circIGF1R在促进猪骨骼肌卫星细胞成肌分化中的应用

技术领域

本发明涉及分子遗传技术领域，具体地说，涉及circIGF1R在促进猪骨骼肌卫星细胞成肌分化中的应用。

背景技术

环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类呈封闭环状结构的RNA，富含microRNA(miRNA)结合位点，在细胞中可充当miRNA海绵(miRNA sponge)，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用。大量研究证明circRNA在细胞分化的生物学过程中起重要作用，但其在猪方面研究仍处于初级阶段。研究circRNA对猪骨骼肌卫星细胞的作用，可对改善猪肉品质提供理论基础。

发明内容

本发明的目的是提供circIGF1R在促进猪骨骼肌卫星细胞成肌分化中的应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供circIGF1R在促进猪骨骼肌卫星细胞成肌分化中的应用，其中circIGF1R为外显子circRNA，其序列如SEQ ID NO:1所示。

第二方面，本发明提供一种促进猪骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法，所述方法包括：增加猪骨骼肌卫星细胞中circIGF1R的表达。

其中circIGF1R为外显子circRNA，其序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步地，增加猪骨骼肌卫星细胞中circIGF1R的表达的方式包括：在细胞中转染circIGF1R的过表达载体。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明首次发现circIGF1R具有促进猪骨骼肌卫星细胞成肌分化的功能。在猪骨骼肌卫星细胞中过表达circIGF1R后，qRT-PCR和western blot结果显示成肌相关因子的表达均极显著降低(P<0.01)，免疫荧光染色发现肌管数量显著减少，证明circIGF1R可促进猪骨骼肌卫星细胞的成肌分化。干扰circIGF1R后呈现相反的结果。以上结果表明circIGF1R可促进猪骨骼肌卫星细胞的成肌分化。本发明为circIGFR在改善猪肉质品质中的应用提供新的理论依据。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中circIGF1R后对骨骼肌卫星细胞成肌分化的影响。其中，a、b：细胞转染效率；c、d：成肌相关因子在mRNA水平的表达变化；e、f：成肌相关因子在蛋白水平表达变化；g、h：细胞免疫荧光结果。

图2为本发明较佳实施例中circIGF1R对猪骨骼肌卫星细胞增殖的影响。a、b：细胞增殖相关基因的表达变化；c、d：CCK8结果；e、f：EdU结果。

图3为本发明较佳实施例中circIGF1R可作为miR-16海绵的研究。a、b：circIGF1R和miR-16在猪肌肉不同发育阶段的表达变化；c、d：猪卫星细胞成肌分化过程中circIGF1R和miR-16的表达变化；e、f：过表达/干扰circIGF1R后miR-16的表达变化；g：RNhybrid预测circIGF1R与miR-16的结合位点；h：psiCHECK2-circIGF1R-Wt和psiCHECK2-circIGF1R-Mut序列；i：双荧光素酶报告基因试验检测结果；j：AGO2-RIP测定结果。

图4为CircIGF1R的同源性分析结果。a：猪circIGF1R和小鼠circIGF1R序列比对结果；b：猪circIGF1R和人circIGF1R序列比对结果。

图5为本发明较佳实施例中circIGF1R对C2C12细胞成肌细胞分化的影响。a、b：细胞转染效率；c、d：成肌相关因子在mRNA水平的表达变化；e、f：成肌相关因子在蛋白水平表达变化；g、h：细胞免疫荧光结果。

图6为本发明较佳实施例中miR-16对C2C12细胞成肌细胞分化的影响。a:miR-16的同源性分析结果；b：过表达circIGF1R后miR-16的表达变化；c、d：细胞转染效率；e、f：成肌相关因子在mRNA水平的表达变化；g、h：成肌相关因子在蛋白水平表达变化；i、j：细胞免疫荧光结果。

图7为本发明较佳实施例中小鼠circIGF1R与miR-16的调控关系。a：Rnhybrid软件预测小鼠circIGF1R与miR-16的结合位点；b：干扰circIGF1R后miR-16表达的变化。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1circIGF1R对猪骨骼肌卫星细胞分化的影响

1.材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验细胞及试验试剂

以刚出生的仔猪为试验动物分离猪骨骼肌卫星细胞。

2×Es Taq Master Mix、DNAmarker购自康为世纪科技有限公司；

1.1.2试验试剂配制

完全培养基：10％FBS+90％DMEM/高糖+1％青链霉素

成肌诱导培养基：2％HoS+97％DMEM/高糖+1％青链霉素

细胞冻存液：30％FBS+60％DMEM/高糖+10％DMSO

1.1.3试验仪器

实时荧光定量PCR仪(ABI 7500，AB，美国)；核酸蛋白测定仪(ND-1 000，Nanodrop，美国)；电泳仪(DYCP-31，六一生物，北京)；凝胶成像系统(GelDoc XR Biorad，Bio-Rad，美国)；PCR仪(ABI 9700，Applied Biosystems，美国)。

1.2试验方法

1.2.1细胞培养

猪骨骼肌卫星细胞的分离与纯化如下：

①猪骨骼肌卫星细胞的分离

(1)提前配制消化工作液和完全培养基；

(2)刚出生的仔猪放血处死后，75％酒精清洗全身，取背最长肌放入75％酒精中清洗后放入含4％双抗的PBS中备用；

(3)使用含1％双抗PBS反复冲洗肌肉组织，并在冲洗过程中剪除肌肉中的血管与筋膜，将处理干净的肌肉组织放入装有少量PBS的小烧杯中，将肌肉尽量剪碎；

(4)将剪碎的肌肉组织转移到50ml离心管中，按照体积1:10的比例加入消化工作液，37℃摇床上消化1h；

(5)消化完成后，加入等体积完全培养基终止消化。依次过100μm、40μm过滤筛，过滤之后1500r/min离心5min，弃上清液；

(6)用3mL红细胞裂解液重悬细胞，轻柔吹打多次，静置2min，再加入5mL PBS。1500g离心5min，弃上清液；

(7)用5mL生长培养完全培养基重悬细胞，轻柔吹打均匀，转移至培养皿中，放入培养箱中培养。

②猪骨骼肌卫星细胞的纯化

待卫星细胞汇合至90％以上，用胰酶消化细胞后1500g离心5min，重悬细胞铺到10cm皿中，放入培养箱中静置1h后，吸取上层培养基到新的10cm培养皿，放入培养箱中继续正常培养。

1.2.2siRNA设计与转染

根据circIGF1R序列，针对其junction位点设计合成抑制其表达的siRNA(正义链：5′-CAGAAAAUCUGCGGGCCGGTT-3′；反义链：5′-CCGGCCCGCAGAUUUUCUGTT-3′)。使用前将其溶解成20μmol·L

将细胞铺于6孔板后待细胞密度达70％左右进行转染，使用Lipofectamine 3000转染试剂转染，siRNA转染浓度为80nM，质粒转染质量为3μg，转染6h后更换完全培养基。

1.2.3RNA提取及qRT-PCR

细胞RNA的提取操作步骤参考Trizol试剂说明书，并使用核酸检测仪测定RNA浓度，将RNA浓度归一为1000ng/μL，使用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。以cDNA为模板，使用SYBR Select Master Mix和ABI Prism 7900监测系统进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)。引物使用premier 6设计，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列见表1。猪基因表达量以18S rRNA为内参，鼠基因表达量以β-actin为内参，采用2

表1引物信息

1.2.4circIGF1R过表达载体的构建

①circIGF1R全长克隆

(1)根据前期转录组测序结果可知ciecIGF1R全长546bp，经过序列比对，猪circIGF1R和小鼠circIGF1R序列同源达到93％，同源性较高，根据猪circIGF1R序列设计合成扩增引物P-circIGF1R-F0/R0，并合成酶切引物P-circIGF1R-F1/R1，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列见表2。

表2合成circIGF1R所需引物

(2)以猪cDNA为模板，使用P-circIGF1R-F0/R0引物进行PCR扩增，反应体系为：2×PCR buffer for KOD FX 25μL，2Nm dNTPs 10μL，P-circIGF1R-F0 1.5μL，P-circIGF1R-R01.5μL，cDNA 200ng，KOD FX 1μL，补足水至50μL。扩增程序为94℃2min，98℃10s，65℃30s，68℃1min，35个循环，68℃4min。

(3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳完成后，将琼脂糖凝胶至于紫外照胶台上，迅速切取所需条带，称取凝胶块重量，之后按照胶回收试剂盒说明书进行DNA纯化。

(4)纯化产物连接到载体上，反应程序为16℃过夜。

(5)取出50μL DH5α感受态细胞于冰上解冻，待感受态细胞溶解至冰水混合物的状态，加入5μL连接产物，冰浴30min，42℃水浴热激60s，然后快速转移至冰浴2min，加入1mL灭菌LB液体培养基，37℃，200r/min培养1h。

(6)涂布器灼烧灭菌，待冷却后，吸取100μL菌液，将菌液均匀涂布到含氨苄青霉素的LB固体培养基上直至菌液吸收，将培养皿倒置于37℃细菌培养箱中，过夜培养。

(7)挑取5个阳性克隆菌落摇菌，用P-circIGF1R-F0/R0作引物进行菌落PCR跑胶鉴定，检测是否连接成功。

(8)将连接成功的菌液送去测序，测序成功的菌液进行下一步试验。

②线性circIGF1R连接过表达载体

(1)将上述测序成功的菌液摇菌5mL后提取质粒，提取步骤参

(2)将上述提取的质粒作为模板，使用P-circIGF1R-F1/R1引物进行PCR扩增，反应体系为：2×PCR buffer for KOD FX 25μL，2Nm dntps 10μL，P-circIGF1R-F1 1.5μL，P-circIGF1R-R1 1.5μL，cDNA 200ng，KOD FX 1μL，补足水至50μL。扩增程序为94℃2min，98℃10s，65℃30s，68℃1min，35个循环，68℃4min。PCR扩增完成后，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，之后按照胶回收试剂盒说明书进行DNA纯化。

(3)双酶切：将PCD2.1-CIR质粒进行双酶切，反应体系为：

(4)同源重组：将上述纯化DNA和双酶切后的质粒进行同源重组，反应体系为：PCD2.1-CIR线性载XμL，线性circIGF1R YμL，5×CE II Buffer 4μL，Exnase II 2μL，补足ddH2O至20μL，X和Y按照下方算法加入：

最适克隆载体使用量(X)＝[0.02×克隆载体碱基对数]ng(0.03pmol)

最适插入片段使用量(Y)＝[0.04×插入片段碱基对数]ng(0.06pmol)

同源重组反应程序为：37℃30min后立即取出置于冰上。

(5)转化：取出50μL DH5α感受态细胞于冰上解冻，待感受态细胞溶解至冰水混合物的状态，加入5μL连接产物，冰浴30min，42℃水浴热激60s，然后快速转移至冰浴2min，加入1mL灭菌LB液体培养基，37℃，200r/min培养1h。涂布器灼烧灭菌，待冷却后，吸取100μL菌液，将菌液均匀涂布到含氨苄青霉素的LB固体培养基上直至菌液吸收，将培养皿倒置于37℃细菌培养箱中，过夜培养。

(6)挑取5个阳性克隆菌落摇菌，用P-circIGF1R-F0/R0作引物进行菌落PCR跑胶鉴定，检测是否连接成功。

(7)将连接成功的菌液送去测序，测序成功的菌液进行扩大培养，之后提取质粒，提取步骤参考

1.2.5肌纤维免疫荧光染色

(1)待猪骨骼肌卫星细胞成肌分化肌管较明显时，PBS漂洗细胞3次，尽量将细胞碎片洗净；

(2)固定：4％多聚甲醛固定细胞30min，PBS漂洗3次，每次洗5min；

(3)透化：使用0.1％Triton X-100通透细胞30min，PBS漂洗3次，每次洗5min；

(4)封闭：2％即用型山羊血清封闭1h；

(5)添加一抗直至覆盖孔底，4℃孵育过夜；

(6)移除一抗后使用PBS清洗3次，加入荧光二抗，室温避光孵育1h

(7)吸出二抗后用PBS清洗3次，每空加入500μL DAPI染液，室温孵育10min；

(8)移除DAPI染液，加入1ml PBS，倒置荧光显微镜拍照。

1.2.6Western Blot

(1)按照1mL RIPA裂解液加入10μL蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的比例配置蛋白裂解液，混匀后置于冰上(现配现用)；

(2)培养完成的细胞，弃培养基，加入预冷的PBS清洗2次，6孔板中加入300μL的蛋白裂解液，冰上裂解30min；

(3)用枪头将细胞刮落并收集到1.5mL离心管中，4℃，12000r/min离心10min，吸取上清至200μL离心管中，做好标记，-80℃保存备用；

(4)提前将玻璃板清洗干净，组装好制胶架；

(5)制分离胶：根据目的蛋白分子量按照凝胶试剂盒说明书制备合适浓度的分离胶，将胶混匀后，马上灌至玻璃板中，灌至胶面距离玻璃板上沿1/4处即可，立即用移液枪吸取无水乙醇加入到分离胶上层压平胶面，静置30min；

(6)制浓缩胶：待分离胶凝固，倒去上层无水乙醇，用滤纸将无水乙醇吸干净，切勿碰到胶面，制备5％浓缩胶，混匀后，立即倒入分离胶上层，垂直插入梳子，静置30min；

(7)蛋白样品变性：将上述准备好的蛋白样品取出，按比例加入5×蛋白上样缓冲液，混匀后离心，置于100℃变性10min，变性完成后短暂离心；

(8)上样：将上述制备好的胶安装至电泳仪上，仔细检查是否安装紧密，将电泳置于电泳槽中加满电泳液，观察电泳仪是否漏液，垂直拔出梳子，按照顺序将样品加入点样孔中；

(9)电泳：80V 30min跑浓缩胶，120V跑分离胶，直至溴酚蓝跑至胶底为止；

(10)转模：将电泳完的胶带玻璃板冲洗，提前在转膜液中浸泡转模器具，比对maker说明切取目的蛋白，切好的胶放置在转模滤纸上，剪取合适大小的硝酸纤维膜(NC膜)放置在含目的蛋白的胶上，排走气泡后，将其放入砖模槽中，将整个转膜槽埋在冰里，90V转模90min，PBST漂洗3次，每次5min；

(11)封闭，提前配制5％封闭奶粉，置于摇床上晃动20min，将NC膜放入封闭液中室温摇床封闭1h。

(12)孵育一抗：抗体稀释液稀释一抗PPARγ(1:1000)、FABP4(1:1000)、MYOD1(1:625)、β-actin(1:5000)，将NC膜放入孵育盒中，加入相应抗体，4℃孵育过夜，室温摇床复温1h，回收一抗，PBST漂洗3次，每次5min。

(13)孵育二抗：抗体稀释液稀释荧光二抗(1:10000)，室温避光摇床孵育1h，回收二抗，PBST漂洗3次，每次5min；

(14)曝光：使用Odyssey CLX近红外扫描系统曝光蛋白条带。

2.实验结果

2.1circIGF1R可促进猪骨骼肌卫星细胞成肌分化

在猪骨骼肌卫星细胞中过表达/干扰circIGF1R。过表达组circIGF1R的表达量显著高于对照组(P<0.01；图1a)。与对照组相比，干扰组circIGF1R的表达量显著降低(P<0.01；图1b)。

过表达/干扰circIGF1R后诱导猪骨骼肌卫星细胞分化，成肌分化8d后收集细胞。qRT-PCR结果显示，circIGF1R过表达后MyoD、MyoG、MyHC和Myf5 mRNA水平显著升高(P<0.01；图1c)。Western blot结果显示，过表达circIGF1R后，MyoD蛋白表达也显著增加。免疫荧光结果显示，过表达组细胞肌管数量高于对照组，肌管更粗(图1g)。circIGF1R干扰结果相反(图1d,图1f,图1h)。以上结果表明，circIGF1R可促进猪骨骼肌卫星细胞的成肌分化。

2.2circIGF1R对猪骨骼肌卫星细胞增殖无影响

在猪骨骼肌卫星细胞中过表达/干扰circIGF1R后，处理组与对照组增殖相关基因表达水平无显著差异(P>0.05，图2a,图2b)。CCK8结果显示，处理组与对照组增殖期细胞数量无显著差异(P>0.05，图2c,图2d)，EdU也得到相同的结果(图2e,图2f)。以上结果表明，circIGF1R对猪骨骼肌卫星细胞的增殖没有影响。

实施例2circIGF1R通过miR-16调控卫星细胞成肌分化

circRNA可通过ceRNA调控细胞成脂分化及成肌分化。已知microRNA可以通过结合mRNA导致基因沉默，而circRNA可以通过竞争性地结合microRNA来调节基因表达。

从实施例1可知，circIGF1R可促进猪骨骼肌卫星细胞的成肌分化，本实施例通过双荧光素酶报告基因和RNA结合蛋白免疫沉淀试验验证circIGF1R与miR-16的结合关系，探究circIGF1R调控细胞成肌分化的机制。

1.材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验细胞及试验试剂

试验细胞同实施例1，HEK293T细胞和C2C12细胞购自上海盖宁生物。

Protein A/G Magnetic Beads购自MCE；Anti-AGO2 Antibody、10％SDS、蛋白酶K、IP细胞裂解液购自博士德；Rabbit Control IgG购自abclonal；异戊醇、苯酚、Tris-HCL购自索莱宝；

1.1.2试验试剂配制

RIP buffer(25mL)：Tris-HCL 0.5ml、NaCl 219.15mg、MgCl

1.1.3试验仪器

实时荧光定量PCR仪(ABI 7500，AB，美国)；核酸蛋白测定仪(ND-1000，Nanodrop，美国)；电泳仪(DYCP-31，六一生物，北京)；凝胶成像系统(GelDoc XR Biorad，Bio-Rad，美国)；低温高速离心机(Eppendorf)

1.2试验方法

1.2.1细胞培养

猪骨骼肌卫星细胞培养方法同实施例1。

1.2.2RNA提取及qRT-PCR

操作步骤同实施例1。引物使用premier 6设计，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列见表1。表3为miR-16的引物序列。猪基因表达量以18S rRNA为内参，鼠基因表达量以β-actin为内参，采用2

表3 miR-16的引物序列

1.2.3双荧光素酶报告基因试验

构建circRNA的野生型及突变型psiCHECK-2载体，待24孔板内HEK293T细胞长至50％左右转染，分组为miR-16mimics+circIGF1R-Mut；mimics+circIGF1R-Wt；miR-16NC+circIGF1R-Wt，每组做3个重复，转染48h后，弃培养基，1×PBS清洗细胞2次，操作步骤参考Duo-Lite Luciferase Assay System试剂盒。

1.2.4RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)

①准备样品

(1)待细胞长至90％左右使用胰酶将细胞消化至离心管中，将细胞分成均等的两份，使用不添加双抗的完全培养基将NC和miR-16的mimics电穿孔转染至细胞中，将转染后的细胞分别铺至10cm细胞培养皿中；

(2)48h后将细胞用胰酶消化后收集至无酶管中，4℃，1500r/min离心5min，弃上清，用PBS清洗2次；

(3)加入1.1mL IP裂解液buffer(使用前加入蛋白酶抑制剂及RNase抑制剂)，吹打均匀后与4℃翻转裂解2h；

(4)4℃，12000r/min离心15min，转以上清至新的1.5mL无酶EP管中，取100μL细胞裂解液与另一无酶EP管中，作为input组，放于-80℃待用。

①准备磁珠

(1)将磁珠上下轻微颠倒混匀；

(2)分别取30μL磁珠悬液于标记好的AGO2组及IgG组的无酶1.5mL EP管中；

(3)于每管中加入500μL RIP buffer,轻微上下颠倒混匀清洗磁珠，3000r/min离心1min，去上清，重复清洗2次后去上清；

②RNA结合蛋白免疫沉淀

(1)上一步准备好的磁珠中加入500μl RIP buffer重悬磁珠，加入5μg相应抗体于对应的EP管中，封口膜封口后与4℃翻转过夜孵育；

(2)取出过夜孵育的磁珠-抗体复合物，加入500μl RIP buffer，混匀后4℃，3000r/min离心1min，去上清，重复一次；

(3)加入500μL细胞裂解液于磁珠-抗体复合物中，4℃孵育9h；

(4)4℃，3000r/min离心1min后弃上清；

(5)加入1mL RIP buffer，上下颠倒混匀，4℃，3000r/min离心1min，弃上清，重复5次。

③RNA纯化

(1)于AGO2组、IgG组、input组中加入117μL RIP buffer、15μL10％SDS及4.5μLProteinase K，于65℃孵育45min；

(2)4℃，3000r/min离心1min，取上清于新EP管中；

(3)无酶水补足200μL，加入20μL 3M乙酸钠及2倍体积苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，漩涡震荡充分混匀，4℃，12000r/min离心2min；

(4)转移上清至新的EP管，加入2倍体积氯仿：异戊醇(24：1)，漩涡震荡充分混匀，室温静置5min，4℃，12000r/min离心10min；

(5)小心吸取上层水相与新的EP管中；

(6)加入3倍体积无水乙醇和2μL糖原，置于-20℃沉淀过夜

(7)4℃，12000r/min离心15min，小心去上清；

(8)加入1mL预冷的75％乙醇上下轻微颠倒清洗沉淀，4℃，12000r/min离心10min，去上清，室温倒扣静置晾干，加入20μL无酶水溶解沉淀得到RNA。

1.2.5肌纤维免疫荧光染色

具体操作同实施例1。

2.结果与分析

2.1circIGF1R可充当miR-16海绵

随着猪骨骼肌日龄的增加(图3a)，以及卫星细胞成肌细胞分化过程中分化天数的增加(图3c)，circIGF1R呈上升趋势。随着日龄和分化天数的增加，miR-16呈下降趋势(图3b和图3d)。因此，miR-16的表达趋势与circIGF1R相反。另外，在猪骨骼肌卫星细胞中过表达circIGF1R可显著降低miR-16的表达(P<0.01，图3e)，而干扰circIGF1R显著增加miR-16的表达(P<0.01，图3f)。因此，circIGF1R与miR-16可能是负调控的关系。

RNAhybrid软件预测发现miR-16的种子序列可以通过碱基互补配对与circIGF1R形成二级结构，最小结合自由能为-24.2kcal/mol，具有较强的结合能力(图3g)。根据circIGF1R与miR-16的结合位点构建psiCHECK2-circIGF1R-Wt和psiCHECK2-circIGF1R-Mut载体(图3h)。双荧光素酶报告基因实验结果显示，与转染psiCHECK2-circIGF1R-Wt和miR-16mimics相比，转染psiCHECK2-circIGF1R-Mut和miR-16mimics后，荧光素酶活性明显降低。与psiCHECK2-circIGF1R-Wt和mimicsNC共转染相比，荧光素活性也显著降低(P<0.05，图3i)。由此说明circIGF1R与miR-16之间确实存在结合作用。

此外，RIP检测结果显示，与IgG抗体组相比，AGO2抗体组能富集更多的miR-16和circIGF1R，这表明miR-16和circIGF1R均能与AGO2结合，可能通过竞争性内源性(ceRNA)机制发挥作用。转染miR-16mimics(正义链:5′-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3′；反义链:5′-CCAAUAUUUACGUGCUGCUAUU-3′)后，AGO2抗体组miR-16表达水平明显高于mimics NC组(P<0.01，图3j)。此外，miR-16mimic转染组AGO2抗体富集circIGF1R明显高于mimics NC组(P<0.01，图3j)。这些结果进一步表明circIGF1R可以作为miR-16的海绵。

2.2CircIGF1R可促进C2C12细胞的成肌分化

同源性分析表明circIGF1R在物种间具有高度的保守性。猪circIGF1R序列与小鼠circIGF1R序列同源性达94％(图4a)，与人类circIGF1R序列同源性达93％(图4b)。

在C2C12细胞中转染猪circIGF1R，过表达效率如图5a所示，可用于后续实验。过表达circIGF1R后诱导C2C12细胞分化，成肌细胞分化8d后收集细胞。结果显示，过表达circIGF1R后，成肌相关因子mRNA表达(P<0.01，图5c)，MyoD蛋白表达(P<0.05，图5e)，肌纤维数量(图5g)显著增加。

在C2C12细胞中转染si-circIGF1R后，小鼠circIGF1R的表达显著降低(P<0.01，图5b)，C2C12细胞成肌分化明显受到抑制(图5d,图5f,图5h)。

这些结果表明猪circIGF1R和小鼠circIGF1R均能促进C2C12细胞的成肌分化。因此circIGF1R在猪骨骼肌卫星细胞和C2C12细胞中具有相同作用。

2.3miR-16抑制C2C12细胞的成肌分化

如图6a所示，miR-16高度保守，在人、小鼠和猪中序列完全相同。此外，在C2C12细胞中过表达猪circIGF1R后，miR-16的表达量显著降低(P<0.01，图6b)。这些结果提示，猪circIGF1R可能通过miR-16调控C2C12细胞成肌细胞分化。

在C2C12细胞中转染miR-16mimics/inhibitor，细胞分化8天后收集细胞。qRT-PCR结果显示，转染miR-16mimics后，MyoD、MyoG、MyHC、Myf5的mRNA水平、MyoD蛋白表达及肌纤维数量均显著降低(图6e，图6g，图6i)。转染miR-16inhibitor(5′-CGCCAAUAUUUACGUGCUGCUA-3′)后结果相反(图6f，图6h，图6j)。由此证明miR-16可抑制C2C12细胞的成肌分化，其作用与circIGF1R相反。这些结果进一步说明circIGF1R可能通过miR-16抑制猪和小鼠成肌的分化。

RNhybird预测发现miR-16的种子序列可以与小鼠circIGF1R结合(图7a)。此外，在C2C12细胞中干扰小鼠circIGF1R后，miR-16表达明显增加(P<0.01，图7b)。这些结果表明，小鼠circIGF1R也可能通过miR-16促进C2C12细胞的成肌分化。关于这部分结论还需要通过大量的实验来验证。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。