一种用于肼检测的荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于肼(N

背景技术

肼(N

发明内容

本发明的目的是提供了一种用于肼检测的荧光探针及其制备方法，该方法制备的荧光探针能够用于快速、高选择性识别生物体中肼及用于生物成像。

本发明为实现上述目的采用如下技术方案，一种用于肼检测的荧光探针，其特征在于：该荧光探针为2-((10-丁基-10H-吩噻嗪-3-基)亚甲基)-1H-茚-1,3(2H)-二酮(DO)，其结构式为

本发明所述用于肼检测的荧光探针的制备方法，其特征在于具体过程为：以乙醇为反应介质，以10-丁基-10H-吩噻嗪-3-甲醛和1,3-茚满二酮为反应原料，以哌啶为催化剂，在惰性气体保护下于70-80℃反应，待反应完全后抽滤除去溶剂，乙醚洗涤得到目标产物用于肼检测的荧光探针。

进一步限定，所述10-丁基-10H-吩噻嗪-3-甲醛、1,3-茚满二酮与哌啶的投料摩尔比为1:1:0.01～0.05。

本发明所述用于肼检测的荧光探针的制备方法中的合成路线为：

本发明所述用于肼检测的荧光探针在同时快速、高选择性识别肼中的应用，其具体过程为：该荧光探针在体积比为4:1的磷酸盐缓冲液和乙腈的混合溶液中呈现紫色，在365nm手提紫外灯下无荧光；向混合体系中加入肼后，混合体系的颜色变为无色，在365nm手提紫外灯下显出明亮绿色荧光。

本发明所述用于肼检测的荧光探针在制备对细胞或斑马鱼中肼成像检测试剂中的应用。

与现有的用于检测肼领域荧光探针技术相比，本发明制备的用于生物体中肼检测的荧光探针制备过程简单，仅需一步反应即可得到，反应条件温和，操作简单，无需柱层析。利用本发明制备的用于生物体中肼检测的荧光探针能够实现比色和荧光检测肼，并且响应快、检测限低和选择性高。

附图说明

图1是实施例1制得的荧光探针DO在加入检测物肼前后紫外和荧光检测对比图。

图2是实施例1制得的荧光探针DO在溶液中加入50倍当量肼后的紫外(左)荧光(右)谱图，插图为加入肼前后用在日光下和手提紫外365nm照射下的溶液颜色。

图3是实施例1制得的荧光探针DO在溶液中与不同当量的肼分别反应的荧光发射谱图(A)和515nm处荧光强度与加入肼浓度之间的线性拟合(B)。

图4是实施例1制得的荧光探针DO在溶液中加入20倍当量肼后溶液在515nm处的荧光强度随时间变化曲线。

图5是实施例1制得的荧光探针DO在水溶液与不同干扰离子反应的荧光强度柱状图(blank、Na

图6是实施例1制得的荧光探针DO在负载与滤纸上与肼反应前后在日光和365nm手提紫外灯照射下的照片。

图7是实施例1制得的荧光探针DO在海拉细胞中与肼反应的细胞成像图。

图8是实施例1制得的荧光探针DO在斑马鱼中与肼反应的成像图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

荧光探针化合物2-((10-丁基-10H-吩噻嗪-3-基)亚甲基)-1H-茚-1,3(2H)-二酮(DO)的合成

荧光探针化合物探针化合物2-((10-丁基-10H-吩噻嗪-3-基)亚甲基)-1H-茚-1,3(2H)-二酮(DO)通过以下合成路线进行反应：

在氮气保护条件下，将10-丁基-10H-吩噻嗪-3-甲醛(400mg,1.4mmol)和1,3-茚满二酮(206mg,1.4mmol)加入单口瓶中，再加入乙醇10mL，催化量哌啶(0.028mmol)，于80℃反应8小时，反应结束后冷却至室温，抽滤得到粗品，再用乙醚进行洗涤得到棕色固体产物470mg，产率81％。

本实施例中所制备得到的砖红色固体产物，其核磁共振氢谱是：

其核磁共振碳谱是：

其高分辨质谱是：HRMS(ESI)m/z calcd for C

由此证明了得到砖红色产物为2-((10-丁基-10H-吩噻嗪-3-基)亚甲基)-1H-茚-1,3(2H)-二酮(DO)，其结构式为

实施例2

荧光探针化合物2-((10-丁基-10H-吩噻嗪-3-基)亚甲基)-1H-茚-1,3(2H)-二酮(DO)与肼的紫外和荧光响应

将实施例1制备得到的荧光探针DO溶解于0.1M pH 7.4磷酸盐缓冲液与乙腈的混合溶液中，其中磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为4:1，最终得到浓度为10μM荧光探针DO的测试溶液。图1给出了实施例1制得的荧光探针DO在加入检测物肼前后紫外和荧光检测对比图，由图可知，探针DO与肼接触后紫外和荧光谱图都发生了明显的变化，紫外在长波段发生了荧光降低，荧光在515nm处有明显的打开。如图2所示，在分别加入50倍当量的肼水溶液后，探针溶液在510nm处的吸收迅速降低，并且反应液的颜色有紫色变为无色，在392nm处激发，荧光探针DO的溶液在515nm处有明显的荧光打开过程，溶液在手提紫外灯下可以观察到明显的绿色荧光。图3是浓度为10μM荧光探针DO的测试溶液中加入0-20倍当量肼后的荧光谱图，在392nm处激发，在加入不同浓度的肼的溶液后在515nm处的荧光强度随着肼浓度的增加而增强(图3A)。将515nm处荧光强度和加入肼的浓度进行线性拟合，计算得到荧光探针DO对肼的检测限为0.31μM(S/N＝3)(图3B)。如图4所示，在荧光探针DO的溶液中加入20倍当量的肼后进行时间跟踪，可以发现探针溶液在515nm处的荧光强度迅速增加，并且在10分钟之内达到一个平衡，这说明荧光探针DO与肼的响应非常灵敏快速。图1、图2、图3和图4说明，本发明制备的荧光探针化合物2-((10-丁基-10H-吩噻嗪-3-基)亚甲基)-1H-茚-1,3(2H)-二酮(DO)能够快速实现对肼的比色和荧光检测。

实施例3

荧光探针化合物2-((10-丁基-10H-吩噻嗪-3-基)亚甲基)-1H-茚-1,3(2H)-二酮(DO)的抗干扰性检测

向本发明上述实施例中制备得到的浓度为10μM荧光探针DO的测试溶液中分别加入干扰性阳离子(Na

实施例4

荧光探针化合物2-((10-丁基-10H-吩噻嗪-3-基)亚甲基)-1H-茚-1,3(2H)-二酮(DO)负载于试纸上对肼检测的应用

首先将用棉签蘸上DO溶液(乙腈中浓度为0.5mM)在滤纸上写上两个字母DO，然后将浓度为30μM的肼的水溶液喷到滤纸上，待其干后，分别在日光和便携式紫外灯照射下(365nm)进行拍照。如图6所示，未用肼处理时，滤纸上的两个字母DO呈现紫色，在便携式紫外灯的365nm照射下没有荧光。喷洒肼后，紫色字母变成无色，在便携式紫外灯365nm的照射下，可以观察到明显的绿色荧光。这表明用荧光探针DO制备的简易检测试纸可以实现对溶液中肼的检测。

实施例5

荧光探针化合物2-((10-丁基-10H-吩噻嗪-3-基)亚甲基)-1H-茚-1,3(2H)-二酮(DO)在细胞中的成像应用

Hela细胞在补充有100U/mL青霉素-链霉素的DMEM高葡萄糖培养基进行培养，细胞培养基置于37℃的加湿培养箱中，培养箱中含有体积分数为5％CO

图7给出了本发明制备的荧光探针化合物2-((10-丁基-10H-吩噻嗪-3-基)亚甲基)-1H-茚-1,3(2H)-二酮(DO)对肼成像的结果，在图7的第一横排中可以看见，荧光探针DO在绿色通道中没有明显的荧光；而在加入20μM肼的第二横排中可以发现荧光探针DO在于肼共培养30分钟后在绿色通道中可以观察到绿色荧光。荧光探针DO与40μM肼应后的第三排可以看到更加明亮的绿色荧光。因此，本发明制备的荧光探针化合物2-((10-丁基-10H-吩噻嗪-3-基)亚甲基)-1H-茚-1,3(2H)-二酮(DO)能够很好地实现对细胞中的肼的成像检测。

实施例6

荧光探针化合物2-((10-丁基-10H-吩噻嗪-3-基)亚甲基)-1H-茚-1,3(2H)-二酮(DO)在斑马鱼中的成像应用

将3天大的斑马鱼在含有荧光探针DO的新鲜E3培养基中培养30分钟。然后用E3培养基洗三次，再加入肼，继续培养30分钟。然后进行成像。

图8给出了本发明制备的荧光探针化合物2-((10-丁基-10H-吩噻嗪-3-基)亚甲基)-1H-茚-1,3(2H)-二酮(DO)对肼成像的结果，在图8的第一横排中可以看见，经荧光探针DO培养的斑马鱼在绿色通道中没有明显的荧光；而在加入20μM肼的第二横排中可以发现荧光探针DO在于肼共培养30分钟后在绿色通道中发出绿色荧光，荧光探针DO与40μM肼反应后的第三排可以看到，更加明亮的绿色荧光。因此，本发明制备的荧光探针化合物2-((10-丁基-10H-吩噻嗪-3-基)亚甲基)-1H-茚-1,3(2H)-二酮(DO)能够很好实现对生物体斑马鱼中的肼的成像检测。

由上可见，与现有的探针在肼的检测领域技术相比，本发明制备的荧光探针化合物2-((10-丁基-10H-吩噻嗪-3-基)亚甲基)-1H-茚-1,3(2H)-二酮(DO)能够很好地实现对肼的识别检测，有着合成简单的优点，并且对肼的检测表现出良好的选择性和灵敏度，能够实现对细胞和斑马鱼中肼的成像检测。

以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。