提高孕妇外周血中胎儿游离DNA浓度的方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种提高孕妇外周血中胎儿游离DNA浓度的方法及其应 用，更具体地，涉及一种低甲基化DNA的变性方法、PCR扩增方法、富集DNA的方法以及构建DNA 测序文库的方法。

背景技术

1997年，Lo等利用实时定量PCR的方法从孕妇血浆的总游离DNA中成功扩增出男性胎儿的Y染 色体特异性序列(SRY基因序列)，首次证实胎儿DNA可以进入母体外周血循环，并以游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)的形式稳定存在。孕妇外周血中胎儿游离DNA(cell-free fetal DNA,cffDNA)的发现为 无创产前诊断(NIPT)的发展和推广奠定了坚实基础。大量研究和实践表明，无创产前检测在21、13、 18号染色体的非整倍体和性染色体异常的检测中具有较高的敏感性和特异性。此外，NIPT还可用于检 测胎儿的微缺失和微重复综合征，以及胎儿单基因病，但灵敏度只有70％～90％，检出率有待提高。

胎儿游离DNA浓度(fetal fraction,FF)，即胎儿游离DNA占母体血中所有游离DNA的比例，是 影响这些疾病检出率的重要因素。通常情况下母血中的胎儿游离DNA含量非常低，加上母体和样本差 异、实验误差、样本质量的影响，极大地影响了检出率。如果胎儿游离DNA浓度低于4％，会受到大量 的母体正常整倍体DNA背景影响而增加假阴性的风险。提高高通量检测时胎儿游离DNA浓度已经被 证明可提升NIPT对非整倍体异常和微缺失微重复的检测效能，降低假阴性率。同时还可减少后续高通 量测序所需的数据量，有利于降低成本。

目前NIPT中使用的游离DNA的富集方法主要是基于胎儿和母体游离DNA的片段长短分布差异， 因为母亲来源的cfDNA峰值在164bp，而胎儿来源的cfDNA峰值在144bp，这20bp的差异使得选择性 回收和富集短片段可以提高胎儿游离DNA的浓度。主要方法有以下两种：(1)电泳法：DNA文库建 好之后，可以通过琼脂糖电泳和切胶回收来富集短片段。(2)磁珠富集：通过调整吸附时的反应体系， 选择性地用磁珠吸附较短的游离DNA片段。由于胎儿和母体游离DNA的峰值只有20bp，且片段长度 分布区域存在大量重叠，故基于片段大小的富集很难精准区分胎儿和母体游离DNA。利用电泳法富集 胎儿DNA短片段时，由于DNA大小较难精准判断，实验可重复性差，容易交叉污染，难以实现大样 本量的自动化；磁珠法精确度低，磁珠用量大，成本高。鉴于富集胎儿游离DNA浓度的如上方法都是 基于富集短片段的原理，存在步骤繁琐、价格昂贵等诸多问题，亟需一种基于全新原理和更简便、低廉 的方法来实现对胎儿游离DNA的富集，同时有必要对不同原理的富集方法进行整合和改进，以进一步 提高富集效率。

发明内容

本申请是基于发明人对以下问题的发现和认识作出的：

多项研究表明胎儿游离DNA的整体甲基化水平与母体游离DNA相比较低，结合低甲基化DNA的 解链温度较低的特性，因此，发明人提出假设并且通过大量实验证实，通过仅降低PCR扩增过程中的 变性温度来选择性解链和扩增低甲基化的片段，从而达到提高胎儿游离DNA浓度的目的是可行的。同 时，通过将选择性扩增与磁珠双选富集短片段方法进行整合和优化，进一步对胎儿游离DNA进行富集。

因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种低甲基化DNA的变性方法。根据本发明的实施例， 所述方法包括使DNA样本在86℃～95℃下进行第一变性处理；将第一变性处理DNA样本进行第二变性 处理。根据本发明的实施例，孕妇外周血中胎儿游离DNA具有低甲基化的特点，经过大量实验探索， 发明人意外地发现，所述低甲基化DNA的变性温度要低于高甲基化DNA，因此，温度低时可以选择性 的对低甲基化DNA进行变性，发明人创造性的将利用磁珠富集法进行第一次富集后获得的样品再根据 本发明实施例所述的方法进行低甲基化DNA的低温变性处理，结果显示，胎儿游离DNA得到进一步 富集。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，使DNA样本在86℃～95℃下进行2min的第一变性处理。

根据本发明的实施例，第一预变性处理循环1次。

根据本发明的实施例，将第一变性处理DNA样本在86℃～95℃温度下进行第二变性处理。根据本 发明的实施例，所述第二变性处理的条件为86℃～95℃进行15s，所述第二变性处理针对性得使低甲基 化得胎儿游离DNA变性。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种PCR扩增方法。根据本发明的实施例，利用第一方面所述 的方法对DNA模板进行变性处理；将经过变性处理后的DNA依次进行退火、第一延伸处理以及第二 延伸处理，以便对DNA模板进行扩增。孕妇外周血中胎儿游离DNA具有低甲基化的特点，经过大量 实验探索，发明人意外地发现，所述低甲基化DNA的变性温度要低于高甲基化DNA，因此，在进行 PCR扩增时选择合适的低温进行变性，从而选择性的对低甲基化DNA进行变性，发明人创造性的将利 用磁珠富集法进行第一次富集后获得的样品再根据本发明实施例所述的PCR扩增方法进行低甲基化 DNA的低温变性、扩增处理，根据本发明的实施例所述的PCR扩增方法可以选择性、高效的对胎儿游 离DNA进行扩增，从而构建胎儿游离DNA浓度高的DNA测序文库，显著降低NIPT对非整倍体异常 和微缺失微重复检测的假阴性率。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述退火处理是在温度53℃～59℃下进行15s。

根据本发明的实施例，所述第一延伸处理是在温度68℃～75℃下进行30s。

根据本发明的实施例，所述第二变性处理、所述退火处理以及所述第一延伸处理循环进行17次。

根据本发明的实施例，所述第二延伸处理是在温度为68℃～75℃条件下进行5min。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种富集DNA的方法。根据本发明的实施例，利用第二方面 所述的方法对DNA样本进行PCR扩增处理。孕妇外周血中胎儿游离DNA具有低甲基化的特点，经过 大量实验探索，发明人意外地发现，所述低甲基化DNA的变性温度要低于高甲基化DNA，因此，在进 行PCR扩增时选择合适的低温进行变性，从而选择性的对低甲基化DNA进行变性，发明人创造性的将 利用磁珠富集法进行第一次富集后获得的样品再根据本发明实施例所述的PCR扩增方法进行低甲基化 DNA的低温变性、扩增处理，根据本发明的实施例所述的PCR扩增方法可以选择性、高效的对胎儿游 离DNA进行扩增，从而对胎儿游离DNA进行富集。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，进行PCR扩增处理之前，进一步包括对DNA样本进行磁珠纯化处理。根据 本发明实施例的方法，发明人创造性地将磁珠富集纯化与所述低温变性PCR扩增方法进行整合和优化， 利用不同的实验原理对胎儿游离DNA进行富集，从而构建胎儿游离DNA浓度高的DNA测序文库，显 著降低NIPT对非整倍体异常和微缺失微重复检测的假阴性率，提高检测灵敏度和准确性。

根据本发明的实施例，所述DNA样本来源于孕妇外周血基因组DNA。

根据本发明的实施例，将DNA样本与羧基磁珠以1.2：1～1.5：1体积比进行第一混合搅拌处理。根 据本发明实施例所述的DNA样本与羧基磁珠的体积比进行混合搅拌处理可以选择性的去除长度大于 150bp的DNA片段，以有效的对目标胎儿游离DNA进行富集。

根据本发明的实施例，将第一混合搅拌处理后所获得的上清液与羧基磁珠以1：1～1.5：1体积比进 行第二混合搅拌处理。根据本发明的实施例所述的第一混合搅拌处理获得的DNA样本与羧基磁珠的体 积比进行混合搅拌处理后，可以对去除长度大于150bp的DNA片段后的上清液中长度小于100bp的DNA 片段进行去除，筛选出长度为100～150bp的DNA片段，从而有效的对目标胎儿游离DNA进行进一步 富集。

根据本发明的实施例，进行包括对第二混合搅拌处理后弃去上清液的产物进行洗涤和洗脱处理。

根据本发明的实施例，在本发明的第四方面，本发明提出了一种构建DNA测序文库的方法。根据 本发明的实施例，包括利用第三方面所述的方法对DNA样本进行富集处理；将富集处理产物进行建库 处理，以便获得DNA测序文库。根据本发明实施例所述的方法所得胎儿游离DNA浓度与现有方法相 比显著升高，构建的DNA测序文库可显著降低NIPT对非整倍体异常和微缺失微重复检测的假阴性率。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述建库处理是通过如下方式进行的：1)将富集处理产物进行末端修复处 理；2)将步骤1)所得末端修复产物进行接头连接处理；3)将步骤2)所得接头连接产物进行纯化处 理；4)将步骤3)所得纯化处理产物利用所述DNA测序文库建库试剂进行PCR扩增处理，所述PCR 扩增处理是通过权利要求3或4所述的方法进行的；5)将步骤4)所得扩增产物进行纯化处理，以获 DNA测序文库。根据本发明实施例的方法所构建的DNA测序文库中胎儿游离DNA浓度得到显著提高， 利用所述DNA测序文库进行NIPT可显著降低非整倍体异常和微缺失微重复检测的假阴性率。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种富集孕妇外周血胎儿游离DNA的试剂盒，包括磁珠和PCR 扩增试剂。根据本发明的实施例，所述试剂盒利用所述磁珠以及PCR扩增试剂对孕妇外周血胎儿游离 DNA进行富集。

根据本发明的实施例，上述试剂盒还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，进一步包括基因组DNA提取试剂和/或建库试剂。根据本发明实施例的试剂 盒可对样本进行DNA提取和/或构建DNA测序文库操作以获得基因组DNA和/或DNA测序文库。

根据本发明的实施例，所述基因组DNA提取试剂包含：蛋白酶K、提取磁珠、裂解液、清洗液1、 清洗液2、洗脱缓冲液。

根据本发明的实施例，所述DNA测序文库建库试剂包含：末端修复缓冲液、末端修复酶、连接缓 冲液、连接酶、标签接头、富集磁珠、纯化磁珠、PCR反应液、PCR引物、洗脱缓冲液。

根据本发明的实施例所述标签接头序列包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核酸序列，或者与 SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少 90％、至少95％、至少99％同一性的核酸序列。

5’-agtcggaggccaagcggtcttaggaagacaataggtccgatcaactccttggctcaca-3’(SEQID NO:1)。

5’-ttgtcttcctaaggaacgacatggctacgatccgactt-3’(SEQ ID NO:2)。

根据本发明的实施例，所述富集磁珠通过两步羧基磁珠反应对DNA片段进行富集纯化，筛选出长 度为100～150bp的DNA片段。

根据本发明的实施例，所述PCR引物序列为SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示核酸序列，或者与 SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少 90％、至少95％、至少99％同一性的核酸序列。

5’-gaacgacatggctacga-3’(SEQ ID NO:3)。

5’-tgtgagccaaggagttg-3’(SEQ ID NO:4)。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本 发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其 中：

图1是根据本发明实施例的PCR扩增过程中的预变性、变性温度对构建DNA测序文库中胎儿游 离DNA浓度影响的结果图；

图2是根据本发明实施例的磁珠双选的方法富集胎儿游离DNA后，构建的DNA测序文库中胎儿游 离DNA浓度变化结果图；

图3是根据本发明实施例的使用磁珠双选和降低变性温度的方法富集胎儿游离DNA后，构建的 DNA测序文库中胎儿游离DNA浓度变化结果图；以及

图4是根据本发明实施例1和实施例3构建的DNA测序文库中胎儿游离DNA片段长度分布对比图， 其中；

4-A表示实施例3中使用待富集DNA样本1.3倍体积的富集磁珠进行第一步磁珠富集及使用第一步 磁珠富集后获得的DNA样本1倍体积的富集磁珠进行第二步磁珠富集后构建的DNA测序文库中胎儿 游离DNA片段长度分布图，

4-B表示实施例1中未使用磁珠富集所构建的DNA测序文库中胎儿游离DNA片段长度分布图，其 中，98℃、90℃、88℃、86℃表示PCR扩增过程中的变性温度。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例 是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所 指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。 在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

同一性，本发明，为了比较两个或更多个核苷酸序列，可以通过将[第一序列中与相应位置的核苷酸 相同的核苷酸的数目相除]来计算第一序列和第二序列之间的“序列同一性”的百分比。第二个序列中的核 苷酸]减去[第一个序列中核苷酸的总数]，然后乘以[100％]，其中第二个核苷酸序列中每个核苷酸的缺失， 插入，取代或添加-相对于第一核苷酸序列-被认为是单个核苷酸(位置)上的差异。

或者，可以使用标准设置，使用用于序列比对的已知计算机算法，例如NCBI Blastv2.0，计算两个 或多个核苷酸序列之间的序列同一性程度。

用于确定序列同一性程度的一些其他技术，计算机算法和设置例如在WO 04/037999，EP 0 967 284， EP 1 085 089，WO 00/55318，WO 00/78972，WO 98/49185和GB2357768-A。

发明人创造性地利用胎儿游离DNA甲基化程度较低的特点，通过简单地改变PCR扩增过程中的变性 温度，实现了选择性扩增低甲基化的游离DNA片段，达到显著提高胎儿游离DNA浓度的目的；并通过 与磁珠双选富集方法的结合与优化，使得胎儿浓度得到进一步提升，主要包括以下操作：(1)从全血 中分离血浆并提取孕妇外周血游离DNA，对孕妇外周血游离DNA利用磁珠双选法富集短片段；(2)将 提取后的游离DNA加入到1～1.5倍体积的富集磁珠中混匀后静置，置于磁力架上至溶液澄清；(3)将上 清转移至富集磁珠中混匀后静置，置于磁力架上至溶液澄清；(4)弃上清，乙醇洗涤两次后洗脱；(5) 使用末端修复酶和连接酶对步骤B的产物分别进行末端修复和接头连接，使用纯化磁珠进行纯化；(6) PCR扩增：将纯化产物加入到引物和PCR反应液中，PCR反应程序如表1所示，其中现有方法对胎儿游离DNA进行扩增采用的变性温度为98℃，反应结束后，使用纯化磁珠进行纯化洗脱，进行后续的高通量测 序或其他检测。

表1：

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任 何方式限制本发明。

实施例1选择性扩增低甲基化片段提高胎儿游离DNA浓度的方法

本实施例中，检测样本来自深圳华大临床检测中心32例临床男胎血浆样本；试剂和接头序列 等均来自华大生物科技(武汉)有限公司生产的胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂 盒(联合探针锚定聚合测序法)【国械注准20173400059】。

1、提取基因组DNA

将32例样本混合均匀并分装至64个1.5mL的EP管中，分为8组，其中4组分别标记1，2， 3，4(另外四组标记10、11、12、13组，用于实施例3，样本相同便于对比)，用华大生物科技(武汉)有限公司生产的核酸提取试剂盒【鄂汉械备20150250号】进行游离DNA提取，具体操作 步骤见说明书。

1、末端修复

将提取的游离DNA加入到表2所示的反应体系中，于37℃温度下孵育20min，65℃温度下孵 育20min，于4℃条件下备用。

表2：

2、接头连接

将末端修复后的溶液加入到表3所示的反应体系中，于23℃温度孵育20min，于4℃条件 下备用。其中，标签接头序列如表4所示。孵育后的溶液使用纯化磁珠进行纯化，30μL洗脱 缓冲液洗脱溶解，备用。

表3：

表4：

4、PCR扩增

本将步骤3中获得的磁珠纯化后的洗脱液加入表5所示的反应体系中，所用引物序列见表6， 四组样本分别按不同的PCR反应程序进行PCR扩增，其中1组为现有方法所用的程序；2组降低 变性温度至90℃；3组降低变性温度至88℃；4组降低变性温度至86℃，各组反应程序如表6所 示。

表5：

表6：

表7：

PCR扩增反应结束后，使用纯化磁珠进行纯化，20μL洗脱缓冲液洗脱溶解，备用。文库浓度 由BMG LABTECH进行检测，文库浓度适宜，具体浓度如表8所示。

表8：

5、生信分析

将步骤4中获得的文库经上机前准备，用MGISEQ-2000测序平台，测序类型为PE50。具体分析方法采用“胎儿遗传异常的无创性检测”(CN103403183 B)所述流程进行。测序数 据经生信分析得出胎儿游离DNA浓度数据(见图1)和片段长度分布图(见图4下半部分)。由 图1可知，1～4组的平均胎儿游离DNA浓度分别为9.88％，9.84％，10.18％，10.86％，可见降低 PCR扩增过程中的变性温度至86℃时，胎儿游离DNA浓度提升最显著，与采用现有方法的第1 组相比DNA浓度提升10％。由图4可知，降低胎儿变性温度后与采用现有方法的第1组对比，胎 儿游离DNA的片段分布无任何改变，故排除此方法是通过富集短片段来提高胎儿游离DNA浓度 的可能性。因片段长短和甲基化程度是胎儿和母体游离DNA最显著的两大差异，对于低甲基化片 段的富集效果较难通过实验和生信分析流程直接证明，故通过排除法可有效验证本改进方法中对 于胎儿游离DNA浓度的提升是通过富集低甲基化片段实现的。

实施例2富集短片段来提高母体外周血胎儿游离DNA浓度的方法

本实施例所用样本来自深圳华大临床检测中心40例临床男胎血浆样本。试剂和接头序列等均来自 胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒。

1、提取DNA

将这些样本混合均匀并分装至80个1.5mL的EP管中，分为5组，分别标记5、6、7、8和9，用 华大生物科技(武汉)有限公司生产核酸提取试剂盒进行游离DNA提取。

2、磁珠双选富集

第5组作为对照组，不进行磁珠富集，本实验的具体操作如下：

(1)将第6～9组中的游离DNA分别加入到1.5、1.4、1.3、1.2倍体积的富集磁珠中混匀，静置300s， 置于磁力架上至溶液澄清；

(2)将获得的上清液转移至1.0倍体积的富集磁珠中混匀，静置600s，置于磁力架上至溶液澄清；

(3)弃去获得的上清液，使用70％-80％乙醇洗涤两次，再使用50μL洗脱缓冲液进行洗脱溶解， 备用。

3、末端修复

具体实验操作同实施例1。

4、接头连接

具体实验操作同实施例1。

5、PCR扩增

PCR扩增的反应体系和引物序列与实施例1相同，反应程序如表9所示。

表9：

反应结束后，使用纯化磁珠进行纯化，20μL洗脱缓冲液洗脱溶解，备用。文库浓度由BMG LABTECH进行检测，文库浓度检测结果如表10所示，所得DNA文库浓度适宜。其中，“富集磁珠比 例”一行的表示方法为：X表示待富集DNA样本的体积，数字表示体积倍数，以6组的富集磁珠比例为 例，“1.5X+1X”中，“1.5X”表示第一次磁珠富集时，所用富集磁珠的体积为第一次磁珠富集待富集DNA 样本的体积的1.5倍，“1X”表示第二次磁珠富集时，所用富集磁珠的体积为第一次富集前待富集DNA 样本体积的1倍。

表10：

6、单链环化、上机测序、生信分析

上述文库经上机前准备，用MGISEQ-2000测序平台，测序类型为PE50。具体分析方法采用“胎儿 遗传异常的无创性检测”(CN103403183 B)所述流程进行。测序数据经生信分析得出胎儿游离DNA浓 度数据(见图2)。由图2可知，5～9组的平均胎儿游离DNA浓度分别为10.10％，16.51％，17.14％， 17.22％，15.41％，可见使用1.3X+1.0Y比例的磁珠富集短片段时，胎儿游离DNA浓度提升最为显著， 与现有方法相比提升比率高达70％。

实施例3一种提高母体外周血胎儿游离DNA浓度的试剂盒及其应用

本实施例所使用试剂盒包括以下试剂：

(1)游离DNA提取试剂：蛋白酶K、提取磁珠、裂解液、清洗液1、清洗液2、洗脱缓冲液；

(2)文库建库试剂：末端修复缓冲液、末端修复酶、连接缓冲液、连接酶、标签接头1-48号、富 集磁珠、纯化磁珠、PCR反应液、PCR引物、洗脱缓冲液。

本实施例使用与实施例1相同的临床男胎血浆样本(实施例1中分出的第10、11、12、13组样品)， 试剂和接头序列等均来自胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒。实验具体操作如下：

1、提取DNA

取出实施例1中标记10，11，12，13的四管混合样本，用华大生物科技(武汉)有限公司生产核 酸提取试剂盒进行游离DNA提取，具体操作见说明书。

2、磁珠双选富集

(1)将提取的游离DNA分别加入到1.3倍体积的富集磁珠中混匀，静置300s，置于磁力架上至溶 液澄清；

(2)将上清转移至1.0倍体积的富集磁珠中混匀，静置600s，置于磁力架上至溶液澄清；

(3)弃去步骤(2)所述澄清溶液的上清后获得的产物使用70％-80％乙醇洗涤两次，使用50μL洗 脱缓冲液洗脱溶解，备用。

3、末端修复

具体实验操作同实施例1。

4、接头连接

具体实验操作同实施例1。

5、PCR扩增

将上一步洗脱液进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系和引物序列与实施例1相同，4组样本分别按 不同的PCR反应程序进行，反应程序如表11所示。

表11：

反应结束后，使用纯化磁珠进行纯化，20μL洗脱缓冲液洗脱溶解，备用。文库浓度采用 BMGLABTECH进行检测，文库浓度适宜，浓度(ng/μL)见表12：

表12：

5、单链环化、上机测序、生信分析

上述文库经上机前准备，用MGISEQ-2000测序平台，测序类型为PE50。具体分析方法采用“胎儿 遗传异常的无创性检测”(CN103403183 B)所述流程进行。测序数据经生信分析得出胎儿游离DNA浓 度数据(见图3)和片段长度分布图(见图4上半部分)。由图3可知，10～13组的平均胎儿游离DNA 浓度分别为18.10％、19.06％、19.44％和20.44％，结果提示，在现有技术流程中加入磁珠双选富集后， 胎儿游离DNA浓度与现有方法相比提升比率为83％，此时降低变性温度至86℃时，胎儿游离DNA浓 度提升最为显著，与现有方法相比提升比率为107％，多提升24％。通过对比图4上、下两部分的胎儿 游离DNA长度分布图，可见磁珠双选富集后曲线整体向左偏移，有效验证是通过富集短片段来提高胎 儿游离DNA浓度。图4上半部分的结果中，降低胎儿变性温度后与现有方法对比，胎儿游离DNA的 片段分布同样无任何改变，故排除降低变性温度的方法是通过富集短片段来提高胎儿游离DNA浓度的可能性。通过排除法可有效验证本改进方法中对于胎儿游离DNA浓度的提升是通过富集低甲基化片段 实现的。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示 例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个 实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且， 描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外， 在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例 或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为 对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和 变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大基因股份有限公司 武汉华大医学检验所有限公司

<120> 提高孕妇外周血中胎儿游离DNA浓度的方法及其应用

<130> BI3210343

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1

<400> 1

agtcggaggc caagcggtct taggaagaca ataggtccga tcaactcctt ggctcaca 58

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 2

<400> 2

ttgtcttcct aaggaacgac atggctacga tccgactt 38

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 3

<400> 3

gaacgacatg gctacga 17

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 4

<400> 4

tgtgagccaa ggagttg 17