一种RAA-LFD检测急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的引物和探针及其方法和应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种RAA-LFD检测急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的引物和探针及其方法和应用。

背景技术

急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreas necrosis disease, AHPND)是由携带了能编码昆虫相关光杆菌杀虫二元毒素（Photorhabdus insect-related,Pir）pirA/pirB的pVA1质粒(69 kbp)的副溶血弧菌特定毒力株(AHPND–causing

目前，针对AHPND病原的特异性诊断主要采用分子生物学方法对pVA1质粒进行检测，WOAH推荐的AHPND分子生物学诊断方法包括：一步法PCR套式PCR Real-timeQuantitative PCR(qPCR)和环介导等温扩增 (isothermal loop-mediatedamplification protocol ，LAMP)等，这些方法均需昂贵的仪器和具有较高操作技能的检测专技人员，难以满足基层实验室及生产一线的现场快速检测和普及应用。因此，有必要研究和建立更为简易快速、仪器依赖程度更低的现场检测新方法，以满足虾类健康养殖和疾病防控所需。重组酶介导扩增 (Recombinase-aid amplification, RAA) 技术是一种新型的恒温核酸扩增方法，它的显著特点在于可实现常温下的脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）解链和扩增，该检测方法可以与侧流试纸条显色技术(Lateral Flow Dipstick，LFD)结合实现检测结果的快速、可视化观测。本研究拟采用RAA与FLD相结合，针对pVA1 质粒的pirB 基因设计特异性引物和探针，建立特异、灵敏、可视化的

发明内容

本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种RAA-LFD检测急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的引物和探针及其方法和应用，具体采用以下的技术方案：

本发明的第一方面，提供了一种RAA-LFD检测急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的引物和探针，其是根据急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌pVA1质粒的pirB基因保守序列设计RAA-nfo特异性引物和探针；其中用于检测肝胰腺坏死病副溶血弧菌pVA1质粒的pirB的引物序列是：

上游引物LFD-PirB-F：5'-TGATGAAGTGATGGGTGCTCGTAGTTGGTG-3'；

下游引物LFD-PirB-R：5'-FAM-CGCCGTTTAACTCAATAGATTGGTAATGCTC-3'；

用于检测肝胰腺坏死病副溶血弧菌pVA1质粒的pirB的探针序列为：

LFD-PirB-P：5'-Biotin-AAAATTGAATCATGGAACAGTATTGAAATA[THF]ATTATTACAATCGCG-P-3'。

其中下游引物中FAM表示抗原性标记；

探针序列也可以表示为：5'-Biotin-A-四氢呋喃-B-P-3'，其中A的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，B的核苷酸序列为序列SEQ ID NO.4所示；Biotin表示5'端的生物素标记，P表示3'末端磷酸盐修饰；

SEQ ID NO.3：AAAATTGAATCATGGAACAGTATTGAAATA；

SEQ ID NO.4：ATTATTACAATCGCG。

本发明首次创新根据急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌pVA1质粒的pirB基因保守序列设计RAA-nfo特异性引物和探针，利用该引物探针建立了

本发明的第二方面，提供了上述引物和探针在制备检测急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的试剂或试剂盒中的应用。

本发明的第三方面，提供了一种检测急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的试剂盒，其试剂盒包含上述的引物和探针。进一步地，其试剂盒中还包括RAA-nfo反应试剂、侧流层析试纸条和装有冻干酶粉的反应管。其中RAA-nfo反应试剂包括缓冲液A、缓冲液B。

本发明的第四方面，还提供了一种利用上述试剂盒检测急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的方法，包括以下步骤：

先将样品副溶血性弧菌置于3% 氯化钠的碱性蛋白胨水中36 ℃摇床过夜培养，使用TAKARA细菌基因组DNA提取试剂盒按说明书方法提取细菌基因组DNA；然后将该细菌基因组DNA作为模板，配制RAA扩增体系，利用上述引物和探针进行RAA扩增反应得到扩增产物；最后将RAA-LFD扩增产物，用ddH

作为进一步优选的实施方式，配制RAA扩增体系的步骤为：取25 µL缓冲液A、2 µL浓度为10µmol/L 的上、下游引物、0.6µL浓度为 10µmol/L 的探针，5µL模板，用ddH2O补至47.5µL，涡旋混匀；再将上述预混液加入到装有冻干酶粉的反应管中，用移液枪吹打混匀，然后取2.5 μL缓冲液B需添加至反应试管盖子上，反应开始前才可混匀，此后马上移至恒温水浴锅中进行反应扩增。

作为进一步优选的实施方式，上述扩增的温度为35 ℃ ~ 45 ℃，扩增的时间为15min ~ 35 min。更优选地，扩增的温度为37 ℃，扩增的时间为20 min。

作为进一步优选的实施方式，上述最后将RAA-nfo扩增产物，用ddH

本发明的有益效果为：本发明根据急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌pVA1质粒的pirB基因保守序列设计RAA-nfo特异性引物和探针，并建立了

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1所示为反应温度和时间优化图，A.反应温度优化试验；B.反应时间优化试验；

图2所示为

图3所示为RAA-LFD法质粒灵敏度试验结果图；

图4所示为荧光PCR法质粒灵敏度试验结果图；

图5所示为RAA-LFD方法基因组灵敏度试验结果图；

图6所示为荧光PCR法基因组灵敏度试验结果图；

图7所示为RAA 重复性试验结果图。

具体实施方式

为了便于理解本申请，下面将参照相关附图对本申请进行更全面的描述。附图中给出了本申请的若干个实施例。但是，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。本文所使用的术语“及／或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

在本文中，除非另有说明，用语“％”是指“质量％”；用语“μg/mL”是指：微克每毫升。在本文中，除非另有说明，本文用语“％”均是指基于本申请组合物的总重量而言的。

在本文中，限定的所有范围是指：包括给定范围内的每个特定范围以及给定范围之间的子范围的组合。例如，1～5的范围具体包括1、2、3、4和5，也包括如2～5、3～5、2～3、2～4、1～4等子范围。

以下实施例中，所采用的供试菌株与临床样品为：

副溶血性弧菌

所采用的主要试剂与仪器为：

RAA-nfo 核酸扩增试剂（试纸条型）盒购自杭州众测生物科技有限公司；双标核酸检测试纸条（彩虹型）购自tiosbio公司；Probe qPCR Mix、细菌基因组DNA提取试剂盒购自TAKARA（北京）公司；DNeasy Blood&Tissue Kit购自Qiagen 公司；3%氯化钠碱性蛋白胨水(3% APW) 、TCBS琼脂培养基、营养肉汤培养基购自北京路桥技术股份有限公司；HH.S11-1型电热恒温水浴锅购自博讯公司；Mastercler® ep realplex4S荧光定量PCR仪购自德国eppendorf公司。

实施例1

急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌RAA-LFD检测方法的优化与建立

1.RAA-LFD 引物和探针的设计

对GenBank上登录的副溶血弧菌AHPND-PirB-KK-VIET1株（MN480428.1）、TX-327株（MH410660.1）、HY3株（MH718270.1）、V.03株（KU556825.1），欧文氏弧菌SH14株（CP045861.1）、GL605株（CP097860.1），坎贝氏弧菌LMB29株（MH890610.1）、K82株（MN846069.1），以及哈维氏弧菌K9株（MN846071.1）、BpShHep24株（MH423892.1）等弧菌分离株PirB基因序列进行比对分析，选择高度保守序列；

（1）对于RAA-LFD 反应引物的设计：

引物设计长度通常在30 至35 个核苷酸之间，可根据根据核苷酸的顺序和组成来预测特定扩增引物的性能；应该避开特定的基因组内的重复序列，以保持靶标的唯一性，最后确定引物最小为30，最大为36；引物GC%最小为20%，最大为70%；引物Tm最小为50，最大为100；最大允许的单核苷酸重复长度设定为5；引物选择很重要，所选引物应能够最大程度减少竞争性地生成引物假象；引物常应能够检测低至 25-50 个拷贝，并可在到达最佳反应温度后 15 分钟内达到实时检测阈值；当引物和探针携带 5-9 个错配碱基对时，RAA分析的性能不受影响。引物的5′末端应避免鸟嘌呤（G）重复，GC含量应控制在30-70 %，引物的3′末端任何一个碱基的错配都会严重影响RPA 扩增效率，下游引物的5"端标记抗原性标记FAM。

（2）对于RAA-LFD 反应体系中探针的设计：

nfo探针和nfo试剂盒配合使用，适用于在横向流动试纸条上进行所谓的夹心法检测，探针由寡核苷酸骨架组成，其中包括：一个5'端标抗原性标记，一个作为核苷酸替代物的内部脱碱基核苷酸类似物（四氢呋喃[THF]残基）其中，THF残基1取代靶序列中存在的碱基，而不是额外插入，一个位于3'末端的聚合酶延伸阻断基团（例如磷酸盐、C3-间臂基或双脱氧核苷酸，但不是生物素-TEG）；nfo探针长度通常在46至52个核苷酸，其中至少30个位于THF（四氢呋喃）位点的5'端，另外至少15个位于THF的3'端，THF残基取代可正常与互补序列进行碱基配对的核苷酸

综合上述（1）和（2），本发明设计了用于急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌RAA-LFD检测引物和探针，其中：

上游引物LFD-PirB-F：5'-TGATGAAGTGATGGGTGCTCGTAGTTGGTG-3'；

下游引物LFD-PirB-R：5'-FAM-CGCCGTTTAACTCAATAGATTGGTAATGCTC-3'；

探针LFD-PirB-P：5'-Biotin-AAAATTGAATCATGGAACAGTATTGAAATA[THF]ATTATTACAATCGCG-P-3'。

其中下游引物中FAM表示抗原性标记；

探针序列也可以表示为：5'-Biotin-A-四氢呋喃-B-P-3'，其中A的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，B的核苷酸序列为序列SEQ ID NO.4所示；Biotin表示5'端的生物素标记，P表示3'末端磷酸盐修饰；

SEQ ID NO.3：AAAATTGAATCATGGAACAGTATTGAAATA；

SEQ ID NO.4：ATTATTACAATCGCG。

2.RAA-LFD检测系统的优化

在设计得到.RAA-LFD引物与探针之后，本发明进一步对.RAA-LFD检测方法进行优化，具体为：

（1）重组质粒标准品构建：

试验标准品选用PirA/B基因序列（MH718270.1）长度为1961 bp 的片段，送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成并构建重组质粒pUC57-PirAB，按公式：拷贝数（copies/μL）＝6.02×10

（2）样品DNA提取

分别将副溶血性弧菌

（3）RAA-LFD反应条件的优化

按照众测 RAA-nfo 试剂盒说明书配制扩增体系：25 µL缓冲液 A，2 µL浓度为10µmol/L 的上、下游引物，0.6µL 浓度为 10µmol/L 的探针，5µL 模板，用ddH

实施例2

RAA-LFD检测方法的方法学考察

1.特异性考察：

应用优化后的

2.灵敏度考察：

（1）质粒检测限分析：将构建的质粒标准品pUC57-PirAB做10 倍梯度稀释，选取浓度为1.17×10

（2）基因组灵敏度分析：将

3.重复性考察：

选取1.17×10

实施例3

临床样本检测

应用本研究建立的

表1

显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或者特性可以包含在本实施例申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或是备选的实施例。本领域技术人员可以显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。