唾液素salivaricin在制备IL-21受体抑制剂中的应用

技术领域

本发明属于IL-21受体抑制剂技术领域，具体涉及唾液素salivaricin在制备IL-21受体抑制剂中的应用。

背景技术

唾液素(salivaricin)是一种细菌素，即细菌分泌的抗菌肽。唾液链球菌K12可分泌salivaricinA2和B，编码二者的基因位于一个190kp的大质粒上，经细菌核糖体合成后，通过翻译后修饰形成最终含有22-25个氨基酸的多肽结构。唾液素属于羊毛硫氨酸抗生素，具有抑菌作用，可通过结合病原菌的脂质体II而干扰细菌细胞壁的合成，抗菌谱较窄，可靶向杀死特定细菌，是解决抗生素滥用危机最理想和最有希望的工具。

salivaricin A2和B可抑制致病性链球菌的增值，如化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)，停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)，变形链球菌(Streptococcus mutans)等。除了抗菌作用，细菌素的免疫调节活性也逐渐受到关注。有研究显示乳链菌肽Nisin(经典细菌素之一)对人体外周血淋巴细胞具有调控作用，可抑制其分泌促炎因子。唾液链球菌K12也具有免疫调节活性，可通过阻断NF-κB信号通路而抑制炎性介质的表达，进而缓解支气管上皮、喉上皮以及肠上皮细胞的炎症反应。而且，研究者认为唾液链球菌K12发挥免疫调节作用很可能依赖于其分泌的细菌素salivaricinA2和B。然而，唾液素salivaricin是否具有免疫调节作用尚未见报道，值得深入研究。

此外，IL-21及其受体在自身免疫病的发病机制中发挥关键作用，靶向IL-21或其受体的小分子抑制剂(如TNFR2-IL21R融合蛋白)已被证明可有效治疗自身免疫病如类风湿关节炎。然而，目前现有的IL-21受体抑制剂虽然可有效抑制自身免疫反应，但也使得感染风险大大增加，因此需要开发新型的IL-21受体抑制剂。

发明内容

本发明的目的在于提供唾液素salivaricin在制备IL-21受体抑制剂中的应用，所述唾液素salivaricin可直接与IL-21受体(IL-21R)结合，并抑制细胞因子IL-21与其受体(IL-21R)的结合。

本发明提供了唾液素salivaricin在制备IL-21受体抑制剂中的应用。

优选的，所述唾液素salivaricin包括salivaricinA2和/或salivaricinB。

优选的，所述salivaricinA2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述salivaricin B的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了唾液素salivaricin在制备IL-21/IL-21R信号通路阻断剂中的应用。

本发明还提供了唾液素salivaricin在制备诱导IL-21受体构象发生改变的试剂中的应用。

有益效果：本发明提供了唾液素salivaricin在制备IL-21受体抑制剂中的应用，实施例中本发明运用体外实验体系，使用表面等离子体共振(Surface PlasmonResonance)技术发现唾液素salivaricin可直接与IL-21受体(IL-21R)结合，并抑制细胞因子IL-21与其受体(IL-21R)的结合。同时，还基于圆二色技术发现salivaricin可诱导IL-21受体构象发生改变。由于受体构象对其结合力有决定作用，IL-21受体构象改变可能抑制了IL-21与受体的结合。本发明还运用T细胞体外分化体系，发现唾液素salivaricin可通过阻断IL-21/IL-21R信号通路，抑制异常活化的效应性T细胞。本发明所述唾液素salivaricin可为IL-21受体抑制剂提供原料，还可以从上游途径调节免疫稳态，并应用于治疗免疫炎性疾病。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为唾液素salivaricin的化学合成与纯化及鉴定结果图；

图2为唾液素salivaricin与IL-21受体直接结合的结果图；

图3为唾液素salivaricin阻断IL-21与受体的结合结果图；

图4为唾液素salivaricin诱导IL-21受体构象改变结果图；

图5为唾液素salivaricin特异性抑制Tfh细胞分化和IL-21合成结果图。

具体实施方式

本发明提供了唾液素salivaricin在制备IL-21受体抑制剂中的应用。

本发明所述唾液素salivaricin优选包括salivaricinA2和/或salivaricinB，且所述salivaricin A2的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.1所示：KRGTGWFATITDDCPNSVFVCC；所述salivaricin B的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.2所示：GGGVIQTISHECRMNSWQFLFTCCS。

本发明对所述唾液素salivaricin的来源并没有特殊限定，优选包括提取自唾液链球菌或直接人工合成，所述提取方法优选参考中国专利CN109675017A。本发明对人工合成的方法并没有特殊限定，经纯化后纯度＞98％，且符合科学研究的要求即可。

本发明实施例中，运用体外实验体系，使用表面等离子体共振(Surface PlasmonResonance)技术发现唾液素salivaricinA2或salivaricin B均可直接与IL-21受体结合，并抑制细胞因子IL-21与其受体的结合，继而阻断IL-21受体信号通路，因此可将唾液素salivaricinA2或salivaricin B作为IL-21受体及其下游信号通路抑制剂。

本发明还提供了唾液素salivaricin在制备诱导IL-21受体构象发生改变的试剂中的应用。

本发明实施例中，还利用圆二色谱技术对IL-21受体的二级结构进行检测，发现salivaricinA2或salivaricinB均可诱导IL-21受体构象发生改变。

本发明还提供了唾液素salivaricin在制备IL-21受体及其下游信号通路抑制剂中的应用。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的唾液素salivaricin在制备IL-21受体抑制剂中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1唾液素salivaricin的化学合成与纯化及鉴定

(1)唾液素salivaricin的化学合成：salivaricin A2(KRGTGWFATITDDCPNSVFVCC)和B(GGGVIQTISHECRMNSWQFLFTCCS)均为普通直线多肽，采用固相多肽合成的方法来生产：

①树脂溶涨：将树脂放入反应管中，加DMF(15mL/g)，30min。

②脱保护：去掉DMF，加20％哌啶DMF溶液(15mL/g)，5min，去掉再加20％哌啶DMF溶液(15mL/g)，15min。

③检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮、KCN和苯酚溶液各一滴，105℃～110℃加热5min。

④洗：以此使用DMF(10mL/g)洗两次，甲醇(10mL/g)洗两次，DMF(10mL/g)洗两次。

⑤缩合：保护氨基酸三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入NMM十倍过量，反应30min。

⑥洗：依次使用DMF(10mL/g)洗一次，甲醇(10mL/g)洗两次，DMF(10mL/g)洗两次。

⑦重复上述操作步骤⑥一次。最后一次洗涤：DMF(10mL/g)两次，甲醇(10mL/g)两次，DMF(10mL/g)两次，DCM(10mL/g)两次。

⑧裂解：配制裂解液(10/g)TFA94.5％；水2.5％；EDT 2.5％；TIS 1％120min。

⑨吹干洗涤：将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干。

⑩切割及后处理：使用切割液(TFA/TIS/EDT/H

(2)唾液素salivaricin的纯化：先用水溶解，如果水溶性不好加入乙腈，不能太多，必要时可以加乙二胺，醋酸等。一般用反相C8柱，流动相为含0.1％TFA水和乙腈，梯度为20％～80％。

(3)唾液素salivaricin的鉴定：使用高效液相色谱仪(HPLC)对多肽的纯度和分子量进行鉴定，具体方法如下：

配置HPLC流动相：A:0.1％TFA+100％ACN(乙腈)，B:0.1％TFA+100％Water。HPLC的波长选择是220nm，梯度设置，A项是30％，B项是70％。梯度设置好之后，让机器运行进行机械的平衡，跑梯度跑平衡；用毛细管取少量的样品，溶解在0.5mL的离心管中，选用合适的溶解试剂(一般直接用水溶解)，可用超声波超声震荡至澄清；吸取10μL或者20μL的样品进行测试，跑样大概25～30分钟。

使用化学合成的方法获取salivaricinA2和B，使用高效液相色谱仪(HPLC)对纯化的salivaricin进行分子量和纯度鉴定，结果如图1所示，salivaricinA2的分子量为2420.77(图1中A)，salivaricinB的分子量为2805.23(图1中B)，二者的纯度均>98％。此外，毒素含量检测结果显示，salivaricinA2和B的内毒素的含量均<5EU/mg(图1)，符合科学研究的要求。

实施例2唾液素salivaricin与IL-21受体直接结合

实施方法：

使用表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)的方法检测唾液素与IL-21受体的结合力，使用仪器为Biacore 8K(GE Healthcare)。具体操作步骤如下：使用pH4.5的醋酸缓冲液溶解将人或小鼠的IL-21受体(IL-21R，Sino Biological，20nM)，并将其固定在CM5芯片上，条件为25℃，缓冲液为PBS-P(GE Healthcare)。将salivaricinA2或B配置成含5％DMSO的溶液，浓度为6.25、12.5、25、50、100、200、400、600和800Μm(图2中线条自下而上浓度依次增加)，阴性对照肽为二者的反向合成多肽(NA，SEQ ID NO.3:CCVFVSNPCDDTITAFWGTGRK和NB，SEQ ID NO.4:SCCTFLFQWSNMRCEHSITQIVGGG)，配置浓度为12.5、25、50、100、200和400μM。将上述配置好的溶液依次加入机器通道，机器自动运行检测不同浓度溶液与受体的结合强度。亲和力使用解离常数(Dissociation Constants，KD)来表示，分析软件为Biacore 8K Evaluation Software。

使用SPR的方法检测salivaricin与IL-21受体(IL-21R)的结合力，结果如图2所示，唾液素salivaricn可特异性结合IL-21受体。具体的：salivaricinA2和B与小鼠IL-21R的结合力分别为12.6μM和10.1μM，而阴性对照肽NA和NB与小鼠IL-21R无结合(图2中A)。SalivaricinA2和B与人IL-21R的结合力分别为212μM和167μM，而阴性对照肽NA和NB与人IL-21R也无结合(图2中B)。

实施例3唾液素salivaricin阻断细胞因子IL-21与其受体的结合

使用SPR的方法检测唾液素salivaricin对IL-21与其受体结合力的影响，仪器型号为Biacore 8K(GE Healthcare)，使用竞争性实验模式。IL-21受体固定方法同上，缓冲液为PBS-P(GE Healthcare)，将不同浓度的salivaricin(100、200和400μM)加入缓冲液中，检测基于不同浓度salivaricin存在的条件下，IL-21(Sino Biological，1nM)与IL-21R(SinoBiological，20nM)的结合力。

使用SPR的竞争性实验模式检测唾液素salivaricin对细胞因子IL-21与受体(IL-21R)结合力的影响，结果如图3所示，唾液素salivaricin阻断IL-21与IL-21受体结合的效应具有浓度依赖性，salivaricin的浓度越大，抑制效果越明显。并且，salivaricin可完全阻断小鼠IL-21与其受体的结合。具体的：

salivaricin可降低小鼠IL-21与其受体(murine IL-21R)的亲和力，当缓冲液中无salivaricin时，小鼠IL-21与IL-21R的最高反应性为26.34U，而当缓冲液中含有salivaricinA2(100-400μM)时，小鼠IL-21与IL-21R的反应性降为0(图3中A)；当缓冲液中含有100μM salivaricin B时，小鼠IL-21与受体的最高反应性降为6U，而200或400μMsalivaricinB则可使小鼠IL-21与其受体的反应性降为0(图3中A)。类似地，salivaricin也可降低人IL-21与其受体(human IL-21R)的亲和力，当缓冲液中无salivaricin时，人IL-21与IL-21R的最高反应性为21.58U，而当缓冲液中含有100μM salivaricinA2时，小鼠IL-21与IL-21R的最高反应性降为6.88U，而200或400μM salivaricinA2则使人IL-21与IL-21R的反应性降为接近0(图3中B)；当缓冲液中含有salivaricin B时，人IL-21与IL-21R的反应性降为3.71～0U(图3中B)。

实施例4唾液素salivaricin诱导IL-21受体构象改变

使用圆二色谱(Circulardichroism spectroscopy)仪(ChirascanV100，Jasco，Easton，MD,USA)检测不同缓冲体系下IL-21受体的二级结构，工作温度为室温(25℃)。将salivaricinA2或B配置成浓度为10mg/mL的溶液，IL-21(Sino Biological)和IL-21R(SinoBiological)的浓度为1mg/mL。缓冲液为纯水，终体积为100μL。将检测样本加入1.0mm直径的石英小皿(Hellma UK)中，采集波长为180～260nm，频宽(bandwidth)为1nm，检测样本有：IL-21R(0.1mg/ml)，IL-21R(0.1mg/ml)+IL-21(0.1mg/ml)，IL-21R(0.1mg/ml)+salivaricinA2(10mg/ml)或B(10mg/ml)，IL-21R(0.1mg/ml)+IL-21(0.1mg/ml)+salivaricinA2(10mg/ml)或B(10mg/ml)。圆二色谱的分析软件为CDNN v2.1。

使用圆二色谱仪检测不同条件下IL-21受体(IL-21R)的二级结构如Helix、Antiparallel、Parallel、Beta-Turn和Rndm.Coil的比例。IL-21与IL-21R结合后，IL-21R的各种二级结构的比例均无变化(图4中A)，表明受体的构象无明显改变；而salivaricinA2或B与IL-21R结合后，受体的二级结构比例发生了改变，主要表现为Helix减少，从12.34％减少为1.48％(salivaricin A2)或0.071％(salivaricin B)(图4中B和C)。并且，当salivaricinA2或B与IL-21共孵育时，IL-21R的二级结构也有明显改变，也是主要表现为Helix减少，从13.67％减少为0.15％(salivaricinA2)或5.66％(salivaricinB)(图4中B和C)。

实施例5唾液素salivaricin特异性抑制Tfh细胞分化和IL-21合成

实施方法：

(1)T细胞体外分化：分离小鼠淋巴结细胞，流式分选

T细胞亚群分化条件如下：

Tfh-like(20ng/mL IL-6+20ng/mL IL-21+10μg/mL anti-IFNγ+10μg/mL anti-IL-4)；

Th17(20ng/mL IL-6+50ng/mL IL-23+2ng/mL TGF-β+10μg/mL anti-IFNγ+10μg/mL anti-IL-4)；

Th1(1ng/mL IL-12+10ng/mL IL-210ug/mL+anti-IL-4)；

Treg(0.1ng/mL TGF-β+5ng/mL IL-2)。

(2)荧光定量PCR检测基因表达：使用RNA提取试剂盒(RNAprep Pure Micro Kit,TIANGEN Biotech Co.,Ltd)提取细胞总RNA。使用寡核苷酸(Oligonucleotide,Invitrogen)，拟转录酶(Revertaid reverse transcriptase,Invitrogen)和核糖核酸酶抑制剂(RiboLock RNase Inhibitor，Invitrogen)反转录出cDNA。基因表达使用AceQ qPCRSYBR Green MasterMix(Vazyme Biotech)进行检测。内参基因为Actb。引物序列如表1所示：

表1引物序列

(3)ELISA检测细胞因子表达：收集细胞培养上清，遵照ELISA试剂盒(MultiScience，Shanghai，China)说明书进行操作，即配置标准品，样本稀释，一抗孵育，洗板，二抗孵育，洗板，显色，读取数值，结果分析。

(4)流式细胞术检测淋巴细胞亚群比例：制备单细胞悬液，加流式抗体(BioLegend，San Diego，CA，USA)进行染色，洗涤重悬后上流式机(BD FACSAria

在Tfh-like细胞分化的条件下，与Tfh细胞分化相关的特异性标记的mRNA表达量降低，表明salivaricin可抑制Tfh细胞的分化：唾液素salivaricinA2处理组Bcl6，cxcr5和il21三个基因mRNA的表达分别减少了25～58％，26～59％和15～76％，而salivaricin B处理组三个基因mRNA的表达分别减少了40～59％，35～41％和28～71％(图5中A-C)。此外，Tfh-like细胞中IL-21的表达在salivaricin A2处理组减少了67～98％，而salivaricin B处理组IL-21的表达减少了46～87％(图5中D)，表明salivaricin可抑制Tfh细胞分泌IL-21的功能。然而，在Th17细胞分化的条件下，salivaricin对Th17细胞的比例无明显影响(图5中E)。同样，在Th1和Treg细胞分化的条件下，salivaricin对Th1和Treg的比例无明显影响(图5中F和图5中G)。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。