一种基于复合荧光染色的微塑料便捷检测方法

技术领域

本发明属于环境污染物检测领域，具体涉及一种基于复合荧光染色的微塑料便捷检测方法。

背景技术

微塑料在水体、土壤、大气等自然环境中普遍存在，甚至在极地降雪、食品以及动物组织中均有检出。微塑料污染已经成为我国乃至全球范围内重点关注的环境问题之一。微塑料不仅可以通过自身的物理作用损伤生物体，更重要的是其具有环境持久性、流动性和污染物聚集性等特点，使微塑料成为其他污染物的重要传播扩散载体，对生物多样性、生态安全和人类健康造成了严重威胁。我国政府和科学界均越来越重视微塑料问题。2022年3月5日国家政府工作报告中明确指出加强新污染物治理，随后国家生态环保部进一步明确微塑料为四类新污染物之一，并出台了新污染物治理行动方案，微塑料等新污染物将纳入环境管理体系。这意味着微塑料检测将迎来高峰，并将在很长时间内保持。因此，研究一种高效可靠、便捷、低成本的微塑料检测技术是面向未来微塑料严格管理的重要支撑。

近年来，国内外学者研发报道了多种微塑料分析检测技术，可以归结为目视法、荧光染色法、光谱法和质谱法四种。每种方法各具特点，目视法操作简单，但仅适用于粒径大于100微米以上的微塑料定量检测；荧光染色法同样比较便捷，适用的微塑料粒径可以达到数微米，但是检测过程容易受到有机质的干扰；光谱法(显微红外光谱或显微拉曼光谱)与质谱法均可进行微塑料定量与定性分析，准确度高，但是需要依赖昂贵的仪器设备，且需要进行图谱比对或分析，检测耗时较长。面对日益增加的微塑料检测需求，荧光染色法具有明显优势，如何克服有机质干扰问题是推动荧光染色法广泛应用的关键。

发明内容

本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种基于复合荧光染色的微塑料便捷检测方法。

本发明提供了一种基于复合荧光染色的微塑料便捷检测方法，具有这样的特征，包括以下步骤：步骤一，采用浓度为30％的过氧化氢作为消解液，将该消解液与待检测水样进行混合，然后在高温下进行消解，得到第一溶液；步骤二，将第一溶液通过洁净的滤膜抽滤提取，第一溶液中的微塑料截留在滤膜上，然后用洁净水冲洗滤膜并真空抽干，再重复操作冲洗两次，得到冲洗后的滤膜；步骤三，向冲洗后的滤膜上加入10mL-50mL尼罗红与4',6-二脒基-2-苯基吲哚的混合染液，置于黑暗条件下静置染色30min后，真空抽滤去掉多余的染液，得到截留有染色后的微塑料的滤膜；步骤四，将截留有染色后的微塑料的滤膜转移到洁净的玻璃培养皿中，盖上盖子后，置于45℃下烘干12h，得到干燥滤膜；步骤五，在预定曝光时间下，使用荧光显微镜对干燥滤膜进行观察，并采用分区统计法进行计数，得到待检测水样中微塑料的含量。

在本发明提供的基于复合荧光染色的微塑料便捷检测方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤一中，消解液与待检测水样的体积比为1:1～50。

在本发明提供的基于复合荧光染色的微塑料便捷检测方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤一中，在高温下进行消解是指在50℃-100℃下消解5h-24h。

在本发明提供的基于复合荧光染色的微塑料便捷检测方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤二中，滤膜为玻璃纤维滤膜，其使用前在500℃下灼烧1h-2h去除背景微塑料干扰。

在本发明提供的基于复合荧光染色的微塑料便捷检测方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤二中，每次冲洗加入20mL的洁净水，洁净水为经过玻璃纤维滤膜过滤的蒸馏水、瓶装水、RO纯水以及超纯水中的任意一种。

在本发明提供的基于复合荧光染色的微塑料便捷检测方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤三中，混合染中的尼罗红与4',6-二脒基-2-苯基吲哚在染色时的工作浓度分别为5mg/L-20mg/L和0.2mg/L-2mg/L。

在本发明提供的基于复合荧光染色的微塑料便捷检测方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤四中，洁净玻璃培养皿是已经过500℃灼烧处理1h。

在本发明提供的基于复合荧光染色的微塑料便捷检测方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤五中，预定曝光时间为5ms-20ms，使用荧光显微镜进行观察时，首先在激发波长为510-560nm、发射波长>520nm的参数设定下观察被尼罗红染色的颗粒；然后在激发波长为330-380nm、发射波长>420nm的参数设定下观察被DAPI染色的颗粒，其中仅被尼罗红染色的颗粒为微塑料。

在本发明提供的基于复合荧光染色的微塑料便捷检测方法中，还可以具有这样的特征：其中，使用荧光显微镜进行观察时，若放大倍数为40×，则预定曝光时间为10ms-20ms，若放大倍数为100×，则预定曝光时间为5ms-10ms。

在本发明提供的基于复合荧光染色的微塑料便捷检测方法中，还可以具有这样的特征：其中，分区统计法是指在干燥滤膜上随机选择5个已知面积的分区，分别计数后，利用以下公式进行计算微塑料总数N：

利用以下公式进行计算待检测水样中微塑料的含量C：

其中，V表示待检测水样的体积。

与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：

1、解决了单一尼罗红染色法受限于有机质干扰的问题

单一尼罗红染色法虽然便捷，但是，由于尼罗红染料不仅可以将微塑料染色，还可以对许多其他有机颗粒进行染色，因此，该方法很容易受到有机质的干扰，在应用过程中受到很大限制。尽管有研究采用了不同方法对样品进行预处理去除有机质，但是微生物源的有机质很难有效去除。本发明方法通过过氧化氢消解以及尼罗红和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)共染色的方法有效地消除了样品中有机质的影响。

2、通过优化荧光观察曝光时间保障了微塑料尺寸的检测精度

微塑料的危害性不仅与其形态有关，更与其尺寸大小紧密相关。而采用荧光染色法检测微塑料时，过长曝光时间会导致微塑料尺寸被显著高估，曝光时间不足则会使部分小尺寸微塑料无法检出。本发明对曝光时间进行不断优化与测试，可以保证观微塑料尺寸具有良好的检测精度，与实际尺寸相差<10％。

3、兼具了便捷性和准确性

光谱法(包括显微拉曼和显微红外等)和质谱法是目前普遍认为检测准确性较高的微塑料检测方法，但是必须依靠昂贵的仪器和较复杂的分析过程。而荧光染色法的分析检测流程更为便捷，但是单一的荧光染色法通常检测准确度存在不足。本发明公开的复合荧光染色法在保持荧光染色法固有的便捷性外，显著提高了其检测准确度。

附图说明

图1是本发明的实施例二中不同曝光时间下微塑料观测尺寸的变化图，图1中的a1-a5分别表示40×放大倍数下，曝光时间分别为5ms、10ms、20ms、50ms以及100ms的结果，图1中的b1-b5分别表示100×放大倍数下，曝光时间分别为5ms、10ms、20ms、50ms以及100ms的结果；

图2为本发明的实施例三中基于复合荧光染色的微塑料便捷检测方法检测不同尺寸微塑料的回收率图；

图3是本发明的实施例三中基于复合荧光染色的微塑料便捷检测方法在两种荧光观测条件下的视野图；

图4是本发明的实施例三中基于复合荧光染色的微塑料便捷检测方法与常用的尼罗红染色法以及显微拉曼法的比较图。

具体实施方式

本发明方法的具体原理如下：

尼罗红染料不仅可以将微塑料染色，还可以对许多其他有机颗粒进行染色，因此，单一尼罗红染色仅适用于有机颗粒含量非常少的水样微塑料检测。水样消解的方法可以有效去除大量的有机质，但是对微生物源的有机固体去除效果较差，而微生物源的有机固体通常含有DNA成分。DAPI不能对微塑料进行染色，但是可以与DNA结合染色，从而可以排除微生物源有机固体的干扰。最终被尼罗红染色但未被DAPI染色的固体物质才是微塑料。

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下实施例结合附图对本发明基于复合荧光染色的微塑料便捷检测方法作具体阐述。

<实施例一>

实施例一提供了一种基于复合荧光染色的微塑料便捷检测方法，该方法包括以下步骤：

步骤一，采用浓度为30％的过氧化氢作为消解液，将该消解液与待检测水样按照进行1:10的体积比进行混合，然后在50℃下消解24h，得到第一溶液。

步骤二，将第一溶液通过洁净的滤膜抽滤提取，第一溶液中的微塑料截留在滤膜上，然后用20mL洁净水冲洗滤膜并真空抽干，再重复操作冲洗两次，得到冲洗后的滤膜。其中，滤膜为玻璃纤维滤膜，其使用前在500℃下灼烧1h-2h去除背景微塑料干扰。洁净水为经过玻璃纤维滤膜过滤的蒸馏水、瓶装水、RO纯水以及超纯水中的任意一种。

步骤三，向冲洗后的滤膜上加入10mL尼罗红与4',6-二脒基-2-苯基吲哚的混合染液，置于黑暗条件下，静置染色30min后，真空抽滤去掉多余的染液，得到截留有染色后的微塑料的的滤膜。其中，混合染中的尼罗红与DAPI在染色时的工作浓度分别为10mg/L和0.5mg/L。

步骤四，将截留有染色后的微塑料的滤膜转移到洁净的玻璃培养皿中，盖上盖子后，置于45℃下烘干12h，得到干燥滤膜。其中，洁净玻璃培养皿是已经过500℃灼烧处理1h。

步骤五，在预定曝光时间下，使用荧光显微镜对干燥滤膜进行观察，并采用分区统计法进行计数，得到待检测水样中微塑料的含量。

其中，步骤五中，预定曝光时间为5ms-20ms。使用荧光显微镜进行观察时，若放大倍数为40×，则预定曝光时间为10ms-20ms，若放大倍数为100×，则预定曝光时间为5ms-10ms。

使用荧光显微镜进行观察时，首先在激发波长为510-560nm、发射波长>520nm的参数设定下(红色荧光)观察被尼罗红染色的颗粒；然后在激发波长为330-380nm、发射波长>420nm的参数设定下(蓝色荧光)观察被DAPI染色的颗粒，其中仅被尼罗红染色的颗粒为微塑料。

分区统计法是指在干燥滤膜上随机选择5个已知面积的分区，分别计数后，利用以下公式进行计算微塑料总数N：

式中，各分区微塑料的总量为该分区分别在上述红色荧光和蓝色荧光下计数的差值。

利用以下公式进行计算待检测水样中微塑料的含量C：

其中，V表示待检测水样的体积。

<实施例二>

实施例二是为了说明本发明的基于复合荧光染色的微塑料便捷检测方法中曝光时间优化对微塑料尺寸检测精度的影响。

实施例二采用经过尼罗红染色的两种粒径的微塑料颗粒作为模式微塑料，这两种微塑料颗粒的粒径分别为5μm和20μm。随机取一定量模式微塑料于洁净玻璃比色皿中，盖上盖子后，置于45℃下烘干12h。然后置于荧光显微镜下进行观测，对于每一种粒径的微塑料均设置了五个梯度的曝光时间，分别是5ms、10ms、20ms、50ms和100ms，利用软件对观测到的微塑料尺寸进行计算。同时比较了40×和100×两种放大倍数下的观测效果。

图1是本发明的实施例二中不同曝光时间下微塑料观测尺寸的变化图，图1中的a1-a5分别表示40×放大倍数下，曝光时间分别为5ms、10ms、20ms、50ms以及100ms的结果，图1中的b1-b5分别表示100×放大倍数下，曝光时间分别为5ms、10ms、20ms、50ms以及100ms的结果。

由图1可以看出，两种粒径的微塑料的观测尺寸都随着曝光时间的增加而增大。当放大倍数为40×时(图1中a1-a5)，曝光时间小于20ms的情况下，观测到的5μm和20μm微塑料尺寸与实际尺寸之间分别存在0.0-8.7％和1.1％-5.7％的差异，但是曝光时间为5ms时，视野中的微塑料数量明显少于其他曝光时间。一旦曝光时间达到50ms及以上，观测的微塑料(尤其是20μm微塑料)边缘出现模糊，尺寸显著增加，且难以准确计数。因此，放大倍数为40×时，10-20ms为推荐曝光时间。

当放大倍数为100×时(图1中b1-b5)，曝光时间小于10ms的情况下，观测到的5μm和20μm微塑料尺寸与实际尺寸之间分别存在1.0％-6.0％和2.2％-4.7％的差异。当曝光时间达到20ms时，观测到的两种粒径微塑料的尺寸均超过了实际尺寸的12％以上，继续增加曝光时间，视野模糊，无法计数。因此，放大倍数为100×时，5-10ms为推荐曝光时间。

<实施例三>

实施例三是为了说明本发明的基于复合荧光染色的微塑料便捷检测方法的原理及检测可靠性。

实施例三首先采用实施例二中的两种粒径的尼罗红染色的微塑料作为模式微塑料，通过加标回收实验测试本发明基于复合荧光染色的微塑料便捷检测方法的回收率。对于每一种粒径微塑料，均设置了3个微塑料加标水平(<100个、200-300个和400-500个)。

然后采用实施例一的基于复合荧光染色的微塑料便捷检测方法分别检测实验室自来水、合肥市某地表水以及合肥市某污水处理厂出水中微塑料的含量，并将检测结果与常用的尼罗红染色法和显微拉曼法进行比较。水样采样、实验室分析检测过程中涉及的玻璃器皿、滤膜均通过500℃灼烧1h处理，实验用纯净水均经过过滤处理。

基于复合荧光染色的微塑料便捷检测方法分别检测实验室自来水、合肥市某地表水以及合肥市某污水处理厂出水中微塑料的含量时，将这三种来源不同的水分别作为一种待检测水样，每种待检测水样均按照下述过程进行检测：

步骤一，向200mL待检测水样中加20mL浓度为30％的过氧化氢，然后在50℃下消解24h，得到第一溶液。

步骤二，将第一溶液通过孔径为0.7μm的玻璃纤维滤膜进行过滤，此时，微塑料被截留在滤膜上，然后用20mL洁净水冲洗滤膜并真空抽干，再重复操作冲洗两次(共冲洗了3次)，得到冲洗后的滤膜。

步骤三，向冲洗后的滤膜上加入10mL混合染液，置于黑暗条件下，静置染色30min后，真空抽滤去掉多余的染液，得到截留有染色后的微塑料的滤膜。其中，混合染为尼罗红与DAPI的混合染液，混合染液中的尼罗红与DAPI的浓度分别为10mg/L和0.5mg/L。

步骤四，将截留有染色后的微塑料的滤膜转移到洁净的玻璃培养皿中，盖上盖子后，置于45℃下烘干12h，得到干燥滤膜。

步骤五，在曝光时间为10ms、放大倍数为100×下，采用荧光显微镜对干燥滤膜进行观察，并采用分区统计法进行计数，得到待检测水样中微塑料的含量。

其中，使用荧光显微镜进行观察时，首先在激发波长为510-560nm、发射波长>520nm的参数设定下(红色荧光)观察被尼罗红染色的颗粒；然后在激发波长为330-380nm、发射波长>420nm的参数设定下(蓝色荧光)观察被DAPI染色的颗粒，其中仅被尼罗红染色的颗粒为微塑料。

分区统计法是指在干燥滤膜上随机选择5个已知面积的分区，分别计数后，利用以下公式进行计算微塑料总数N：

式中，各分区微塑料的总量为该分区分别在上述红色荧光和蓝色荧光下计数的差值。

利用以下公式进行计算待检测水样中微塑料的含量C：

其中，V表示待检测水样的体积。

图2为本发明的实施例三中基于复合荧光染色的微塑料便捷检测方法检测不同尺寸微塑料的回收率图。

由图2可知，在所有测试的加标水平上，两种粒径微塑料的回收率均保持在90％-97％之间，证明了本发明基于复合荧光染色的微塑料便捷检测方法的可靠性。

图3是本发明的实施例三中基于复合荧光染色的微塑料便捷检测方法在两种荧光观测条件下的视野图。

图3展示了经过复合荧光染色样品在两种不同荧光观测条件下的显微镜视野，可以明显看到，在Ex/Em＝510-560nm/>590nm条件下出现很多红色荧光颗粒，即被尼罗红染色的颗粒；当观测条件切换到Ex/Em＝330-380nm/>420nm时，在尼罗红染色颗粒对应位置上，有相当部分的颗粒呈现出淡蓝色，即被DAPI染色，说明该颗粒并非微塑料，而是微生物源有机固体。这说明复合荧光染色很好地克服了微生物源有机质对微塑料检测的干扰。

图4是本发明的实施例三中基于复合荧光染色的微塑料便捷检测方法与常用的尼罗红染色法以及显微拉曼法的比较图。

如图4所示，单一尼罗红染色法测出的自来水、某地表水和某污水处理厂出水中微塑料含量分别为3535个/L、15308个/L和16123个/L；利用本发明公开的方法检测出的三种水样中微塑料含量分别为1065个/L、2948个/L和3939个/L，相对于单一尼罗红染色法的结果降低了70％以上。而且该结果与准确性非常好的显微拉曼法相比，所有样品的微塑料含量差异均不超过15％，证明了本发明的基于复合荧光染色的微塑料便捷检测方法具有良好的准确性。

上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。