一种抗HPV凝胶及其制备工艺

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种抗HPV凝胶及其制备工艺。

背景技术

人乳头瘤病毒（HPV）属于乳头瘤病毒科（papillomaviridae）, 是一类嗜上皮性无囊膜双链DNA 病毒。类病毒感染人体的表皮与黏膜组织，目前约有170种类型的HPV被判别出来，有些时候HPV入侵人体后会引起疣甚至癌症，但大多数时候没有任何临床症状。

大概有30到40种类型的HPV会透过性行为感染生殖器及周边皮肤，而其中又有些会引起性器疣（俗称菜花）。若反复感染某些高危险性，且又没有疣等症状的HPV类型，可能发展成癌前病变，甚至是侵袭性癌症。经研究99.7%的宫颈癌，都是因感染HPV所造成。国际癌症研究机构统计指出宫颈癌HPV主要为16及18型，感染比例合计近70%。

在我国比较热门的治疗方法为HPV凝胶：HPV病毒凝胶阻断高危型HPV感染预防宫颈病变高危感染生物蛋白敷料抑菌凝胶尖锐湿疣复发 。抗HPV生物蛋白凝胶敷料，由生物蛋白凝胶、凝胶给药装置组成。生物蛋白凝胶由羟乙基纤维素（赋形剂）、生物功能蛋白、甘油、纯化水组成，凝胶给药装置为填塞式，适用于降低局部HPV病毒载量。HPV凝胶引进物理治疗的新概念，HPV病毒是带正电荷产品，主要成分为生物蛋白和980卡波姆，利用修饰后的生物蛋白和卡波姆分子两种负电荷和HPV病毒正电荷，相吸来阻断并消灭HPV病毒，从而达到转阴效果（具有双重杀菌、抑菌功效）。

此外还有采用注射疫苗进行HPV病毒感染的预防，但目前的HPV疫苗主要是针对HPVl6 和18两型，而且对接种疫苗者的年龄段有要求。临床上抗HPV病毒主要采取干扰素治疗，干扰素的作用机理不是直接阻断病毒的复制，而是通过与细胞受体结合，激活一系列基因，使细胞产生抗病毒物质，进而发挥抗病毒作用。

现有技术中，如发明专利申请号为03111091.6，名称为抗人乳头瘤病毒软膏的中国专利公开了一种治疗HPV病毒的软膏形式、用于涂抹的药物，但由于其中含有砒石和铅丹等毒性物质，因此存在副作用大，容易中毒的风险；又如专利申请号为201410541305.3，名称为商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂及其制备方法的中国专利公开了一种复合剂，在使用前需将复合剂与溶解液调配成液体状再进行给药，不仅使用过程烦琐，而且这种液体易流失，在女性生殖道内滞留时间短，药物渗透力差，对创面缺少保护，难以达到预期目的。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种抗HPV凝胶及其制备工艺，通过抗病毒的中药浓缩液以及构建β-乳球蛋白的表达载体制备出的高效抗HPV病毒的β-乳球蛋白，从而制备出高效抗HPV凝胶，HPV凝胶副作用小、渗透力强且滞留时间长。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种抗HPV凝胶，以质量百分比计包括中药浓缩液50-60%、β-乳球蛋白2-5%、凝胶辅料1-5%、余量为水；

所述中药浓缩液以质量百分比计包括：赤芍1-3%、蛇床子0.5-1.5%、黄柏1-3%、苦参0.5-1.5%、大黄0.5-1.5%、土茯苓1-3%、百部1-3%、金银花1-3%、千里光0.5-1.5%、马齿苋1-3%、蒲公英1-3%、余量为水。

进一步的，所述中药浓缩液的制备包括如下步骤：将赤芍、蛇床子、黄柏、苦参、大黄、土茯苓、百部、金银花、千里光、马齿苋、蒲公英混合后加水进行高压熬制，熬制1h后转为常压浓缩1倍后过滤得到中药浓缩液。

进一步的，所述β-乳球蛋白以重组大肠杆菌表达菌株为发酵菌株进行液体发酵，制备得到β-乳球蛋白。

进一步的，所述重组大肠杆菌表达菌株的制备步骤如下：

（a）将重组大肠杆菌表达菌株活化于含50-100μg/ml A+的100ml LB培养液中，25-40℃温度下200-220r/min振摇过夜；

（b）按1:100扩大接种于含50-100μg/ml A

（c）加入IPTG至终浓度为0.3-0.8mM，16-25℃ 120-180r/min过夜培养，诱导融合蛋白表达；

（d）3000-8000×g室温离心10min，弃上清，用PBS（PH7.2-7.4）重悬菌体沉淀；重悬液进行超声破碎后，12000r/min、4℃离心10min，取上清，并用0.45um滤膜过滤；

（e）利用AKTA纯化系统，以0.1-1.5ml/min流速上样至PBS-0.5M NaCl-20mM 咪唑，pH7.5预平衡的Ni亲和层析柱；

（f）用PBS-0.5M NaCl-20mM 咪唑，pH7.5以2-5ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；

（g）用PBS-0.5M NaCl-0.5M 咪唑，pH7.5以2-5ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液，得到β-乳球蛋白。

进一步的，所述目的基因的序列为：MLIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQSAPLRVYVEELKPTPEGDLEILLHKWENGECAQKKIIAEKTKIPAVFKIDALNENKVLVLDTDYKKYLLFCMENSAEPEQSLACQCLVRTPEVDDEALEKFDKALKALPMHIRLSFNPTQLEEQCHIHHHHHH*。

进一步的，所述帮助表达基因的序列为：MDDAAIQQTLAKMGIKSSDIQPAPVAGMKTVLTNSGVLYITDDGKHIIQGPMYDVSGTAPVNVTNKMLLKQLNALEKEMIVYKAPQEKHVITVFTDITCGYCHKLHEQMADYNALGITVRYLAFPRQGLDSDAEKEMKAIWCAKDKNKAFDDVMAGKSVAPASCDVDIADHYALGVQLGVSGTPAVVLSNGTLVPGYQPPKEMKEFLDEHQKMTSGK*。

本发明还提供了一种抗HPV凝胶的制备工艺，用于制备上述的抗HPV凝胶，其包括如下步骤：

S10、将中药浓缩液、β-乳球蛋白以及凝胶辅料充分混匀；S20、向混合物中加入纯净水并缓慢加入pH调节剂，使凝胶辅料与水结合成胶状物质；S30、调节pH及水量将凝胶调整成合适稠度；S40、包装为成品。

本发明的有益效果是：1、中药浓缩液用的大部分都是解毒杀菌的中草药，没有特殊毒性；2、通过构建β-乳球蛋白的表达载体制备出的β-乳球蛋白，能够高效抗HPV病毒；3、使用多种具有清热解毒、除湿泄浊、抑菌杀菌功能的中药，辅以酸酐化β-乳球蛋白对糜烂受损组织的保护作用，在杀灭HPV病毒的同时将病毒与宿主隔离开来，再配合凝胶团聚分泌物，使病毒大量的排出体外；4、凝胶状药物能够附着于创面，使有效成分最大程度的渗入创面，进行针对性修复，同时保护创面不被其他病菌侵害，相较于液体剂型，能够更好地保障药物中的有效成分不随着溶液的流失而流失。

下面结合附图对本发明进行详细说明。

附图说明

图1 为表达鉴定结果。

具体实施方式

本发明提供了一种抗HPV凝胶，以质量百分比计包括中药浓缩液50-60%、β-乳球蛋白2-5%、凝胶辅料1-5%、余量为水。

上述的凝胶辅料为卡波姆940、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、魔芋粉、三氯生、丙三醇和吐温80中的一种或几种。

上述的中药浓缩液以质量百分比计包括：赤芍1-3%、蛇床子0.5-1.5%、黄柏1-3%、苦参0.5-1.5%、大黄0.5-1.5%、土茯苓1-3%、百部1-3%、金银花1-3%、千里光0.5-1.5%、马齿苋1-3%、蒲公英1-3%、余量为水。

HPV在中医认为是因脾肾亏损或正气不足引发的疾病。因为湿毒是阴邪，其性质是黏性的，侵入人体后难以行走。容易消耗健康的气血，导致脾肾衰竭，缺乏健康的气血。HPV通常在长期治疗后反复发作，主要与身体缺陷不能祛邪或不能祛邪有关。通过中药可以改善患者体质，增强身体抵抗能力，其核心在于清热解毒、扶正固本。

中药浓缩液中的中药均是具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗肿瘤和抑制免疫等功效的中药，可充分发挥各成分的药理功效。

赤芍：味苦，微寒。归肝经。功效：集凉血热、清肝火、散瘀血于一体，凡血热、血瘀、肝火，无论单发或并发皆可酌投，尤宜血热有瘀或血瘀有热或肝火夹瘀之疼痛者。

蛇床子：味苦、辛，性温，有小毒。功效：燥湿祛风，杀虫止痒，温肾壮阳。临床有抑菌、抗炎和抗诱变等作用。

黄柏：味苦，性寒。功效：清热燥湿，泻火解毒，除骨蒸。临床有抗炎、抗病毒、抑菌和抗溃疡等多种药理活性作用。

苦参：味苦，性寒。功效：清热燥湿，杀虫止痒，利尿。临床有抗炎、抑菌、抗病毒、抗肿瘤和抑制免疫等种药理活性作用。

大黄：性味苦，寒。归脾、胃、大肠经。功效：外用善清火、消肿、止痛、解毒而疗疮痈烫伤，又能疏下通便，有釜底抽薪之效。

土茯苓：味甘、淡，性平。功效：有解毒，除湿，通利关节之功效，主要用于梅毒及汞中毒所致的肢体拘挛，筋骨疼痛；湿热淋浊，带下，痈肿，瘰疬，疥癣。清热除湿，泄浊解毒。具有抗肿瘤、镇痛等作用。

百部：性甘苦，性微温。功效：润肺下气止咳，杀虫灭虱。临床有杀虫和抑菌等多种药理活性。研究表明，百部的主要活性成分为百部生物碱，有驱虫、杀虫、镇咳平喘、抗肿瘤和抗菌等作用。

金银花：味甘、性寒。功效：清热解毒，疏散风热。临床有抗炎、抗病毒、抗肿瘤及增强机体免疫力等作用。

千里光：药性苦，寒。归肺、肝经。功效：有清热解毒，明目，利湿的功效。用于痛肿疮毒，感冒发热，目赤肿痛，泄污痴疾，皮肤湿疹。

马齿苋：味酸、寒，归大肠、肝经。功效：清热，解毒，凉血，消肿，可治疗热毒泻痢，热淋血淋，赤白带下，崩漏，痔血痈肿，丹毒瘰疠，湿癣白秃等。

蒲公英：味苦、辛，性寒。功效：清热解毒，凉血消肿。临床上有抑菌消炎、增强免疫力和抑制肿瘤等药理功效。

本发明的另一创新点在于构建β-乳球蛋白的表达载体，从而制备出高效抗HPV病毒的β-乳球蛋白。通过转阴效果得到的其具有高效抗HPV病毒的作用（因为HPV病毒无法在体外培养，因此是通过反馈转阴率得出高效抗病毒的结论）。

本发明中的β-乳球蛋白可以是常规的β-乳球蛋白，还可以是以重组大肠杆菌表达菌株为发酵菌株进行液体发酵制备得到的β-乳球蛋白。本实施例中采用以重组大肠杆菌表达菌株为发酵菌株进行液体发酵制备得到的β-乳球蛋白。

细菌菌株和质粒：大肠杆菌XL1-Blue被用作克隆的宿主菌株，大肠杆菌BL21（DE3）（Stratagene）和Origami（DE3）被选作表达的宿主菌株。质粒pETDUET-1（Novagen）被用作表达载体，其具有两个单独的多克隆位点（MCS），每个克隆位点之前都有一个T7启动子/lac算子和一个核糖体结合位点（rbs），以促进两个靶基因的共表达。

表达载体的构建：对编码牛β-乳球蛋白同种型β（BlgB，UNP:P02754）和细菌二硫键异构酶DsbC（DsbC，UNP：P0AEG6）的基因进行化学合成，并优化其在大肠杆菌中的表达。在这两种情况下，负责蛋白质胞外定位的短序列被省略。将DsbC克隆到pETDuet-1载体（Invitrogen）的MCS I中，同时使用NcoI/HindIII和NdeI/KpnI内切酶组将BlgB引入pETDuet-1载体（Invitrogen）的MCS II中。在转化之前，对修饰载体pETDuet-1/DsbC/BlgB进行测序，以证明在克隆过程中没有发生移码或突变。

重组大肠杆菌表达菌株的制备步骤如下：

（1）将源自编码牛β-乳球蛋白同种型β（BlgB，UNP:P02754）的目的基因及源自细菌二硫键异构酶DsbC的帮助表达基因，分两步依次克隆至表达载体pETDUET-1，载体构建完成后，转化DH5α大肠杆菌，摇瓶培养，得到质粒。

上述目的基因的序列为：MLIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQSAPLRVYVEELKPTPEGDLEILLHKWENGECAQKKIIAEKTKIPAVFKIDALNENKVLVLDTDYKKYLLFCMENSAEPEQSLACQCLVRTPEVDDEALEKFDKALKALPMHIRLSFNPTQLEEQCHIHHHHHH*。

上述帮助表达基因的序列为：MDDAAIQQTLAKMGIKSSDIQPAPVAGMKTVLTNSGVLYITDDGKHIIQGPMYDVSGTAPVNVTNKMLLKQLNALEKEMIVYKAPQEKHVITVFTDITCGYCHKLHEQMADYNALGITVRYLAFPRQGLDSDAEKEMKAIWCAKDKNKAFDDVMAGKSVAPASCDVDIADHYALGVQLGVSGTPAVVLSNGTLVPGYQPPKEMKEFLDEHQKMTSGK*。

（2）将所得的质粒转化大肠杆菌Rosetta-gami2（DE3）感受态细胞，获得重组大肠杆菌表达菌株。

上述β-乳球蛋白的制备包括如下步骤：

（a）将转化验证成功的重组大肠杆菌表达菌株单菌落活化于含50-100μg/ml A

（b）次日按1:100扩大接种于含50-100μg/ml A

（c）加入IPTG至终浓度为0.3-0.8mM，16-25℃ 120-180r/min过夜培养，诱导融合蛋白表达。

（d）3000-8000×g室温离心10min，弃上清，用PBS（PH7.2-7.4）重悬菌体沉淀；重悬液进行超声破碎后，12000r/min、4℃离心10min，取上清，并用0.45um滤膜过滤。

（e）利用AKTA纯化系统，以0.1-1.5ml/min流速上样至PBS-0.5M NaCl-20mM 咪唑，pH7.5预平衡的Ni亲和层析柱。

（f）用PBS-0.5M NaCl-20mM 咪唑，pH7.5以2-5ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线。

（g）用PBS-0.5M NaCl-0.5M 咪唑，pH7.5以2-5ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液，得到β-乳球蛋白。

（h）用10kDa超滤管进行超滤，将高盐缓冲液替换为PBS缓冲液，并进行15% SDS-PAGE分析。

实验结果如图1所示（泳道M：Protein Marker； 泳道1：诱导前样品；泳道2~6：诱导后样品），经条件优化，通过SDS-PAGE与WesternBlot检测，目的蛋白表达正常。

用SDS-PAGE（15%丙烯酰胺）对各组分进行分析，并将含有BLG的组分在50 mM磷酸钠（pH 7.5，4℃）中混合和透析过夜。在低pH下进行NaCl分馏之前，首先将透析样品中蛋白质的浓度（通过280 nm处的吸光度估计）调整为 1mg/mL。再向样品中滴加0.1 M HCl，并在室温下连续搅拌，以达到2.6的pH值，然后将NaCl添加到最终浓度7%（w/v）。在这些条件下变性的污染大肠杆菌蛋白质通过30392xg离心去除，并回收含有BLG的上清液。然后将溶液中NaCl的最终浓度调整为30%（w/v），以预沉淀BLG，并在30392xg下重新离心分离悬浮液。将所得颗粒重新悬浮在pH 6.5的少量50 mM磷酸钾缓冲液中，并进行尺寸排除色谱（Superdex7510/300 GL，GE Healthcare）在50 mM磷酸钾中，pH值2.6，流速为0.5 mL/min。通过超滤（Vivaspin 20，10 kDa MWCO，Vivascience）将含有纯单体BLG的0.3 mL峰值压裂液汇集并浓缩至约18 mg/mL（1 mM）。根据280 nm处的吸光度测定蛋白质浓度，假设BLG摩尔消光系数e280为17600 M-1 cm-1。采用该方案，BLG的收率应在5mg/L以上。

本发明还提供了一种抗HPV凝胶的制备工艺，包括如下步骤：S10、将中药浓缩液、β-乳球蛋白以及凝胶辅料充分混匀；S20、向混合物中加入纯净水并缓慢加入pH调节剂，使凝胶辅料与水结合成胶状物质；S30、调节pH（最终PH值为4.5-6.5）及水量将凝胶调整成合适稠度；S40、包装为成品。

本发明的抗HPV凝胶的临床抗HPV效果如下。

实施例1：24岁，女性，接种HPV九价疫苗，感染39、66型hpv病毒，患处使用本专利凝胶，每次2g，每周2次，连续使用7周后复查结果转阴。

实施例2：38岁，女性，未接种HPV疫苗，工作原因长期饮食不规律作息不规律免疫力下降，感染31型、82型hpv病毒,患处使用本专利凝胶，每次2g，每周3次，连续使用5周后复查结果转阴。

实施例3：27岁，女性，接种HPV四价疫苗，感染52型hpv病毒，患处使用本专利凝胶，每次2g，每周2次，连续使用11周后复查结果转阴。

实施例4：寻找到感染HPV病毒的30位女性，年龄22-35岁，以每次2g，每周3次的频率在患处使用本专利凝胶，跟踪使用8周，每周复查，结果如下表所示：

。

由结果可得出，本发明的凝胶在帮助HPV病毒患者转为阴性有一定效果，转阴率为73.3%以上。

最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。