Leptin/Sirt5对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的影响

技术领域

本发明属于生物细胞技术领域，具体的说是Leptin/Sirt5对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的影响。

背景技术

BMP9是骨形态发生蛋白(BMP)家族的一员，在间充质干细胞(MSCs)中BMP9比BMP7或BMP2具有更大的成骨诱导潜能。BMP9可通过经典BMP/Smad通路和非经典BMP/Smad通路促进MSCs成骨分化，如Wnt/β-catenin和PI3K/Akt信号通路。其中，Wnt/β-catenin信号对成骨至关重要可在干细胞分化的早期被激活，但在成骨细胞成熟阶段被抑制[4]。Wnt/β-catenin活性可受多种因素调控，如Wnt配体、Wnt抑制因子1(Wif1)、Dickkopf 1(Dkk1)、骨硬化蛋白(SOST)等。此外，β-catenin还可以通过翻译后修饰进行调节，如β-catenin的磷酸化和乙酰化。在诱导前体细胞向成骨细胞分化时，BMP9可激活Wnt/β-catenin信号通路。但BMP9如何激活Wnt/β-catenin信号尚未完全阐明。

瘦素(Leptin)是由167个氨基酸组成的多肽，主要表达于白色脂肪组织、骨髓等组织。这种多肽最初是在遗传肥胖的大鼠身上发现的，Leptin在血浆中与其受体结合调节摄食和能量平衡，在调节体内能量代谢中发挥关键作用[8,9]。先前的研究表明，高水平的葡萄糖或Leptin通过促进丙二酰辅酶a的分泌来抑制糖酵解过程，丙二酰辅酶a是葡萄糖代谢的负反馈调节因子，通过促进糖酵解途径的关键调节因子丙二酰化来实现。在骨重建过程中，瘦素可以通过抑制成骨细胞增殖或通过增加NF-κB受体活化因子配体的表达来促进破骨细胞的吸收，从而调节骨形成与骨吸收之间的平衡。瘦素还通过下调c-myc和Cyclin D1[14]的表达抑制成骨细胞增殖。然而，其机制尚不明确。糖酵解是成骨分化过程中的主要能量来源，同时研究发现成骨关键通路Wnt/β-catenin可通过肝癌相关巨噬细胞激活糖酵解，促进上皮-间充质转化。瘦素可以通过促进丙二酰辅酶A的分泌来调节糖酵解过程。因此，瘦素可能通过修饰某些关键的成骨调节因子参与调控BMP9的成骨潜能。

Sirt5是一种NAD+依赖性蛋白脱酰基酶，定位于细胞质和线粒体，参与调节多种代谢途径。Sirt5可以通过去除靶点赖氨酸残基上的丙二酰化来调节糖酵解途径。丙二酰辅酶A是丙二酰化化合物的供体，可由丙二酰辅酶A脱羧酶代谢。丙二酰辅酶A通过促进关键靶点的丙二酰化来发挥代谢的负反馈调节作用。相反，Sirt5通过去甲基化恢复这些靶点的活性，从而正向调节代谢。Sirt5作为赖氨酸丙二酰化的全局调节因子，通过与丙二酰辅酶a维持内环境稳态在多种疾病中发挥重要作用。然而，Sirt5在成骨分化中的作用尚不清楚。

为了证明了瘦素对BMP9诱导的MSCs成骨分化的影响，并探讨Wnt/β-catenin和Sirt5是否参与这一过程，为此，本发明提供Leptin/Sirt5对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的影响。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，解决上述至少一个问题，本发明提出的Leptin/Sirt5对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的影响。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：本发明所述的Leptin/Sirt5对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的影响,该方法步骤如下所示：

S1：选用细胞培养，并对细胞进行重组腺病毒；

S2：建立大鼠去卵巢(OVX)模型，并通过ELISA法测量大鼠血清；

S3：提取选用细胞的 RNA，同时对cDNA制备，并对PCR、蛋白和Westernblot检测，同时对碱性磷酸酶(ALP)活性测定；

S4：小鼠颅骨缺损模型建立；

S5：液相色谱-串联质谱分析；

S6：共聚焦分析和免疫沉淀法，并记录统计数据。

优选的，所述S1的具体方法步骤如下所示：

选用细胞为贴壁培养的细胞HEK293、C3H10T1/2、3T3-L1和MC3T3-E1，同时将细胞在含有10％FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的杜尔贝科DMEM(High Glucose)培养基中培养，并置于37℃、5％ CO2孵育箱中培养；并通过用AdEasy系统表达Leptin或LeptinsiRNA寡核苷酸的重组病毒，将重组腺病毒在HEK293细胞中包装，这些细胞被命名为AdBMP9、AdLeptin和AdsiLeptin；用绿色荧光蛋白(GFP)标记AdBMP9和AdLeptin，用红色荧光蛋白(RFP)标记AdsiLeptin；只表达单体RFP (AdRFP)或GFP (AdGFP)的腺病毒作为载体对照。

优选的，所述S2的具体方法步骤如下所示：

A1：选取雌性10只SD大鼠，随机分为OVA组和Sham组，将OVA组采用水合氯醛(4mg /kg)腹腔麻醉，俯卧位固定在手术台上，进行消毒，皮肤被放置在左大腿根部的上边缘，在背部中线处0.5 cm处开0.5 cm切口，用镊子沿腰大肌提起脂肪团的表面肌层，沿外侧边缘被切去约0.5 cm以找到左侧卵巢，摘除卵巢后，用5-0丝线结扎输卵管，右侧卵巢也通过同样的程序被切除；

A2：采用ELISA法测定OVX大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)、骨钙素(OCN)和Leptin水平，用分光光度计(Varioskan 3020, Thermo Scientific)在450 nm处测量吸光度。

优选的，所述S3中提取选用细胞的 RNA，同时对cDNA制备的步骤如下所示：

B1：选用细胞经不同因素处理后，于24h、48后结束培养，弃培养基，用预冷的PBS清洗细胞两次，放置于冰上加入400μl TRIZOL裂解10min，用无酶枪头反复吹打，收集细胞裂解液于1.5mlEP管中，然后在EP管中加入200μl氯仿，缓慢颠倒混匀20秒，置于冰上等待5min, 4℃低温超速离心12000g,10min；

B2：取出EP管，用无酶枪头小心吸取上层液体大约400μl于另一EP管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后静止10min,低温超速离心12000g，10min；

B3：弃上清液，加入75％乙醇(DEPC水配置)500μl,轻轻颠倒混匀3次，4℃低温离心7500g，5min，重复一次；

B4：缓慢匀速的将乙醇倒出，随后将空离20s，弃上清液，加入20μl DEPC水，测RNA浓度；

B5：逆转录，取5μl总RNA，2μl Reaction Buffer(5X), 0.5μl Oligo(dT) Primer,0.5μl Primer Script RT Enzyme Mix Ⅰ，2μl Random Hexamer Primer(100μM),总共10μl的体系，PCR反应程序：先在 37℃下，加热15min，在缓慢将温度升至85 37℃,，保持5s，倒入ddH2O定容至100μl，放置于-20℃保存。

优选的，所述S3中对PCR、蛋白和Western blot检测，同时对碱性磷酸酶(ALP)活性测定的方法步骤如下所示：

C1：取出3μl的cDNA与6μl SYBR Green和引物的混合物混匀, 配成9μl的PCR体系，放置实时荧光定量PCR仪中，反应程序：95℃、3min， 95℃、20s，66℃、10s， 循环3次；95℃ 、10s，55℃、 15s，70℃、1s，总共循环39次，65℃-95℃溶解分析，目的基因mRNA水平与β-actin的表达矫正归一化；

C2：将细胞接种于中，按照实验设计用试剂处理，在结束时间点，丢弃培养液，用冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗细胞，将6孔板置于冰上，每孔加入300 μl的放射免疫沉淀(RIPA)裂解缓冲液(QS0006, Saimike, China Chongqing)5分钟，将裂解液收集到1.5 mlEP管中，4℃离心10分钟(12000 g)，再将上清转移到新的1.5 ml EP管中，加入75 μl的加载缓冲液；

C3：混合物煮沸10分钟使其变性，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白，转移到PVDF膜上，用5％牛血清白蛋白阻塞90分钟，然后用tris缓冲盐水和Tween 20(TBST)冲洗膜3次，与一抗在4℃孵育过夜，再用TBST冲洗膜3次，并用辣根过氧化物酶(HRP)偶联二抗体孵育，数据由ChemiScope6200凝胶成像仪收集，使用ImageJ软件对数据进行量化；

C4：将细胞接种于24孔板中，按照实验设计用试剂处理，5或7天后，按照碱性磷酸酶试剂盒的说明进行组织化学染色，再用PBS轻轻清洗盘子并风干，用显微镜拍摄图像，用ImageJ软件对平板进行扫描和量化。

优选的，所述S4的具体方法步骤如下所示：

D1：将小鼠头盖骨手术部位的毛发拔掉，用一个直径3毫米的环钻小心翼翼地在头盖骨上钻了一个洞，然后根据实验设计，用AdGFP、AdBMP9、AdBMP9+AdLeptin或AdsiLeptin、AdBMP9+AdLeptin+Adβ-catenin、AdBMP9+AdsiLeptin+Adsiβ-catenin预处理C3H10T1/2细胞填充孔；

D2：8周后，所有小鼠安乐死，取出颅骨并用福尔马林固定，用于后续影像学评估；

D3：采用VivaCT 40μ-CT系统对颅骨缺损修复标本进行扫描，对原始数据进行进一步分析，并利用μ-CT 516.1软件进行三维重建。

优选的，所述S5的具体方法步骤如下所示：

E1：将富集的赖氨酸-丙二酰化多肽溶于溶剂A(0.1％FA,2％ACN)中，加载到自制的反相预柱(75μm ID×4 cm长，5μm粒径)上，溶剂B(0.1％甲酸，98％乙腈)在开始的26分钟内梯度从6％增加到23％，8分钟从23增加到35％，3分钟内增加到80％，然后在最后3分钟保持在80％；在EASY-nLC 1000 UPLC系统中，所有的梯度变化都是在恒定流速为400 nl/min的情况下进行的

E2：样品被置于NanoSpray电离源中，随后在Q Exactive

优选的，所述S6中共聚焦分析的方法步骤如下所示：

F1：将C3H10T1/2细胞置于激光共聚焦细胞培养皿中，分别用AdGFP、AdBMP9、AdLeptin、AdsiLeptin、AdBMP9和AdLeptin、AdBMP9和AdsiLeptin、siSirt5或AdBMP9和siSirt5处理，24 h后，用冷PBS(4℃)洗涤细胞，4％多聚甲醛固定15 min, PBS洗涤，0.3％Triton X-100处理20 min，再用冷PBS洗涤，4℃山羊血清阻塞1小时。

F2：细胞与抗β-catenin一抗4℃孵育过夜，细胞用冷PBS洗涤2次，用DyLight 594标记的荧光二抗孵育30分钟，用冷PBS洗涤2次，最后用二氨基苯基吲哚(DAPI)孵育细胞5min，然后用冷PBS洗涤两次，图像采用共聚焦显微镜拍摄。

优选的，所述S6中免疫沉淀法的方法步骤如下所示：

G1：细胞接种于6孔板中，按实验设计处理，30小时后，用PBS(4℃)清洗细胞，用RIPA裂解缓冲液处理细胞，其中含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂；

G2：蛋白G磁珠先用RIPA裂解缓冲液进行预处理，随后裂解液用这些磁珠进行处理，防止蛋白与磁珠非特异性结合，裂解物与β-catenin、赖氨酸丙二酰化、Sirt5或兔IgG抗体在4℃孵育过夜，然后与蛋白G磁珠孵育；

G3：用RIPA裂解缓冲液仔细洗涤磁珠，收集的RIPA裂解缓冲液煮沸10分钟，将磁珠粒中洗脱出的蛋白质变形，最后对样品进行标准Western blot检测。

本发明的有益效果如下：

1.本发明所述的Leptin/Sirt5对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的影响，在C3H10T1/2细胞中，外源性敲低Leptin的表达可以增强BMP9所诱导的RUNX2、OPN、 ALP活性和基质矿化水平，而过表达Leptin则抑制。实验结果发现，Leptin敲低可以促进β-catenin的蛋白水平，并且对p-β-catenin没有影响。通过使用Adsiβ-catenin病毒与AdsiLeptin及AdBMP9联合使用处理细胞时，沉默Leptin对BMP9诱导RUNX2和ALP活性的增加作用可被部分逆转。在体内实验结果显示，Leptin敲低可以增强BMP9诱导颅骨缺损的面积和骨密度。通过质谱分析发现β-cateni可能存在赖氨酸丙二酰化修饰，同时这种修饰是由Leptin通过Sirt5，是赖氨酸丙二酰化全局调控因子，来调控。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明。

图1是大鼠血清Leptin水平的影响示意图；

图2是 Leptin在多种细胞系中的表达示意图；

图3是BMP9下调C3H10T1/2细胞中Leptin的mRNA和蛋白水平示意图；

图4是 Leptin对BMP9诱导成骨的经典通路蛋白Smad的关系示意图；

图5是Leptin对BMP9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化中成骨指标的影响示意图；

图6是Leptin对BMP9诱导C3H10T1/2细胞β-catenin的影响示意图；

图7是Leptin对BMP9诱导Wnt/β-catenin通路下游靶点c-Myc的影响示意图；

图8是β-连环蛋白和/或Leptin对C3H10T1/2细胞中bmp9诱导的成骨标志物的影响示意图；

图9是Leptin和/或β-连环蛋白对bmp - 9诱导骨缺损修复的影响示意图；

图10是BMP9对C3H10T1/2细胞中β-catenin赖氨酸丙二醛化的影响示意图；

图11是Sirt5对Leptin诱导的β-连环蛋白丙二酰修饰的影响示意图；

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

本发明所述的Leptin/Sirt5对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的影响,该方法步骤如下所示：

S1：选用细胞培养，并对细胞进行重组腺病毒；

S2：建立大鼠去卵巢(OVX)模型，并通过ELISA法测量大鼠血清；

S3：提取选用细胞的 RNA，同时对cDNA制备，并对PCR、蛋白和Westernblot检测，同时对碱性磷酸酶(ALP)活性测定；

S4：小鼠颅骨缺损模型建立；

S5：液相色谱-串联质谱分析；

S6：共聚焦分析和免疫沉淀法，并记录统计数据。

优选的，所述S1的具体方法步骤如下所示：

选用细胞为贴壁培养的细胞HEK293、C3H10T1/2、3T3-L1和MC3T3-E1，同时将细胞在含有10％FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的杜尔贝科DMEM(High Glucose)培养基中培养，并置于37℃、5％ CO2孵育箱中培养；并通过用AdEasy系统表达Leptin或LeptinsiRNA寡核苷酸的重组病毒，将重组腺病毒在HEK293细胞中包装，这些细胞被命名为AdBMP9、AdLeptin和AdsiLeptin；用绿色荧光蛋白(GFP)标记AdBMP9和AdLeptin，用红色荧光蛋白(RFP)标记AdsiLeptin；只表达单体RFP (AdRFP)或GFP (AdGFP)的腺病毒作为载体对照。

所述S2的具体方法步骤如下所示：

A1：选取雌性10只SD大鼠，随机分为OVA组和Sham组，将OVA组采用水合氯醛(4mg /kg)腹腔麻醉，俯卧位固定在手术台上，进行消毒，皮肤被放置在左大腿根部的上边缘，在背部中线处0.5 cm处开0.5 cm切口，用镊子沿腰大肌提起脂肪团的表面肌层，沿外侧边缘被切去约0.5 cm以找到左侧卵巢，摘除卵巢后，用5-0丝线结扎输卵管，右侧卵巢也通过同样的程序被切除；

A2：采用ELISA法测定OVX大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)、骨钙素(OCN)和Leptin水平，用分光光度计(Varioskan 3020, Thermo Scientific)在450 nm处测量吸光度。

所述S3中提取选用细胞的 RNA，同时对cDNA制备的步骤如下所示：

B1：选用细胞经不同因素处理后，于24h、48后结束培养，弃培养基，用预冷的PBS清洗细胞两次，放置于冰上加入400μl TRIZOL裂解10min，用无酶枪头反复吹打，收集细胞裂解液于1.5mlEP管中，然后在EP管中加入200μl氯仿，缓慢颠倒混匀20秒，置于冰上等待5min, 4℃低温超速离心12000g,10min；

B2：取出EP管，用无酶枪头小心吸取上层液体大约400μl于另一EP管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后静止10min,低温超速离心12000g，10min；

B3：弃上清液，加入75％乙醇(DEPC水配置)500μl,轻轻颠倒混匀3次，4℃低温离心7500g，5min，重复一次；

B4：缓慢匀速的将乙醇倒出，随后将空离20s，弃上清液，加入20μl DEPC水，测RNA浓度；

B5：逆转录，取5μl总RNA，2μl Reaction Buffer(5X), 0.5μl Oligo(dT) Primer,0.5μl Primer Script RT Enzyme Mix Ⅰ，2μl Random Hexamer Primer(100μM),总共10μl的体系，PCR反应程序：先在 37℃下，加热15min，在缓慢将温度升至85 37℃,，保持5s，倒入ddH2O定容至100μl，放置于-20℃保存。

所述S3中对PCR、蛋白和Western blot检测，同时对碱性磷酸酶(ALP)活性测定的方法步骤如下所示：

C1：取出3μl的cDNA与6μl SYBR Green和引物的混合物混匀, 配成9μl的PCR体系，放置实时荧光定量PCR仪中，反应程序：95℃、3min，95℃、20s，66℃、10s，循环3次；95℃、10s，55℃、15s，70℃、1s，总共循环39次，65℃-95℃溶解分析，目的基因mRNA水平与β-actin的表达矫正归一化；

C2：将细胞接种于中，按照实验设计用试剂处理，在结束时间点，丢弃培养液，用冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗细胞，将6孔板置于冰上，每孔加入300μl的放射免疫沉淀(RIPA)裂解缓冲液(QS0006,Saimike,China Chongqing)5分钟，将裂解液收集到1.5ml EP管中，4℃离心10分钟(12000g)，再将上清转移到新的1.5ml EP管中，加入75μl的加载缓冲液；

C3：混合物煮沸10分钟使其变性，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白，转移到PVDF膜上，用5％牛血清白蛋白阻塞90分钟，然后用tris缓冲盐水和Tween 20(TBST)冲洗膜3次，与一抗在4℃孵育过夜，再用TBST冲洗膜3次，并用辣根过氧化物酶(HRP)偶联二抗体孵育，数据由ChemiScope6200凝胶成像仪收集，使用ImageJ软件对数据进行量化；

C4：将细胞接种于24孔板中，按照实验设计用试剂处理，5或7天后，按照碱性磷酸酶试剂盒的说明进行组织化学染色，再用PBS轻轻清洗盘子并风干，用显微镜拍摄图像，用ImageJ软件对平板进行扫描和量化。

所述S4的具体方法步骤如下所示：

D1：将小鼠头盖骨手术部位的毛发拔掉，用一个直径3毫米的环钻小心翼翼地在头盖骨上钻了一个洞，然后根据实验设计，用AdGFP、AdBMP9、AdBMP9+AdLeptin或AdsiLeptin、AdBMP9+AdLeptin+Adβ-catenin、AdBMP9+AdsiLeptin+Adsiβ-catenin预处理C3H10T1/2细胞填充孔；

D2：8周后，所有小鼠安乐死，取出颅骨并用福尔马林固定，用于后续影像学评估；

D3：采用VivaCT 40μ-CT系统对颅骨缺损修复标本进行扫描，对原始数据进行进一步分析，并利用μ-CT 516.1软件进行三维重建。

所述S5的具体方法步骤如下所示：

E1：将富集的赖氨酸-丙二酰化多肽溶于溶剂A(0.1％FA,2％ACN)中，加载到自制的反相预柱(75μm ID×4cm长，5μm粒径)上，溶剂B(0.1％甲酸，98％乙腈)在开始的26分钟内梯度从6％增加到23％，8分钟从23增加到35％，3分钟内增加到80％，然后在最后3分钟保持在80％；在EASY-nLC 1000 UPLC系统中，所有的梯度变化都是在恒定流速为400nl/min的情况下进行的

E2：样品被置于NanoSpray电离源中，随后在Q Exactive

所述S6中共聚焦分析的方法步骤如下所示：

F1：将C3H10T1/2细胞置于激光共聚焦细胞培养皿中，分别用AdGFP、AdBMP9、AdLeptin、AdsiLeptin、AdBMP9和AdLeptin、AdBMP9和AdsiLeptin、siSirt5或AdBMP9和siSirt5处理，24h后，用冷PBS(4℃)洗涤细胞，4％多聚甲醛固定15min,PBS洗涤，0.3％Triton X-100处理20min，再用冷PBS洗涤，4℃山羊血清阻塞1小时。

F2：细胞与抗β-catenin一抗4℃孵育过夜，细胞用冷PBS洗涤2次，用DyLight 594标记的荧光二抗孵育30分钟，用冷PBS洗涤2次，最后用二氨基苯基吲哚(DAPI)孵育细胞5min，然后用冷PBS洗涤两次，图像采用共聚焦显微镜拍摄。

所述S6中免疫沉淀法的方法步骤如下所示：

G1：细胞接种于6孔板中，按实验设计处理，30小时后，用PBS(4℃)清洗细胞，用RIPA裂解缓冲液处理细胞，其中含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂；

G2：蛋白G磁珠先用RIPA裂解缓冲液进行预处理，随后裂解液用这些磁珠进行处理，防止蛋白与磁珠非特异性结合，裂解物与β-catenin、赖氨酸丙二酰化、Sirt5或兔IgG抗体在4℃孵育过夜，然后与蛋白G磁珠孵育；

G3：用RIPA裂解缓冲液仔细洗涤磁珠，收集的RIPA裂解缓冲液煮沸10分钟，将磁珠粒中洗脱出的蛋白质变形，最后对样品进行标准Western blot检测。

如图1A所示为股骨的Micro-CT扫描结果，通过OVX组与Sham组相比，OVX组大鼠股骨松质骨体积和小梁数量减少，随后，通过用ELISA法测定大鼠血清中TRACP、OCN和Leptin的水平；如图1B-D所示，OVX组与Sham组比较，OCN水平明显降低，TRACP和Leptin水平较Sham组明显升高，通过上述结果证实Leptin骨形成的负调控因子。

如图2所示，Western blot检测结果显示，选用细胞中均可检测到瘦素蛋白水平，但是C3H10T1/2细胞内源性瘦素水平低于其他细胞。

如图3表示C3H10T1/2细胞中BMP9对Leptin的影响；如图3B中PCR检测结果和如图3C中Western blot检测结果显示，BMP9显著降低了LeptinmRNA和蛋白水平；如图3D中ELISA检测培养液中Leptin的结果也表明，BMP9抑制了Leptin蛋白水平。

如图4E-J中利用AdEasy系统表达Leptin或Leptin siRNA寡核苷酸的重组腺病毒的结果显示；

如图5A-B所中PCR和Western blot检测结果显示，BMP9增加了Runx2的mRNA和蛋白水平，而AdLeptin的联合作用降低了Runx2的mRNA和蛋白水平；如图5C-F中组织化学染色和western blot检测结果显示，Leptin降低了BMP9诱导ALP活性和OPN蛋白水平的潜力；以上结果表明Leptin可以抑制C3H10T1/2细胞中BMP9的成骨潜能。

如图5G-H中PCR和western blot结果显示，BMP9增加了Runx2的mRNA和蛋白水平，而Runx2的mRNA和蛋白水平通过Leptin敲低而升高；如图5I-J表示，Leptin敲低可增强BMP9诱导的ALP活性；如图5K-J表示，Leptin敲低也可增加BMP9诱导的OPN mRNA和蛋白；以上结果表明，Leptin敲低可以明显促进BMP9的成骨潜能。

如图6A-B中Western blot结果显示，BMP9提高β-catenin水平，Leptin对其无明显影响，但明显降低BMP9增加β-catenin的能力，但是Leptin或/和BMP9对β-catenin (p-β-catenin)的磷酸化并没有明显影响；如图6C-D表示，沉默Leptin可增强BMP9诱导的β-catenin，但Leptin敲除对p-β-catenin没有明显影响；如图6E中共聚焦试验结果显示，BMP9增加β-catenin和核易位，Leptin抑制了β-catenin，但Leptin敲除促进了β-catenin的核易位。

如图7F-G中Western blot结果显示，BMP9增加了c-Myc水平，Leptin对其无明显影响，但明显降低了BMP9增加c-Myc的能力；如图7H-I表示，通过Leptin敲低，BMP9诱导的c-Myc升高，但Leptin敲低对c-Myc没有实质影响；以上数据表明，Leptin对BMP9成骨潜能的影响部分通过抑制Wnt/β-catenin信号介导。

如图8A中Western blot结果显示，瘦素降低了bmp9诱导的Runx2表达，而β-catenin可部分逆转Runx2表达；如图8B-C中ALP检测结果显示，瘦素显著降低了bmp9诱导的ALP活性，而β-catenin几乎逆转了这一作用；如图8D表示，瘦素敲低对促进bmp9诱导的Runx2的作用几乎被β-catenin敲低所消除；以上结果表明，瘦素对bmp9诱导的成骨分化的抑制作用可能部分通过降低Wnt/β-catenin信号介导。

如图9A所示，建立C3H10T1/2细胞模型，分别用AdGFP、AdBMP9、AdBMP9和AdLeptin或AdsiLeptin、AdBMP9 + AdLeptin和Adβ-catenin、AdBMP9 + AdsiLeptin和Adsiβ-catenin预处理C3H10T1/2细胞，收集细胞并植入缺陷部位；如图9B-C中μ-CT分析结果表明，BMP9明显促进缺损修复；Leptin降低了BMP9诱导骨缺损修复的潜能，而β-连环蛋白几乎逆转了这一潜能，相反，Leptin的下调增强了BMP9诱导骨缺损修复的潜力，而β-catenin的下调几乎消除了这种潜力；以上结果表明，Leptin抑制BMP9诱导骨形成的作用可能部分是通过降低Wnt/β-catenin信号活性介导的。

如图10A中Western blot结果显示，BMP9以浓度依赖性的方式降低丙二醛化水平；如图10B中免疫沉淀实验显示，β-catenin可被赖氨酸丙二酰化修饰，；如图10C中液相色谱-质谱分析结果证实，β-catenin可被丙二酰化修饰；如图10D中KEGG富集分析显示，丙二酰化修饰主要发生在代谢途径、脂肪酸氧化、柠檬酸循环等途径。

如图11A-B中Western blot结果显示，BMP9增加了Sirt5的水平，而Leptin不仅降低了Sirt5的水平，还降低了BMP9介导的Sirt5的升高；如图11C-D表示，Leptin敲低Sirt5升高，而BMP9诱导的Sirt5也敲低了；如11E中Westernblot结果显示，Sirt5敲低使总戊二酰化修饰水平升高，而β-catenin蛋白水平同时降低；图11F中免疫荧光染色和共荧光检测结果显示，BMP9使β-catenin的水平和核易位升高，而Sirt5敲低则使β-catenin的核易位明显降低；以上结果初步提示Leptin可通过Sirt5调节β-catenin；如图11G-H中Western blot结果显示，Leptin敲低联合BMP9上调β-catenin，降低丙二醛化，Sirt5敲低可部分逆转；如图11I中免疫沉淀分析显示，Sirt5可能与β-catenin相互作用，以上结果表明Leptin介导的Wnt/β-catenin信号的抑制可能部分源于通过下调Sirt5增加β-catenin丙二醛化。

总结：在C3H10T1/2细胞中，外源性敲低Leptin的表达可以增强BMP9所诱导的RUNX2、OPN、 ALP活性和基质矿化水平，而过表达Leptin则抑制。实验结果发现，Leptin敲低可以促进β-catenin的蛋白水平，并且对p-β-catenin没有影响。通过使用Adsiβ-catenin病毒与AdsiLeptin及AdBMP9联合使用处理细胞时，沉默Leptin对BMP9诱导RUNX2和ALP活性的增加作用可被部分逆转。在体内实验结果显示，Leptin敲低可以增强BMP9诱导颅骨缺损的面积和骨密度。通过质谱分析发现β-cateni可能存在赖氨酸丙二酰化修饰，同时这种修饰是由Leptin通过Sirt5，是赖氨酸丙二酰化全局调控因子，来调控。

上述前、后、左、右、上、下均以说明书附图中的图1为基准，按照人物观察视角为标准，装置面对观察者的一面定义为前，观察者左侧定义为左，依次类推。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。