一种调控硬基质上细胞力测定灵敏度的方法

技术领域

本发明属于细胞力学生物技术领域，具体地涉及一种调控硬基质上细胞力测定灵敏度的方法。

背景技术

细胞产生的力在生物发育、稳定组织结构中起着关键作用，并决定了组织的命运与功能。生物学过程，包括细胞迁移，肌肉收缩，伤口愈合，形态发生，癌症的发展已经被发现本质上是由细胞产生的力控制的。因此，细胞产生的力与细胞功能密切相关。通过细胞力的定量可定量表征各种细胞功能、研究细胞的生理与病理与生物学过程，应用于疾病诊断、药效筛选与毒性评估等。目前用于细胞力定量测定的方法主要基于光学显微镜测得细胞所接触软基质的形变大小，如细胞牵引力显微镜，微柱阵列。随着软基质硬度的增加，细胞施加基质上的收缩力增加。有关形变大小随基质厚度变化的理论预测也在很多实验中已得到证实。可是，常规细胞生物学实验室所用的细胞培养皿为硬基质材料，细胞在硬基质上产生力的测定方法非常缺乏。这方面偿试主要包括：1)依然是基于光学方法测定细胞力引起的硬悬梁壁弯曲程度，2)微机电系统力传感器，将所测得细胞力引起的微型力传感器微小形变转变为易于测量的传感器输出信号，这方面的主要进展有压阻传感器，即测量细胞力引起的电阻变化。悬粱壁主要适于单细胞力的测试，微机电系统力传感器的构建复杂，涉及到绝缘层、导电层多层结构。此外，3)也有间接测定细胞力引起的电信号或光信号的硬基质传感方法，如电化学细胞阻抗传感便被用于心肌细胞收缩与舒张力的间接测定，后来的实验证实心肌细胞搏动过程电细胞阻抗变化与原子力显微镜(AFM)测得的细胞力的变化成正比。可是，上述这几种硬基质细胞力测定方法中，尚无硬基质结构或传感器厚度如何调制细胞力测定灵敏度的报道。

已有细胞在硬基质中产生的应力随基质厚度增加而呈指数衰减(Shijie He,Yewang Su，Baohua Ji,Huajian Gao，Some basic questions on mechanosensing incell–substrate interaction，Journal of the Mechanics and Physics ofSolids 70(2014)116–135)的理论预测，由于缺乏合适的实验技术而无实验结果支撑与证实。此前我们已获得了基于双谐振压电技术实时定量测定硬基质上细胞牵引力的发明技术“一种牵引力实时与定量测定的方法”。该技术只强调了AT切与BT切石英晶体频率必须相同，没有探讨晶体上金电极涂层厚度对细胞力测定灵敏度的影响。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种调控硬基质上细胞力测定灵敏度的方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述调控硬基质上细胞力测定灵敏度的方法包括如下步骤：

(1)在AT切石英晶体和BT切石英晶体表面的导电薄膜或石英白片上修饰促进细胞黏附的材料，所述促进细胞黏附的材料为细胞外基质材料与分子，细胞外基质模拟材料或分子；所述AT切石英晶体与BT切石英晶体具有相同频率、表面形态和/或修饰了相同的表面黏附分子；

(2)将步骤(1)修饰后的AT切与BT切石英晶体置于检测池内，将待测定的内皮细胞或原代心肌细胞放入检测池，通过如下公式测定不同厚度t

其中，K

(3)细胞力随导电薄膜厚度增加呈指数降低，t

所述硬基质上细胞力测定方法为基于硬基质敏感的直接力与间接力测定方法；

所述硬基质细胞力直接测定方法为微悬梁臂，微机电系统、如压阻传感器，双谐振压电技术，所述硬基质间接细胞力测定方法为电阻抗敏感技术，光传感技术；

所述硬基质细胞力测定灵敏度调控在于控制与细胞接触的力传感芯片表面电极或绝缘层厚度或促进细胞粘附分子或材料的厚度；

所述双谐振AT切石英晶体和BT切石英晶体表面导电薄膜电极层厚度为0-1000纳米，所述导电薄膜材料为与细胞生物相容的金等金属材料及既导电又透明、允许光学显微镜观察的ITO材料；

所述细胞外基质材料与分子包括纤粘连蛋白、胶原，所述细胞外基质模拟材料或分子包括明胶、RGD黏附多肽、聚赖氨酸。

本发明还提供了另一种调控硬基质上细胞力测定灵敏度的方法，包括如下步骤：

(1)在AT与BT切芯片表面通过真空磁控溅射或真空蒸镀方法被上两个纳米到二十个纳米的金属铬或钛粘附薄层，之后再被上10-1000nm厚的与细胞生物相容的金属材料，或在石英芯片上直接被上10-1000nm厚金属材料或既导电又透明、允许光学显微镜观察的ITO材料

(2)在经步骤(1)处理后的AT切石英晶体和BT切石英晶体表面的导电薄膜或石英白片上经物理或化学方法修饰促进细胞黏附与其它功能的材料；所述促进细胞黏附与其它功能的材料为细胞外基质材料与分子，如纤粘连蛋白、胶原，细胞外基质模拟材料或分子，如明胶、RGD黏附多肽、聚赖氨酸等；所述AT切石英晶体与BT切石英晶体具有相同频率、相同厚度导电薄膜和表面形态，并修饰了相同的表面黏附分子或材料；

(3)将步骤(2)修饰后的金电极或ITO电极置于检测池内，将待测定的具有一定接种密度的内皮细胞或原代心肌细胞加入检测池，通过如下公式测定内皮细胞粘附或心肌细胞搏动时对石英晶体产生的表面应力ΔS：

其中，K

其中，Γ为半带宽，ρ

求得细胞粘弹性指数CVI：

CVI＝ΔR

Δf

(4)通过比较不同厚度导电薄膜下细胞施加在AT与BT切芯片上的力，可探索与定量导电薄膜镀层厚度对细胞施加在芯片上力的影响；

所述AT切石英晶体与BT切石英晶体具有相同频率和表面形态，频率范围为1MHz-200 MHz，石英晶体芯片形状为圆形或方形；

所述细胞外基质材料与分子包括纤粘连蛋白、胶原，所诉细胞外基质模拟材料或分子包括明胶、RGD黏附多肽、聚赖氨酸。

下面对本发明作进一步说明：

本课题组已经建立了基于双谐振压电技术定量测定细胞牵引力与细胞粘弹性等细胞力学参数的测定方法，并已获得了发明发明。这些方法之前所采用的AT与BT切石英晶体表面金电极镀层厚度为固定的100nm厚，之后偿试了在石英晶体微天平(QCM)领域应用于质量敏感所推荐的1000nm厚金镀层，却不能灵敏地测到稳定可靠的细胞力信号。从而意识到金纳米镀层厚度可能是影响细胞力测定灵敏度的一个关键参数。双谐振压电技术是将细胞施加在金电极涂层的力转移到涂层下的石英基质而被传感检测的。

石英晶体与金纳米涂层均为刚性材料，两者厚度本身不会影响细胞牵引力的大小，然而从双谐振压电技术定量测定石英晶体表面应力原理来分析，应力的传感是通过石英晶体表面薄膜中存在的应力改变石英晶体的频率而实现的，这种应力大小在薄膜层中并非均匀分布：应力最初传递至薄膜表面时最大，而后应力随薄膜层厚度的增加而减小。EeNisse注意到该现象，曾观察到镀膜时的应力水平通常在薄膜的前几个单分子层沉积到石英基质上时最高，但随着后续单层的沉积而降低。并据此推导出沿薄膜厚度的积分应力理论关系式，但并未对薄膜厚度的增加会导致加载于石英基质上的应力发生衰减这一现象作进一步研究。本发明采用的双谐振压电技术基于细胞黏附于金薄膜涂层上从而实现细胞牵引力的定量监测，因此该涂层的厚度必然影响加载至石英基质上细胞应力的大小。Shijie He等建立相关力学模型后计算发现，细胞牵引力大小随细胞黏附硬基质厚度(Z)增加而指数衰减。我们通过蒸镀不同厚度(10-200nm)金涂层系统比较了纳米金涂层厚度(t

此外，细胞力测定灵敏度也与细胞力测定方法与技术相关，比如双谐振压电技术定量细胞力的灵敏度随AT切与BT切石英晶体的频率增加而增，因此石英晶体频率或石英白片本身的厚度与石英白片上导电薄膜厚度可协同一起来调控细胞力的测定灵敏度。AT与BT切白片的频率常数分别为1664KHz mm与2549KHz mm。1-200MHz AT与BT切白片的厚度范围分别在1664-8.32μm与2549-12.75μm。

包括细胞牵引力在内所施加给石英晶体上表面应力变化ΔS引起的频率变化由如下公式给出：

Δfs ＝ fr,s-fr ＝ -KfrΔS/tq ＝ -KNfr

上式中fr,s为应力状态下的晶体谐振频率，K、N与fr分别为AT或BT切石英晶体的应力系数、频率常数与无应力状态下的谐振频率。因此细胞所施加表面应力引起的频率变化与晶体的工作谐振频率的平方成正比，即晶体频率越高，所测频率信号越大。中间频率范围(如5-80MHz)晶体适于细胞整体力的测定。1MHz及以下低频晶体适用于较厚组织(如血管)、器官(如心脏、胚胎)所产生力的测定。100MHz以上高频晶体适用于细胞/传感器界面、如粘着斑结构与细胞膜所产生力的测定。

附图说明

图1为石英晶体表面金涂层厚度对细胞传输到石英传感界面及石英本体力的影响示意图。

图2为9MHz AT与BT切石英晶体表面修饰了细胞黏附分子纤连蛋白fibronectin(FN)和防止细胞非特异性吸附分子11-巯基-11烷基-3(乙二醇)(PEG)后接种和培养20,000个人脐静脉内皮细胞于不同厚度金电极表面，测得细胞黏附过程动态细胞牵引力(ΔS)曲线(图2A)及最后稳态细胞牵引力随金电极涂层厚度变化曲线(图2B)。

图3为40,000大鼠原代心肌细胞在明胶修饰20nm-150nm不同厚度金电极上粘附过程(25h)所测得9MHz AT与BT切晶体动态QCM响应曲线。

图4为9MHz AT与BT切晶体实时监测40,000大鼠心肌细胞在明胶修饰不同厚度金电极上粘附48h后搏动过程伴随的频移和动态电阻变化曲线。

图5双谐振压电技术测得心肌细胞在明胶修饰20nm厚金电极上搏动时伴随的QCM响应与心肌搏动力学性能曲线：(A)AT切QCM频率、电阻响应，(B)BT切QCM频率、电阻响应，(C)心肌细胞在AT切晶体上搏动时的CVI曲线，(D)心肌细胞在BT切晶体上搏动时的CVI曲线，(E)心肌细胞搏动时的收缩与舒张力变化曲线。

图6双谐振压电技术测得心肌细胞在明胶修饰50nm厚金电极上搏动时伴随的QCM响应与心肌搏动力学性能曲线：(A)AT切QCM频率、电阻响应，(B)BT切QCM频率、电阻响应，(C)心肌细胞在AT切晶体上搏动时的CVI曲线，(D)心肌细胞在BT切晶体上搏动时的CVI曲线，(E)心肌细胞搏动时的收缩与舒张力变化曲线。

图7双谐振压电技术测得心肌细胞在明胶修饰100nm厚金电极上搏动时伴随的QCM响应与心肌搏动力学性能曲线：(A)AT切QCM频率、电阻响应，(B)BT切QCM频率、电阻响应，(C)心肌细胞在AT切晶体上搏动时的CVI曲线，(D)心肌细胞在BT切晶体上搏动时的CVI曲线，(E)心肌细胞搏动时的收缩与舒张力变化曲线。

图8心肌细胞在20nm、50nm、100nm厚度金镀层芯片搏动时产生的应力变化。

图9为60,000个大鼠原代心肌细胞在以明胶修饰的石英芯片上不同厚度金电极表面用电化学阻抗仪监测到的心肌细胞粘附过程不同芯片厚度下细胞指数(CI)-时间对比图。

具体实施方式

QCA922八通道石英晶体分析仪(Seiko-EG&G)用于9MHz AT与BT切石英晶体频率与动态电阻动态实时测定。5600真空蒸发镀膜机(美国Saunders&Associates)用于在9MHz AT与BT切8mm抛光方形白片上蒸镀直径5mm、厚度10-200nm金电极，在蒸镀金电极之前、先蒸镀厚度为10nm的铬粘附层。镀膜时，根据所需膜厚设定相同厚度的膜厚，再通过台阶仪进行样片膜厚测量，对所需膜厚的蒸镀参数进行标定，可精准制备所需膜厚。

2500磁控溅射镀膜机(日本昭合真空)被用于9MHz AT与BT切13.67mm直径圆片沉积直径为5.1mm，厚度20-150nm金电极，在蒸镀金电极之前、先蒸镀厚度为10nm的铬粘附层。镀膜时，通过设备厂家给出的膜厚-镀膜速度公式计算出所需膜厚对应的镀膜速度，再经过台阶仪对样片进行膜厚标定，可精准制备所需膜厚。

本发明基于双谐振器压电技术，通过实时监测粘附石英晶体上的人脐静脉内皮细胞HUVECs细胞引起的AT与BT切晶体频移，定量测得HUVECs细胞对石英晶体施加应力(ΔS)的动态变化。ΔS正负值代表细胞群整体对石英晶体施加的不同应力，ΔS>0对应粘附于石英晶体表面的细胞群整体处于张应力状态，出现于细胞在底部基质上铺展、粘附的过程，细胞通过粘着斑复合物对石英晶体施加收缩牵引力，使得石英晶体受到压应力；而ΔS<0对应细胞群整体对石英晶体施加的合力方向与收缩牵引力方向相反，表现为突出力占主导，使得石英晶体受到张应力。对于大鼠原代心肌细胞，细胞搏动时的收缩与舒张过程伴随着细胞本身整体的收缩与舒张，因此心肌细胞收缩ΔS>0，心肌细胞舒张时ΔS<0。

具体实验结果如图1至图9所示，说明如下：

由图1可知，随着金电极涂层厚度(t

由图2A可知，在所测试10-200nm金电极厚度范围，均有细胞牵引力响应，在整个动态细胞粘附过程中，总的趋势是牵引力前3h内保持快速而明显的增加，之后保持相对稳定。由图2B可知，随金纳米涂层厚度的增加，细胞牵引力的最终稳态值表现出降低的趋势，最终稳态值随金纳米涂层厚度的增加而近似呈指数衰减，曲线拟合的结果为ΔS＝104262e

由图3可知，随着金电极厚度的降低，AT与BT晶体的频移与动态电阻变化响应均增大，20nm金电极厚度时，QCM的频率与动态电阻变化均最大。

如图4，在AT切芯片中，20nm、50nm、100nm、150nm涂层厚度的频率响应变化依次为：～1500Hz、～1000Hz、～900Hz、～800Hz，发现其随着涂层厚度加大，其频率响应逐级降低；动态电阻均很小，在几个欧姆范围内变化。在BT切芯片中，20nm、50nm、100nm、150nm涂层厚度的频率响应变化依次为：～1200Hz、～680Hz、～600Hz、～180Hz，与AT的趋势较为一致。且图4中频率、电阻都显示出明显的心肌搏动周期性响应，搏动频率约为1.5～2.5s/次，其中20nm金镀层厚度时的搏动周期性响应图形更规整，50nm与100nm金镀层厚度的图形表现出搏动出现干扰波，虽仍具有一定的周期性，但监测的搏动响应不及20nm灵敏及规整。故在20nm厚度时，频率和电阻的变化最大，响应最为明显，故认为金涂层在所测试最低金电极厚度20nm时的灵敏度最佳，且获得的心肌搏动图形效果最好。因此，20nm金电极厚度有望提高双谐振压电技术定量测定细胞搏动力学性能的灵敏度。

进一步我们用9MHz AT与BT切双谐振压电技术选择与比较了原代心肌细胞在明胶修饰20nm，50nm、100nm三种厚度金电极上的心肌细胞搏动时伴随的细胞粘弹性指数(CVI)与产生的表面应力(收缩与舒张力)变化。如图5～图7所示：两种切型晶体频率、电阻都显示出明显的心肌搏动周期性响应，搏动频率约为1.5～2.5s/次，其中20nm金镀层厚度时的搏动周期性响应图形更规整，50nm与100nm金镀层厚度的图形表现出搏动出现干扰波，虽仍具有一定的周期性，但监测的搏动响应不及20nm灵敏及规整。观察每种厚度下的CVI响应，可以看出在20nm金镀层厚度时，细胞在搏动过程中粘弹性同样呈现周期性的变硬变软，CVI朝向接近零的过程变化体现的是细胞收缩过程中细胞变硬，离开零的过程则体现的是细胞舒张过程中细胞变软。在50nm、100nm金镀层厚度时，CVI体现了不完全的周期性，有可能是在搏动过程中，较厚的金电极下、QCM未能捕获到完整的搏动曲线所致。进一步分析3种厚度下的细胞所产生的应力变化，如图5E、6E、7E所示，细胞产生的应力呈现周期性的变正变负，反应的是细胞周期性的舒张与收缩力。仍然是20nm下，细胞收缩力和舒张力变化范围最大且较规整。随着金电极厚度的增加，所测得心肌细胞收缩力和舒张力范围降低，特别是100nm厚度下，所捕获的收缩与舒张力变化已变得不怎么规整(图7E)。图8给出了不同金电极厚度下，所测得原代心肌细胞搏动时收缩力与舒张力变化范围，20nm、50nm、100nm下收缩力变化范围分别为144383dyne/cm,76667dyne/cm,45167dyne/cm。20nm、50nm、100nm下舒张力变化范围分别为144917dyne/cm,76167dyne/cm,45000dyne/cm。不同金电极厚度下收缩力与舒张力变化范围非常接近。但均随金电极厚度增加而降低，成指数衰减。指数衰减曲线拟合结果分别为：

△S

△S

由图9可知，不同金电极厚度下心肌细胞的响应趋势较为一致，但可以观察到不同金电极厚度导致阻抗响应的灵敏度有所不同，随着金电极厚度增加，阻抗响应的灵敏度降低，前面的实验我们用的金电极厚度为100nm，CI值大约为0.57，而20nm、50nm金电极厚度下，CI值分别为0.74和0.68左右，150nm金电极厚度下，CI下降到0.43左右，说明，金电极厚度同样会影响心肌细胞在电化学阻抗电极上的动态响应，随着金电极厚度的增加，细胞指数呈线性降低。因此，同样是较薄的20nm金电极的灵敏度最高。

人脐静脉内皮细胞粘附实验在芯片金电极上经分子自组装与化学耦合方法修饰有细胞粘附分子纤粘蛋白fibronectin(FN)，除FN修饰区域，电极其它区域修饰防止细胞非特异性粘附的寡乙二醇分子。修饰时用到的试剂有三乙二醇单-11-巯基十一烷基醚(Triethylene glycol mono-11-mercaptoundecyl ether,TGME)、3-巯基丙酸(1-Mercaptopropionic acid,MPA)、N-羟基丁二酰亚胺(N-Hydroxysuccinmide,NHS)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC)。

所述石英白片上金电极厚度调控内皮细胞粘附过程细胞施加在芯片上所产生横向应力的具体操作步骤如下：

(1)将不同厚度金电极先用无水乙醇、去离子水清洗，氮气吹干；然后用Piranha溶液(30％H

(2)FN-MPA/TGME/Au传感界面的制备

FN-MPA/TGME/Au传感界面的制备在常温(20±5)℃下进行。将预处理过的金电极石英晶体组装到Teflon井型池中，清洗的一面与Teflon井型池底部形成一空气室。将20mmol/LMPA+1mmol/L TGME(无水乙醇为溶剂)的混合溶液加入Teflon井型池中，避光修饰过夜(>15h)后吸出溶液，依次使用无水乙醇、去离子水清洗，氮气吹干。将150mmol/LEDC+30mmol/L NHS(pH＝5.5)PBS混合溶液加入池中，避光活化约30min后依次用PBS缓冲液(pH＝5.5)、去离子水清洗，氮气吹干。向池中加75％乙醇溶液，灭菌15min。加入20μg/mL的FN溶液(pH＝8.2，FN溶于PBS缓冲溶液)，避光修饰4h后吸出溶液，分别用灭菌后的PBS(pH＝8.2)、无菌水冲洗，即得到FN-MPA/TGME/Au传感界面。

HUVECs细胞预先培养于含有10％FBS及1％青链霉素混合液的DMEM培养基中，培养条件为5％CO2、37℃。实验当天，取400μL含1％FBS及1％青链霉素混合液的DMEM培养基，加入修饰有FN的Teflon测试池中9MHz AT与BT切芯片上，之后迅速移去200μL培养基，加入200μL细胞数目为20,000个的细胞悬浮液，QCM连续监测13h以上。

内皮细胞粘附过程施加在芯片上的力按(1)式定量计算，对于9MHz AT与BT切石英晶体，公式(1)可简化为：

ΔS＝380.8Δf

细胞的粘弹性模量按公式(2)与(3)计算。

所述石英白片上金电极厚度调控双谐振压电技术定量大鼠原代心肌细胞搏动时收缩与舒张力的具体操作步骤如下：

(1)乳鼠心肌细胞体外分离培养

取新生2天的SD大鼠8只(购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司)，将其浸入75％的酒精至昏迷；用眼科剪在腹部剪开小口后，沿胸骨剪开胸腔，取出心脏置于预先在平皿四角盛的4℃预冷PBS溶液中。挤去残血，剪去心房，心室部分移入另一盛有PBS溶液的圆皿中，剪成约1mm

(2)Teflon池清洗与石英晶体金电极表面预处理

将Teflon池、橡胶圈、螺丝分别放入装有无水乙醇的烧杯中，超声清洗480s，重复3次；然后再移至装有去离子水的烧杯中，超声清洗480s，重复2次。用氮气将清洗后的Teflon池吹干，然后放入超净工作台内，紫外光照15min以上。

石英晶体金电极表面先用无水乙醇、去离子水分别清洗，用氮气吹干。将置于80℃水浴锅中的现配混酸溶液(1:3(v:v)30％H

(3)双谐振压电技术最优细胞密度的探究实验

探究双谐振压电技术的两种切型芯片分别在0.5×10

(4)双谐振压电技术最优修饰方法的探究实验

采用双切型(AT切、BT切)石英晶体，探索不同修饰方法影响心肌细胞搏动的变化规律，旨在为提高双谐振压点技术定量测定细胞搏动力学性能的灵敏度提供基础。以裸金电极作为对照组，初步选择0.1％胶原修饰、0.1％明胶修饰、FN修饰的AT切、BT切芯片，监测40，000个原代大鼠心肌细胞48h内的频移和动态电阻变化。

0.1％胶原修饰：取1％胶原蛋白于金电极池，4℃下过夜。第二天，取出胶原蛋白后用PBS润洗一遍。进行细胞加载实验。

0.1％明胶修饰：取1％明胶于金电极池，4℃下过夜。第二天，取出明胶后用PBS润洗一遍。进行细胞加载实验。

FN修饰：取100μL MPA加入4900μL无水乙醇混匀。每个金电极池加入200μL，暗环境下过夜(15h)。取0.0069g NHS与0.0575g EDC于2mL PH 5.5的PBS。取出MPA后每孔加入200μL放置1.5h。取出液体，加入75％酒精灭菌25min。用PH 8.2的PBS配置20μg/mL FN(20μL1mg/mL FN加入980μL PBS)。取出酒精，PBS轻柔冲洗，每孔加入200μL 20μg/mL FN修饰4h左右。进行细胞加载实验。

(5)双谐振压电技术实时定量测定心肌细胞在不同厚度金电极上搏动时收缩、舒张力和粘弹性参数

20nm,50nm,100nm不同金电极厚度9MHz AT与BT切晶体在金电极上修饰0.1％明胶涂层后，40,000大鼠心肌细胞加到修饰金电极上粘附48小时，开始心肌细胞搏动时伴随的AT与BT切晶体频率与动态电阻变化测定。心肌细胞搏动时收缩与舒张力及细胞粘弹性指数按公式(1)与(4)式计算。

所述石英白片上金电极厚度调控电阻抗敏感技术测定大鼠原代心肌细胞粘附过程细胞指数的具体操作步骤如下：

SP-300电化学工作站(Biologic,法国)被用于60,000大鼠原代心肌细胞在直径16.67mm石英芯片上中央区域被有不同厚度(20nm,50nm,100nm and 150nm)5.1mm直径金电极、并修饰有0.1％明胶涂层上粘附过程在10Hz-4 MHz频率范围阻抗的测定并求出细胞指数(CI)随时间变化的动态曲线。