壳聚糖功能化介孔碳在提取玫瑰花黄酮类化合物中的应用

技术领域

本发明属于黄酮类化合物提取技术领域，涉及一种壳聚糖功能化介孔碳复合材料自组装萃取柱在提取玫瑰花中黄酮类化合物中的应用方法。

背景技术

黄酮类化合物是广泛存在于水果、蔬菜和药用植物中的多酚类化合物，因其副作用小、耐药少、安全指数高等特点，在人类营养和健康领域受到越来越多的关注。黄酮类化合物不仅在植物的抗逆性中发挥重要作用，而且对人类和动物的健康也有多种益处。现代药理研究表明，黄酮类化合物具有显著的抗氧化、抗炎、抗癌、保护心血管、降血糖、抗菌和抗病毒作用，可用于开发治疗相关疾病的药物。例如，槲皮素可以预防炎症和疼痛，保护人体免受心脏病的侵害，降低血压、控制糖尿病、提高免疫力。芦丁和山奈酚还具有许多生物化学作用，可作为抗氧化剂、抗癌剂和抗炎剂。此外，黄酮类化合物具有抗氧化活性，在食品工业中被用作防腐剂、着色剂和抗氧化剂。因此，为了更好地了解黄酮类化合物在植物保护、医药和食品安全中的作用，开发有效、灵敏的黄酮类化合物高效富集分离及快速检测方法具有重要的学术价值和研究意义。

近年来，高效液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法、超临界液相色谱法和分光光度法等分析方法已成为测定黄酮类化合物的常用方法。然而，由于黄酮类化合物含量不同，基质效应复杂，实际样品不同，有时会导致无法直接分析。固相萃取（SPE）是一种非常流行的样品前处理方法，具有操作简单、预富集系数高、溶剂消耗少等优点，克服了上述障碍。SPE法中使用最广泛的吸附剂是商业无定形二氧化硅C

介孔碳（CMK-3）作为一种新型多孔材料，具有高表面积、均一的孔径分布、较高的机械强度和良好的导电性，在吸附分离、催化、生物、电导材料等领域表现出巨大的应用潜力。虽然利用CMK-3作为吸附剂富集分析物的研究越来越多，但其应用主要受稳定性差和分散性差的限制，导致对目标分析物的萃取效率较低。壳聚糖是一种具有生物相容性、无毒性和生物可降解性的天然多糖大分子。壳聚糖含有丰富的羟基和氨基官能团，经常被用作纳米载体的表面修饰材料。壳聚糖修饰的介孔碳可以增强材料的分散性和生物相容性，在废水处理和生物活性成分的富集分离中得到了广泛的应用。然而，现有技术中将壳聚糖功能化介孔碳复合材料作为吸附剂应用于黄酮类化合物的提取性能研究较少尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种壳聚糖功能化介孔碳复合材料在提取玫瑰花黄酮类化合物中的应用，能快速富集玫瑰花中的黄酮类化合物。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种壳聚糖功能化介孔碳在提取玫瑰花黄酮类化合物中的应用，该壳聚糖功能化介孔碳作为吸附剂自组装固相萃取柱，快速富集玫瑰花中黄酮类化合物。

本发明将壳聚糖功能化介孔碳复合材料作为吸附剂自组装固相萃取柱实现了玫瑰花中芦丁、陈皮素、槲皮素和山奈酚四种黄酮类化合物的快速富集（12min）。用壳聚糖功能化介孔碳极大地提高了介孔碳的分散性和稳定性，并对黄酮类化合物进行特异性吸附。最后，对功能化介孔碳复合材料用量、pH、富集时间、解吸时间等参数进行了优化。并对其选择性、稳定性和可重复使用性进行了研究和探讨。并与市面上已有的固相萃取柱C18及其他方法进行比较，结果表明功能化介孔碳复合材料具有优异的萃取性能。壳聚糖功能化介孔碳可以增强功能化介孔碳复合材料的稳定性和溶解性，功能化介孔碳复合材料的强溶解度可以促进目标分析物快速富集。因此，本发明能提高玫瑰花中黄酮类化合物的提取效率，且该工艺将使用更少的有毒和挥发性化学溶剂，并节省操作时间。

附图说明

图1是用壳聚糖功能化介孔碳提取玫瑰花黄酮类化合物的原理图。

图2是复合材料用量对黄酮类化合物回收率的影响曲线图。

图3是待测溶液pH 值影响复合材料对黄酮类化合物提取率的曲线图。

图4是磷酸含量对黄酮类化合物提取率影响的曲线图。

图5是洗脱液类型对黄酮类化合物提取率的条形图。

图6是洗脱液体积对黄酮类化合物提取率影响的曲线图。

图7是壳聚糖、介孔碳和复合材料萃取效率的比较图。

图8是评价复合材料吸附剂在不同实验条件下稳定性的条形图。

图9是评价复合材料吸附剂可重复使用性的条形图。

图10自组装的萃取柱和商用C18柱对黄酮类化合物的萃取性能比较曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

、制备壳聚糖功能化介孔碳复合材料

称取一定质量的壳聚糖固体，加入二次蒸馏水，搅拌后滴加醋酸（醋酸与溶液质量比为1︰100），磁力搅拌1h后，静置数小时，制成质量百分比浓度1%的纯壳聚糖溶液。称取20mg介孔碳，加入60 mL二次蒸馏水，震荡使介孔碳完全溶解，将介孔碳溶液滴入纯壳聚糖溶液中，室温下搅拌24 h后，离心；将黑色产物放入真空烘箱真空干燥，制备出相应浓度的壳聚糖功能化介孔碳复合材料（标记为CS/CMK-3）。

2、固相萃取程序及色谱条件

将10mg合成的壳聚糖功能化介孔碳复合材料填入两个聚乙烯筛板之间的容积为3mL的固相萃取筒中，随后，将包装好的SPE盒连接到SPE装置上，依次分别用甲醇（2 mL）和水（2 mL）激活；然后，以1.2 mL/min的流速加载工作液（20 mL ×100 ng/mL）。上样后，用含有磷酸的甲醇溶液为洗脱液，以0.2 mL/min的流速对SPE柱上富集的分析物进行分离；然后将用过的洗脱液20 μL注入HPLC-UV系统进行分析测定。如图1。

0.6 mL洗脱液中磷酸的体积为洗脱液体积的15%。

黄酮类化合物的分析采用Agilent 1100系列模块化高效液相色谱系统(AgilentTechnologies, USA)，配备紫外可见检测器。在C18色谱柱(Hedera ODS-2, 250 mm ×4.6mm id, 5 μm)上，在25℃下分离黄酮。流动相为甲醇/0.25% (v/v)磷酸水溶液(70/30,v/v)的混合物，流速为0.8 mL/min。紫外检测波长为360 nm。

选择性研究：

以5种双酚类化合物和6种多环芳烃类化合物共存为干扰物，功能化介孔碳复合材料对黄酮类化合物的选择性。制备质量体积浓度100.0 μg/L含黄酮类化合物标准溶液、质量体积浓度为100.0 μg/L双酚类化合物和质量体积浓度100.0μg/L多环芳烃化合物溶液各20 mL。经SPE处理后，通过回收率的变化考察功能化介孔碳复合材料吸附剂对黄酮类化合物的选择性。

）制备样品

从兰州当地超市购买玫瑰花作为实际样品进行分析。具体处理过程为，用打样机粉碎玫瑰花样品，将1 g样品粉末溶解于10 mL质量分数 60%的乙醇溶液中摇晃，使样品粉末完全溶解。然后，超声45min，超声温度40℃；取出冷却至室温，定容至50mL容量瓶中，用0.45 μm膜过滤，所得样品在4℃温度下保存以作进一步的SPE处理。

为获得最佳的固相萃取性能，对吸附剂用量、溶液pH、磷酸含量、洗脱液溶剂类型和洗脱液体积等主要参数进行了优化。采用萃取回收率(R%)评价不同条件下的萃取效率。

首先，考察功能化介孔碳复合材料吸附剂对质量在2～16 mg范围内黄酮类化合物的萃取效率，如图2。随着吸附剂用量的增加黄酮类化合物的萃取回收率逐渐增加，当吸附剂用量达到8mg后，黄酮类化合物的回收率不再随吸附剂用量的增加而发生显著变化。因此，为了在节省吸附剂用量的同时获得最佳的萃取效率，后续实验选用8 mg 功能化介孔碳复合材料。

样品的pH值不仅影响功能化介孔碳复合材料的表面状态，还会影响黄酮类化合物的存在形式，从而影响富集能力。因此，图3是不同pH值(2.0 ~ 9.0)的待测溶液对功能化介孔碳复合材料吸附剂上黄酮类化合物的影响示意图。从图3可以看出，当pH为2时，R%较低。这可能是由于功能化介孔碳复合材料在低pH值培养基中氨基质子化削弱了与黄酮类化合物的相互作用。当pH值在5.0～9.0之间时，黄酮类化合物的回收率保持在90%以上。这主要是由于随着pH值的增加，功能化介孔碳复合材料与黄酮类化合物之间的氢键相互作用增强，提高了提取性能。由于本实验所用样品的pH值在5～7之间，因此后续实验不需要调整pH值。

实验中发现，纯甲醇不能完全洗脱黄酮类化合物，如图4。考虑到pH值会影响黄酮类化合物的存在形式，在提取过程中加入酸可以减弱氢键和静电相互作用，从而有利于解吸。因此，在甲醇溶液中加入不同体积的磷酸 （5～25%，v/v），测试对洗脱效果的影响。结果表明，在甲醇溶液中加入磷酸（磷酸体积为甲醇溶液和硫酸总体积的15%）时，吸附的黄酮均可被洗脱，故选择含15%磷酸的甲醇溶液作为洗脱液。此外，使用含15%磷酸的三种洗脱液（甲醇、乙腈、丙酮）对黄酮类化合物的洗脱效率进行评价，如图5。结果表明，甲醇的洗脱效果最好，因此选择酸性甲醇溶液作为解吸溶剂。同时考察了洗脱液体积(1.00～5.00 mL)的影响。从图6可以看出，当体积为2.50 mL时黄酮类化合物可以完全洗脱。考虑到稀释效应，洗脱液体积越小，富集系数越高，即产生的峰面积越大，从而提高灵敏度。因此，为了获得更高的灵敏度，选择2.50 mL甲醇/磷酸混合液作为洗脱液。

图7是在相同提取条件下不同复合材料作为吸附剂对黄酮类黄化合物富集效果图。从图7的结果可以看出，与壳聚糖、介孔碳相比，壳聚糖功能化介孔碳复合材料对黄酮类化合物具有更好的富集效果，这主要是由于功能化介孔碳复合材料之间存在着的协同效应（共价键作用、氢键作用和静电相互作用）。功能化介孔碳复合材料赋予其丰富的多孔结构、较大的比表面积和活性官能团。

经过上述实验优化，在优化条件下，利用功能化介孔碳复合材料自组装的固相萃取柱结合高效液相色谱对质量体积浓度1～300 μg/L范围内的黄酮加标样进行快速富集和检测，建立对应黄酮的定量分析，如表1。

表1 功能化介孔碳复合材料测定黄酮类化合物的性能分析

由表1可知，所测定的黄酮类化合物在质量体积浓度1～300 μg/L范围内具有良好线性关系(R

为进一步考察功能化介孔碳复合材料作为萃取材料的性能，检测用合成的功能化介孔碳复合材料自组装的萃取柱在不同环境介质中的稳定性。首先，功能化介孔碳复合材料萃取柱分别在1 mol/L HCl、纯水和1mol/L NaOH中浸泡3 h，用处理后的固相萃取柱提取黄酮类化合物，以萃取回收率的变化评价其稳定性。从图8中可以看出，R%没有发生明显变化，说明复合材料具有良好的化学稳定性。同时考察了5批自组装固相萃取柱的重复性。试验结果显示，不同批次的回收率差异不大，如图9，表明功能化介孔碳复合材料具有良好的重现性。此外，从图9可以看出，经过7次重复提取实验后，同一萃取柱仍然具有良好的R%（80%以上），这进一步表明功能化介孔碳复合材料具有良好的可重复使用性。

进一步比较功能化介孔碳复合材料作为一种吸附剂自组装的萃取柱和商用C18柱对黄酮类化合物的萃取性能，以芦丁为代表进行加标试验（加浓度为20μg/L、50μg/L和100μg/L）。由图10可知，商用C18柱对黄酮类化合物的提取回收率低于功能化介孔碳复合材料自组装的萃取柱。这进一步证实了功能化介孔碳复合材料优越的提取性能，这是由于C18柱主要依赖疏水相互作用而无法有效提取含有多极官能团的黄酮类化合物。此外，还将建立的功能化介孔碳复合材料固相萃取法与现有技术中测定黄酮类化合物的方法进行了比较，如表2所示。

表2 与现有技术中测定黄酮类化合物含量方法的比较

表2显示，将功能化介孔碳复合材料用于黄酮类化合物的萃取具有线性范围好，检出限低，用量少，提取回收率好等优势。

通过对实际样品玫瑰花中四种黄酮类化合物含量的测定，评价所建立方法的适用性，见表3。

表3 实际样品中黄酮类化合物的测定结果及加标回收率(n = 3)

表3表明，黄酮类化合物在不同空白食品样品中均有检测。其中，槲皮素含量为35.6 μg/g，芦丁和山奈酚含量分别为68.5和14.3 μg/g，陈皮素含量为15.6μg/g。在实际样品中加入质量浓度为50.0μg/g和100.0 μg/g的黄酮类化合物标准溶液，用固相萃取法分析加标回收率。4种黄酮类化合物的加样平均回收率为92.4%～104.3%，RSD为0.72～6.35%（n=3）。上述结果表明，基于功能化介孔碳复合材料的固相萃取法的提取性能受基质效应的影响最小，对黄酮类化合物具有较高的选择性富集能力。因此，功能化介孔碳复合材料也适用于其它复杂样品中黄酮类化合物的快速富集和提取测定。

本发明首次利用壳聚糖功能化介孔碳合成的复合材料作为一种优良的固相萃取吸附剂，结合高效液相色谱技术，建立了一种高效、线性范围好、检出限低、有机溶剂用量少用于玫瑰花中黄酮类化合物的分析方法。试验结果表明，功能化介孔碳复合材料作为一种吸附剂在选择性、稳定性和可重复使用性方面取得了满意的结果。最后通过玫瑰花中黄酮类化合物的高效检测，验证了在食品样品中的潜在应用价值。结果表明，在浓度为1～300μg/L 范围具有良好的线性关系，加标平均回收率为92.4%~104.3%，相对标准偏差＜10，检测结果受基质影响小。综上所述，功能化介孔碳复合材料是一种很有前途的提取食品中黄酮类化合物的吸附剂。通过对试验条件洗脱液类型、溶液pH值、复合材料用量、洗脱液体积等参数的优化，试验结果表明，加标样平均回收率为92.4%～104.3%，相对标准偏差RSD＜10%，基于信噪比为3和10的检测限和定量限分别为0.12～0.35 μg/L和0.40～1.20 μg/L，因此，本发明为黄酮类化合物的快速分离富集提供了新的策略，对中药有效成分的研究具有重要的实用价值。