一种胶原蛋白提取物、组合物、制备方法及应用

技术领域

本发明属于胶原蛋白功能研究技术领域，具体涉及一种胶原蛋白提取物、组合物、制备方法及应用。

背景技术

目前，社会上普遍关注的是酒精对肝脏造成的损伤，实际上，酒精摄入过量不仅对肝脏造成损害，而且对胃肠道也有直接和间接的影响。胃肠道是人体消化系统中重要的器官，在机体物质代谢中占据不可取代的重要地位。胃肠道的内壁均有一层粘膜组织，作为天然的屏障，对胃肠道的保护意义重大。但粘膜本身很脆弱，再加上环境、饮食、情绪变化、生活节奏等外界因素，容易使其受损。若长期受损，会导致急慢性胃肠炎、溃疡，甚至肿瘤。以酒精为例，酒精可以溶于脂质从而进入胃壁内，胃液中氢离子回渗入粘膜上皮细胞，导致组胺、5-羟色胺和肝素释放，引起粘膜下动脉短路，毛细血管压力升高与通透性增加，出现粘膜充血、红细胞渗出、胃粘膜糜烂出血等胃粘膜损伤。酒精对小肠的影响主要是引起十二指肠和空肠绒毛肿胀，表面皱襞消失，粘膜上皮细胞的微绒毛密度降低。

胶原蛋白是细胞外基质中最重要的组成部分，是构成动物支持组织的结构蛋白，广泛分布于人体的皮肤、头发、关节、肌腱和软骨等地方。同时胶原蛋白也表现出很好的可消化性，胶原蛋白是细胞外基质中最重要的组成部分，是构成动物支持组织的结构蛋白，广泛分布于人体的皮肤、头发、关节、肌腱和软骨等地方。

目前胶原蛋白多以美白和抗衰老的作用被添加到市售产品中。因此，探究胶原蛋白的更多功能是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

针对现有技术中的问题，本发明提供了一种胶原蛋白提取物、组合物、制备方法及应用。

在一方面，本发明提供了一种胶原蛋白提取物在制备组合物中的应用，所述组合物用于胃肠道炎症的消退和胃肠粘膜损伤的辅助保护。

进一步的，其中胶原蛋白提取物采用以下方法制备，包括以下步骤：

步骤A：对牛跟腱进行脱脂，得到脱脂后的牛跟腱；

步骤B：对脱脂后的牛跟腱进行酶解，得到酶解液；

步骤C：对得到的酶解液进行离心处理；

步骤D：对步骤C得到的离心处理后的酶解液进行透析，得到胶原蛋白提取物原液。

采用该技术方案后，I型胶原蛋白是最普遍存在的胶原蛋白，占人体胶原蛋白总量的90％，占总蛋白质质量的近20％，主要存在于皮肤、骨和肌腱，主要起到支撑和保水的作用，牛跟腱处I型胶原蛋白含量高且纯，胶原蛋白是大分子，其次配合酶解的胶原蛋白提取方法，保证了胶原蛋白的三螺旋结构，从而保证了蛋白活性，比如侧链基团的反应活性、与酸碱盐之间的作用，当刺激物接触到胶原蛋白时，会与胶原蛋白之间相互作用，进而消耗以及包覆刺激物，从而达到降低对胃肠道及粘膜的保护这样会在胃粘膜上形成一层保护膜，从而起到胃肠道炎症的消退和胃肠粘膜损伤的辅助保护。

进一步的，步骤A中所述牛跟腱为新鲜牛跟腱，且在对牛跟腱进行脱脂处理之前先除去牛跟腱上的软组织，并对除去软组织后的牛跟腱进行清洗和绞碎。

进一步的，步骤A中对牛跟腱进行脱脂时先将牛跟腱放入浓度为1-5％的NaHCO

进一步的，步骤B中进行酶解时，先使用浓度为0.4-0.6mo l/L的醋酸溶液对牛跟腱进行浸泡1-2h，然后再加入胃蛋白酶对牛跟腱进行酶解，胃蛋白酶与牛跟腱的质量比为1：20—1：10，酶解的时间为1-36h。

采用该技术方案后，醋酸溶液可以使胶原蛋白解螺旋，有利于胃蛋白酶起作用；同时在酸性条件下胃蛋白酶的活性最高，胃蛋白酶提取胶原蛋白条件温和，不仅可以水解掉胶原纤维蛋白的末端肽，提高胶原蛋白的产率，而且还不会破坏胶原蛋白的三螺旋结构，能够保持其优良的物理和生化特性。

进一步的，步骤D中采用透析袋进行透析，且透析袋的截留分子量为1K-5KDa

在一方面，本发明提供了一种用于胃肠道炎症的消退和胃肠粘膜损伤的辅助保护的胶原蛋白提取物。

在一方面，本发明提供了一种胶原蛋白提取物的制备方法，包括以下步骤：

步骤A：对牛跟腱进行脱脂，得到脱脂后的牛跟腱；

步骤B：对脱脂后的牛跟腱进行酶解，得到酶解液；

步骤C：对得到的酶解液进行离心处理；

步骤D：对步骤C得到的离心处理后的酶解液进行透析，得到胶原蛋白提取物原液。

进一步的，步骤B中进行酶解时，先使用浓度为0.4-0.6mo l/L的醋酸溶液对牛跟腱进行浸泡1-2h，然后再加入胃蛋白酶对牛跟腱进行酶解，胃蛋白酶与牛跟腱的质量比为1：20—1：10，酶解的时间为1-36h；

步骤D中采用透析袋进行透析，且透析袋的截留分子量为1K-5KDa。

在一方面，本发明提供了一种胶原蛋白提取物的组合物，包括以下重量份数的组分：胶原蛋白提取物1.0-5.0份，维生素C 0.5-3.5份，山梨酸钾0.05-1.0份，柠檬酸0.01-0.05份，余量为水，所述组合物用于胃肠道炎症的消退和胃肠粘膜损伤的辅助保护。

采用该技术方案后，维生素C为营养强化剂，柠檬酸为酸度调节剂，山梨酸钾为防腐剂。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1.本发明中采用醋酸和胃蛋白酶结合使用的工艺来提取牛跟腱胶原蛋白，通过此方法提取得到的胶原蛋白能够保留其完整的三螺旋结构。

2.本发明制备牛跟腱胶原蛋白纯度高，无腥味，液体质地均匀无沉淀物，无苦涩味。

3.本发明组合物中的原料均容易获得，成本低。

4.本发明组合物配方精简，具有胃肠道炎症消退功效和胃肠粘膜损伤辅助保护功效。

附图说明

图1为本发明的样品处理后斑马鱼肠道中性粒细胞数量典型图，其中虚线区域为分析区域胃肠道。

图2为本发明的样品处理后斑马鱼肠道中性粒细胞数量柱状图。

图3为本发明的样品处理后斑马鱼肠腔面积分析示意图，其中虚线区域为分析区域胃肠道。

图4为本发明的样品处理后斑马鱼肠腔面积典型图，其中虚线区域为分析区域胃肠道。

图5为本发明的样品处理后斑马鱼肠腔面积柱状图。

具体实施方式

为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1

一种胶原蛋白提取物的制备方法，包括以下步骤：

步骤A:将新鲜的牛跟腱去除软组织后用纯化水清洗，然后将牛跟腱剪成小段(3cm左右)，开启绞肉机，将牛跟腱逐个放入绞碎。将1％的NaHCO

步骤B:将步骤A处理好的牛跟腱转运至反应釜内，使用0.5mo l/L的醋酸溶液进行浸泡1小时，然后向反应釜中按照1：15的比例加入胃蛋白酶，待完全溶解后，开启搅拌机，缓慢搅拌24h。

步骤C:待步骤B酶解反应完后，转移酶解液至沉降离心机中，在8000r/min下离心30min，重复上述操作至酶解液分离完成。

步骤D:将步骤C中得到的酶解液分装入截留分子量为1K Da的透析袋中后置入透析槽中，注入纯化水至透析槽指定液位，盖上透析槽盖，透析完成后，得到含有胶原蛋白提取物的原液。

实施例2

一种胶原蛋白提取物的制备方法，包括以下步骤：

步骤A:将新鲜的牛跟腱去除软组织后用纯化水清洗，然后将牛跟腱剪成小段(3cm左右)，开启绞肉机，将牛跟腱逐个放入绞碎。将1％的NaHCO

步骤B:将步骤A处理好的牛跟腱转运至反应釜内，使用0.6mo l/L的醋酸溶液进行浸泡1小时，然后向反应釜中按照1：10的比例加入胃蛋白酶，待完全溶解后，开启搅拌机，缓慢搅拌24h。

步骤C:待步骤B酶解反应完后，转移酶解液至沉降离心机中，在8000r/min下离心30min，重复上述操作至酶解液分离完成。

步骤D:将步骤C中得到的酶解液分装入截留分子量为1K Da的透析袋中后置入透析槽中，注入纯化水至透析槽指定液位，盖上透析槽盖，透析完成后，得到含有胶原蛋白提取物的原液。

实施例3

一种胶原蛋白提取物的制备方法，包括以下步骤：

步骤A:将新鲜的牛跟腱去除软组织后用纯化水清洗，然后将牛跟腱剪成小段(3cm左右)，开启绞肉机，将牛跟腱逐个放入绞碎。将1％的NaHCO

步骤B:将步骤A处理好的牛跟腱转运至反应釜内，使用0.4mo l/L的醋酸溶液进行浸泡1小时，然后向反应釜中按照1：20的比例加入胃蛋白酶，待完全溶解后，开启搅拌机，缓慢搅拌24h。

步骤C:待步骤B酶解反应完后，转移酶解液至沉降离心机中，在8000r/min下离心30min，重复上述操作至酶解液分离完成。

步骤D:将步骤C中得到的酶解液分装入截留分子量为1K Da的透析袋中后置入透析槽中，注入纯化水至透析槽指定液位，盖上透析槽盖，透析完成后，得到含有胶原蛋白提取物的原液。

实施例4

一种含有实施例1制备的胶原蛋白提取物的组合物所述组合物包括以下重量份数的组分：胶原蛋白提取物3份，维生素C 2份，山梨酸钾0.5份，柠檬酸0.02份，余量为水；

所述组合物的制备方法包括以下步骤：

将实施例1中得到的胶原蛋白原液稀释到10mg/mL，然后根据配方要求将胶原蛋白溶液、维生素C、山梨酸钾、柠檬酸和水一起加入到配料釜中搅拌得到最终的组合物。

斑马鱼缺乏单独的器官胃，但其体内表达了几种消化酶，这些酶在功能上与哺乳动物的胃标志物相同，包括肾素、三磷酸蛋白酶、几种组织蛋白酶和脂肪酶。斑马鱼肠道结构与哺乳动物相似，分为前肠、中肠和后肠。前肠和中肠类似于小肠，主要参与营养物质的吸收；后肠主要参与水分吸收，类似于大肠。斑马鱼的肠道分为粘膜层(上皮层、固有层)、肌肉层和浆膜层，与人类比较，缺少粘膜下层。斑马鱼的肠道细胞，与哺乳动物一致，存在上皮细胞、内分泌细胞、杯状细胞、神经元细胞和Caja l间质细胞等细胞，但缺乏帕内特细胞和年末淋巴小结相关上皮细胞。因此，斑马鱼的胃肠道与人类高度相似，在斑马鱼上开展的胃肠道保护效果评价预测性强。因此，本发明选用斑马鱼作为实验动物评价组合物的效果。

使用的野生型AB品系斑马鱼或转基因中性粒细胞荧光斑马鱼饲养于28℃的养鱼用水中，水质为每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450～550μS/cm，pH为6.5～8.5，硬度为50～100mg/L CaCO3。

转基因中性粒细胞绿色荧光MPX品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后3天(3dpf)的斑马鱼用于组合物胃肠粘膜损伤辅助保护功效最大检测浓度(MTC)测定及其功效评价。

对实施例2制备的组合物的MTC测定实验

实验步骤如下：随机选取3dpf转基因中性粒细胞绿色荧光MPX品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予三硝基苯磺酸(TNBS)建立斑马鱼胃肠粘膜损伤模型。28℃处理2天后，移除TNBS，水溶给予组合物(浓度见表1)，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。28℃继续处理2天后，测定组合物对模型斑马鱼的MTC。

表1组合物胃肠粘膜损伤辅助保护功效浓度摸索实验结果(n＝30)

在本实验条件下，组合物胃肠粘膜损伤辅助保护功效MTC为125μL/mL。

对实施例2制备的组合物的胃肠道炎症消退功效评价实验

实验步骤如下：随机选取3dpf转基因中性粒细胞绿色荧光MPX品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予TNBS建立斑马鱼胃肠粘膜损伤模型。28℃处理2天后，移除TNBS，水溶给予组合物(浓度见表2)，阳性对照泼尼松15.0μg/mL，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。28℃继续处理2天后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，用NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼肠道中性粒细胞数量，以该指标的统计学分析结果评价组合物胃肠道炎症消退功效。统计学处理结果采用mean±SE表示。用SPSS26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。

表2组合物胃肠道炎症消退功效评价实验结果(n＝10)

与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001

胃肠粘膜损伤时，中性粒细胞作为一线的免疫细胞从循环系统募集到胃肠道炎症部位，清除病原体，表现为胃肠道内中性粒细胞增多。具有胃肠道炎症消退效果的样品会使胃肠道内中性粒细胞减少，表现为黄色区域内绿色荧光颗粒减少。由表2、图1和图2可见，该组合物具有胃肠道炎症消退功效。

对实施例2制备的组合物的胃肠粘膜损伤辅助保护功效评价实验

实验步骤如下：随机选取3dpf转基因中性粒细胞绿色荧光MPX品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予TNBS建立斑马鱼胃肠粘膜损伤模型。28℃处理2天后，移除TNBS，水溶给予组合物(浓度见表3)，阳性对照泼尼松15.0μg/mL，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。28℃继续处理2天后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于解剖显微镜下拍照，用NIS-E lements D 3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼肠腔面积，以该指标的统计学分析结果评价组合物胃肠粘膜损伤辅助保护功效。统计学处理结果采用mean±SE表示。用SPSS 26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。

表3组合物胃肠粘膜损伤辅助保护功效评价实验结果(n＝10)

与模型对照组比较，**p<0.01，***p<0.001

胃肠粘膜损伤时，会累及胃肠道肌层及肠肌神经丛，胃肠壁张力减退、蠕动消失，胃肠内容物与气体积聚，引起胃肠腔扩张，表现为胃肠道面积增大。具有胃肠粘膜损伤修复效果的样品会使胃肠道面积缩小，表现为图1示例中虚线区域面积减小。由表3、图3、图4和图5可见，该组合物具有胃肠粘膜损伤辅助保护功效，实施例2-3制备的胶原蛋白采取与实施例4相同的方法检测其效果后，效果相似。

以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。