寡肽在治疗牙龈发炎、牙龈萎缩及修复口腔黏膜中的用途

技术领域

本发明涉及一种寡肽在治疗牙龈发炎和牙龈萎缩及修复口腔黏膜中的用途。本发明属于医药技术领域。

背景技术

TW I448306 B揭露一种口腔保健组成物，其包含呈游离或盐形式的碱性氨基酸和氟化物离子源。

TW I432206 B揭露一种口腔用组成物，其包含选自红石榴、肉豆蔻、生姜及洋枣中至少3者的萃取物的混合物。

TW 201538729 A揭露一种治疗牙龈损伤的方法，其包含向口腔施予包含经分离的非球根真皮鞘(NDBS)细胞。

TW I631141 B揭露N端和C端经取代的含有6个氨基酸的寡肽于治疗口腔黏膜的用途。

TW 201806602 A揭露一种口腔软组织抗发炎痠痛剂，其包含促肾上腺皮质激素或抗炎抑制化合物。

先前技术未教示或建议未经取代的含有4、5或6个氨基酸的寡肽可用于治疗牙龈发炎和牙龈萎缩且修复口腔黏膜。

发明内容

本发明揭露下式(I)的寡肽(或称胜肽)在制备治疗牙龈发炎、牙龈萎缩及修复口腔黏膜的药剂中的用途：

X

其中

X

X

X

X

X

X

于一较佳实施例中，该式(I)的寡肽为GEKGF(SEQ ID NO.2)及/或GEKG(SEQ IDNO.1)。

于另一较佳实施例中，该式(I)的寡肽为GEKG。

于一较佳实施例中，该式(I)的寡肽为KTTKS(SEQ ID NO.3)及/或KTTKSF(SEQ IDNO.4)。

于另一较佳实施例中，该式(I)的寡肽为KTTKS。

于一较佳实施例中，该式(I)的寡肽为GEKG与KTTKS的组合。

于一较佳实施例中，该药剂包含0.1至10重量％的GEKG和0.1至10重量％的KTTKS及一或多种医药上可接受的载体，其中该药剂较佳地包含0.2至2重量％的GEKG和0.2至2重量％的KTTKS。

于另一较佳实施例中，该一或多种医药上可接受的载体包括固体载剂、半固体载剂及液体载剂，其中该等固体载剂、半固体载剂及液体载剂的种类和用量已为此技术领域所习知。

于一较佳实施例中，该药剂为呈粉末、气溶胶、软膏、凝胶、糊剂或溶液的形式，其中该溶液可呈水溶性缓冲液的形式，其中该水溶性缓冲液包括但不限于磷酸盐或柠檬酸盐的水溶液。

于一较佳实施例中，该药剂为经口施予，其包括但不限于经黏膜吸收和口服吸收。

于一较佳实施例中，该药剂为缓释型，特别是经黏膜吸收和口服吸收缓释型。

于一较佳实施例中，该GEKG和GEKGF及KTTKS和KTTKSF可依据先前技术(诸如TW201129368 A1和TW 201333045 A1)记载的方法进行制备。

为使本领域技术人员能进一步了解本发明的构成、特征及其他目的，以下乃举本发明的若干较佳实施例，并配合图式详细说明如后，同时让本领域技术人员能够具体实施。

附图说明

图1显示不同稀释倍数的KTTKS的L929细胞分析肿瘤坏死因子-alpha(TNFα)抑制率和细胞毒性。

图2显示不同稀释倍数的GEKG的L929细胞分析TNFα抑制率和细胞毒性。

图3显示KTTKS抑制发炎反应诱导物(LPS)诱导巨噬细胞产生一氧化氮(NO)。

图4显示GEKG抑制发炎反应诱导物(LPS)诱导巨噬细胞产生NO。

图5显示GEKG和KTTKS抑制发炎反应诱导物(LPS)诱导巨噬细胞产生过氧化氢(H

图6显示不同浓度的GEKG和KTTKS促进口腔上皮初始细胞的増生。

图7显示不同浓度的GEKG和KTTKS活体外降低H2O2自由基造成的口腔上皮细胞死亡。

图8A显示不同浓度的GEKG和KTTKS对于活体外人类牙龈成纤维母细胞(HGF)的增生的影响。

图8B显示不同浓度的GEKG和KTTKS对于活体外I型胶原蛋白的生成的影响。

图9A显示RT-PCR产物TGF-β1和GAPDH的凝胶电泳图。

图9B显示不同浓度的GEKG和KTTKS促进TGF-β1的表达且存有剂量依循性关系。

图10显示TGF-β1与KTTKS或GEKG诱导人类牙龈成纤维母细胞(HGF)合成细胞外基质(ECM)。

图11显示使用包含KTTKS或GEKG的牙龈修护液后的牙龈增生的照片。

具体实施方式

本发明为一种寡肽于治疗牙龈发炎和牙龈萎缩及修复口腔黏膜的用途，以下藉由特定的具体实施形态说明本发明的技术内容，使本领域技术人员可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的优点与功效。然本发明亦可藉由其他不同的具体实施形态加以施行或应用。

实施例1.通过活体外L929细胞增生/细胞毒性分析评估GEKG和KTTKS的TNFα抑制活性及细胞毒性

活体外L929细胞增生/细胞毒性分析在微量滴定盘上进行。于含有10％牛血清、1％P/S及1％非必需氨基酸的Eagle氏最低基本培养基(EMEM)中培养L929细胞。利用2mlPBS溶液冲洗汇合的L929细胞并经胰蛋白酶处理，随后再悬浮于EMEM中。抽气吸取200μl细胞悬浮液以进行计数细胞密度，并于1500rpm下离心其余的悬浮液达5分钟。除去上清液并将EMEM加入至该稀释细胞以形成最终浓度1.5x 10

TNFα抑制活性

将GEKG和KTTKS分别先以1×PBS回溶至浓度相当于1mg GEKG/ml和1mgKTTKS/ml，再以1×PBS溶液分别稀释GEKG和KTTKS至浓度分别为500、125、31.25及7.81μg/ml，经稀释的溶液再与等体积的TNFα溶液混合，孵温1h，取此4种混合溶液各50μl加入至上述培养L929细胞24小时的96孔槽平底微滴量盘，并调整培养液中放线菌素D(ActD)的终浓度为2μg/ml和TNFα的终浓度为0.1ng/ml。分别以只加入2μg/ml ActD和0.1ng/ml TNFα的测试孔槽作为阳性对照组和空白对照组。上述96孔槽平底微滴量盘置于37℃和5％CO

细胞毒性

将GEKG和KTTKS分别先以1×PBS回溶至浓度相当于1mg GEKG/ml和1mgKTTKS/ml，再以1×PBS溶液分别稀释GEKG和KTTKS至浓度分别为500、125、31.25及7.81μg/ml，取此4种稀释溶液各50μl加入至上述培养L929细胞24小时的96孔槽平底微滴量盘，并调整培养液中ActD的终浓度为2μg/ml。上述96孔槽平底微滴量盘置于37℃和5％CO

结果

表1显示不同稀释倍数的KTTKS的L929细胞分析结果。KTTKS的TNFα抑制率为179.4％，表示KTTKS显现优异的TNFα抑制作用且无细胞毒性，如图1。

表1

表2显示不同稀释倍数的GEKG的L929细胞分析结果。GEKG的TNFα抑制率为182.3％，表示GEKG显现优异的TNFα抑制作用且无细胞毒性，如图2。

表2

实施例2.通过活体外抑制发炎反应诱导物(LPS)诱导产生的一氧化氮(NO)(巨噬细胞实验模型)评估GEKG和KTTKS捕捉NO自由基的能力(抗发炎作用)

通过已知的发炎反应诱导物(LPS)诱导巨噬细胞产生NO的实验模型，活体外评估GEKG和KTTKS的抗发炎能力。

KTTKS和GEKG的实验结果分别示于图3和4。证实KTTKS和GEKG均能抑制LPS引起的NO生成(即抗发炎作用)且显示存有药物剂量依循性(dose-dependent)关系。

实施例3.通过活体外发炎反应诱导物(LPS)诱导产生的过氧化氢(H

通过已知的发炎反应诱导物(LPS)诱导巨噬细胞产生H2O2的实验模型，活体外评估GEKG和KTTKS的抗发炎型氧化压力能力。

在待测样品中加入具有细胞膜穿透性的dichlorofluorescin diacetate(DCFH-DA)，当DCFH-DA进入细胞后，会与细胞内的H2O2产生裂解与氢化反应(cleaved andoxidized)，而形成带有绿色荧光的DCF产物，其波长在488～530nm下侦测到胜肽GEKG和KTTKS可抑制LPS诱导产生的自由基H2O2，随着胜肽浓度提高，可明显降低细胞受到LPS刺激所释放出自由基(H2O2)的浓度。KTTKS和GEKG的实验结果示于图5。证实KTTKS和GEKG均能抑制LPS引起的H

实施例4.促进口腔上皮初始细胞的增生的评估

图6显示不同浓度的GEKG和KTTKS能促进活体外口腔上皮初始细胞的增生且显示存有药物剂量依循性关系。证实GEKG和KTTKS能用于口腔黏膜伤口的愈合。

实施例5.抗自由基/发炎反应诱导的口腔上皮初始细胞死亡的评估

图7显示不同浓度的GEKG和KTTKS能活体外降低H

实施例6.促进人类牙龈成纤维母细胞(HGF)的增生和I型胶原蛋白的生成的评估

图8A显示不同浓度的GEKG和KTTKS对于活体外HGF的增生无显著影响。

于图8B中，RT-PCR产物的凝胶电泳图显示GAPDH和I型胶原蛋白的DNA带分别在467bp和409bp位置，表示GEKG和KTTKS在转录上刺激I型胶原蛋白基因的表达，且于人类牙龈成纤维母细胞中可观察到I型胶原蛋白形成，且该I型胶原蛋白的表达量与GEKG和KTTKS的浓度为0至40μl时存有剂量依循性关系。

证实GEKG和KTTKS增生牙龈I型胶原蛋白的作用不是藉由增生人类牙龈成纤维母细胞的数量而是藉由刺激或活化人类牙龈成纤维母细胞以增生I型胶原蛋白所达成。

实施例7.促进人类牙龈成纤维母细胞(HGF)的TGF-β1的基因表达的评估

已知TGF-β1能调节牙龈纤维母细胞和成骨细胞的增生并促进细胞外基质(ECM)及I型和III型胶原蛋白的合成。

活体外促进人类HGF的TGF-β1的基因表达

于图9A中，RT-PCR产物的凝胶电泳图显示GAPDH和TGF-β1的DNA带分别在467bp和161bp位置，表示GEKG和KTTKS在转录上刺激TGF-β1基因的表达。

图9B显示TGF-β1的表达量与GEKG和KTTKS的浓度存有剂量依循性关系。

证实GEKG和KTTKS可藉由刺激人类HGF以促进TGF-β1的表达。

以TGF-β1诱导人类HGF合成细胞外基质

使用单独TGF-β1(0.5或5ng/ml)或同时KTTKS或GEKG(50μM)处理人类HGF以确认KTTKS和GEKG与已知的细胞外基质合成刺激因子TGF-β1是否具有合成细胞外基质的协同作用。

令人类HGF在含有0.2％血清的良伊格尔氏培养基(DMEM)中预培养24小时，并以3种TGFβ1浓度(0、0.5及5ng/ml)处理24小时，且以不存在(实线)或存在50μM KTTKS或GEKG(虚线)的情况下继续培养24小时。

图10分别显示以不存在(实线)或存在50μM KTTKS或GEKG(虚线)的情况下被合成的胶原量及纤维蛋白量。

证实TGFβ1与KTTKS和GEKG是通过独立机制以上调ECM的生物合成，且KTTKS和GEKG诱导人类HGF合成ECM的能力超过TGFβ1。另一可能机制是TGFβ1与KTTKS或GEKG协同增加ECM生物合成。

实施例8.包含KTTKS或GEKG的牙龈修护液的制备和于牙龈增生的功效依据下表3记载的成分和配量制备牙龈修护液。

表3

称取去离子水至乳化锅，保持该乳化锅温度于20℃，依次投入称量的EDTA.2Na、苯甲酸钠及柠檬酸，开启搅拌器溶解均匀，依次再投入甘油和山梨糖醇，持续搅拌均匀，将薄荷精油和PEG-40氢化蓖麻油混合后投入该乳化锅，并搅拌均匀，最后投入KTTKS和GEKG且搅拌均匀。

该牙龈修护液的使用方式为每日施予2次，每次施予约5至6ml且口含约10至15分钟后吐出。

图11显示未经治疗前的A齿牙龈呈现明显萎缩；经使用该牙龈修护液后1个月，该A齿牙龈不再萎缩且呈现增长，并经使用该牙龈修护液后6个月，该A齿牙龈呈现明显增长且牙间隙缩小。

证实该牙龈修护液具有刺激已萎缩的牙龈增生的功能。

藉此，本发明除了能够有效解决现有技术中存在的问题，更能大幅增进功效，且在相同的技术领域中未见相同或近似的产品创作或公开使用，同时具有功效的增进。

序列表

<110> 富比积生物科技股份有限公司

<120> 寡肽在治疗牙龈发炎和牙龈萎缩及修复口腔黏膜中的用途

<160> 4

<170> PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 4

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 1

Gly Glu Lys Gly

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 2

Gly Glu Lys Gly Phe

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 3

Lys Thr Thr Lys Ser

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 4

Lys Thr Thr Lys Ser Phe