和pT分期的影响(表2)；对差异显著的临床亚组进行pT和体重的分层生存分析显示，在T3/T4和体重小于80Kg的亚组患者中，OSBPL3仍与生存率显著相关(图4中A)；采用单因素和多因素Cox回归分析进行独立预后分析，显示，OSBPL3和pT是独立的预后因素(图4中B)。使用使用rms(版本6.2-0)包对OSBPL3、pT和1、3、5年生存概率构建了CRC患者生存预测的列线图(图4中C)，根据上述列线图绘制标定曲线来评估预测的准确性，结果表明OSBPL3基因在预测患者1年和3年生存率方面具有较高的准确性，但对5年生存率的预测较不理想(图4中D)；同时对100例CYC患者5年OS的进行Cox回归分析，结果如表3所示。上述结果提示OSBPL3可能是一种有效的结直肠癌预后生物标志物。

表2OSBPL3表达与CRC临床病理特征的相关性

表3 100例CYC患者的5年总生存期的Cox回归分析

实施例4差异表达基因(DEGs)的功能富集分析

通过limma软件包获得共128个OSBPL3高、低表达组之间的DEGs(P<0.05，|logFC|>0.5，|>0.5)；使用Ggplot2(version3.3.6)和pheatmap包(version1.0.12)绘制火山图和热图，如图5中A、B所示(热图中显示了前10个DEGs)，在生物过程(BP)方面，OSBPL3在抗菌体液反应、对革兰氏阳性细菌的防御反应和抗菌体液反应等方面显著富集；在分子功能(MF)方面，DEGs显著富集于信号受体激活物活性、受体配体活性等方面；在细胞组成(CC)方面，DEGs在酶原颗粒、高尔基管腔、酶原颗粒膜等中显著富集(图5中C)。进一步使用clusterProfile包(版本3.18.1)进行基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)的功能富集分析，KEGG富集结果显示，DEGs在IL17信号通路、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、唾液分泌和精氨酸生物合成中显著富集(图5中D)。利用Metascape在线数据库(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)对DEG进行功能预测，结果显示OSBPL3高、低表达组之间的DEGs可能与抗菌体液反应、过氧化氢代谢过程、内肽酶活性的负调控等显著相关(图5中E)。

实施例5SBPL3的免疫细胞浸润分析

为了进一步探索OSBPL3与TME的关系，发明人分析了肿瘤微环境中的免疫细胞，采用估计RNA转录物的相对子集进行细胞类型识别(CIBERSORT)算法用于分析高和低OSBPL3表达组之间的免疫细胞浸润，计算CRC样本中22个免疫细胞的比例(N＝612)，采用wilcox检验比较OSBPL3高、低表达组免疫细胞的差异。并对OSBPL3和免疫细胞进行Spearman相关分析，使用ggplot2绘制棒棒糖图。

根据相应的统计值得到316个P>为0.05的样本(图6中A)。OSBPL3与“T细胞”和“T细胞滤泡辅助细胞(Tfh)”密切相关，OSBPL3高表达组和低表达组之间的免疫细胞差异显示，即两个OSBPL3表达组的T细胞和T细胞滤泡辅助细胞存在显著差异(P<0.05)(图6中B)，提示OSBPL3可能主要通过上调这两个细胞来调控TME。此外，校正分析显示，OSBPL3与静息记忆CD4 T细胞、活化树突状细胞、活化NK细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞M1和T细胞调节性(treg)显著相关(图6中C)。

实施例6药物敏感性分析

美国国家癌症研究所(NCI)规定的60种癌细胞的基因表达数据是研发抗癌新药的强制性筛选，以及美国食品和药物管理局批准的163种药物，这些数据是从CellMiner数据库下载的(https://discover.nci.nih.gov/cellminer/loadDownload.do)，计算高和低OSBPL3表达组之间药物的IC50，然后分析OSBPL3与药物之间的spearman相关性，并使用ggpubr包绘制散点图。

结果表明，共筛选14种药物(Tegafur、Fluorouracil、Tfdu、Methotrexate、Melphalan,Pipobroman、Cisplatin、Denileukin Diftitox Ontak、6-Mercaptopurine、Streptozocin、Digoxin、Paclitaxel、Cyclophosphamide和Mitomycin)(P<0.05)，该14种药物的半抑制浓度与OSBPL3呈负相关(Cor2<-0.2)(图7中A)。根据OSBPL3的中位数将细胞系分为OSBPL3高表达组和低表达组，比较OSBPL3高表达组和低表达组之间14种药物的半抑制浓度，表明methotrexate、melphalan、fluorouracil、pipobroman、mitomycin、tfdu和cisplatin的半抑制浓度在OSBPL3高表达组和低表达组之间的半抑制浓度有显著差异(P<0.05)(图7中B)。可见，OSBPL3与多种药物呈负相关，且高表达组与低表达组间存在差异，OSBPL3组大多数化疗药物的半抑制浓度较高，说明OSBPL3组的敏感性较高，换句话说，高表达组的患者可以从这些药物中获益更多，表明OSBPL3可用于指导化疗。

实施例7OSBPL3表达的临床验证

取CRC患者(2016年至2017年在江门市中心医院经病理证实的100名结直肠癌患者，通过结肠镜检查或手术收集结肠直肠组织，并储存在江门中心医院附属的临床实验中心(江门市临床生物库和转化研究重点实验室)，其中男性40例，女性60例，年龄从20岁到75岁，平均年龄为56±8岁。由江门市中心医院伦理委员会批准并监督(决定编号：JXY2022107)，所有受试者均签署知情同意书)的CRC组织和癌旁样本进行IHC分析，并使用qRT-PCR验证CRC组织和癌旁组织中OSBPL3的表达水平。

IHC实验过程具体如下：CRC组织的切片被脱蜡和再水化；通过将抗原在95℃的柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中浸泡15分钟，然后在室温下用0.3％过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性15分钟来实现抗原回收；在室温下用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗，并用5％正常山羊血清(美国Thermo Fisher Scientific，Inc.)阻断30分钟后，将一级抗OSBPL3抗体(1:50；美国Abcam)应用于切片；使用过氧化物酶抗过氧化物酶检测方法，将所有切片复染、脱水，并在室温下用盖玻片固定。使用细胞质和/或细胞核中的黄色颗粒估计阳性结直肠细胞的比例，染色强度分为阴性(-)、弱阳性(+)、中阳性(++)或强阳性(+++)。通过将强度评分(范围0～3)乘以阳性细胞百分比(范围0～300)来确定H评分。同时，两位病理学家采用双盲方法确定H评分。

qRT-PCR的具体实验过程如下：用TRlzol试剂(Ambion)裂解8对CRC组织，并根据说明书分离总RNA；然后用Nanodrop测试RNA纯度和浓度；使用Saville的surescript第一链cDNA合成试剂盒进行mRNA逆转录得到cDNA；qRT-PCR反应在CFX96实时定量荧光PCR仪器(BIO-RAD)中进行，qPCR反应体系如下：3μL cDNA、5μL 2×Universal Blue SYBR GreenqPCR Master Mix、1μL正向引物和1μL反向引物(OSBPL3-F：5’-GCAGTCTGTCTGCAAGTGGC-3’(SEQ ID NO.1)，OSBPL3-R：5’-TGACAAGGGAGCCGAGAGTA-3’(SEQ ID NO.2)，GAPDH-F：5’CCCATCACCATCTTCCAGG-3’(SEQ ID NO.3)，GAPDH-R：5’-CATCACGCCACAGTTTCCC-3’(SEQ IDNO.4)，引物由深圳市青科生物科技有限公司合成)，反应条件如下：95℃预变性1分钟；95℃孵育20秒、55℃孵20秒、72℃孵30秒，40个循环。设置GAPDH为内部控制，并设置三个平行实验。

通过对100例CRC患者的CRC组织和癌旁样本进行IHC分析，发现OSBPL3在CRC样本中高表达(图8中A和B)。进一步使用X-tile软件通过IHC的评分去测定OSBPL3的cut-off值，结果表明OSBPL3的cut-off值为208(图9)。收集8对CRC组织和癌旁标本，采用qRT-PCR检测OSBPL3的表达水平，结果表明，OSBPL3在CRC样本中显著上调(图8中C)，结果与TCGA-CRC数据集的表达结果一致。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。