一种用于心脑血管疾病的中药组合物

技术领域

本发明属于中医药和医学领域，具体涉及一种用于心脑血管疾病的中药组合物。

背景技术

随着生活方式的转变和人口老龄化，心脑血管疾病已成为威胁我国人群健康的首要公共卫生问题。根据最新统计数据，我国城市和农村居民因心脑血管疾病导致的死亡已分别达到总死亡的43.8％和46.7％，心脑血管疾病治疗的临床需求远未得到满足。

中医药治疗心脑血管疾病有一定优势，现有技术已经公开了很多这方面的药物或组合物。如公开号CN111437350A(公开日2020年7月24日)的中国发明专利申请，公开了一种治疗心脑血管疾病的中药制剂，原料组成为人参、黄芪、丹参、地龙、水蛭、当归、延胡索、白芍、余甘子、川芎、蒲黄、桃仁、天麻、银杏叶、山楂、葛根、决明子和蜂蜜。再如公开号CN1985965A(公开日2007年6月27日)的中国发明专利申请，公开了一种治疗冠心病、脑血栓的药物，以益母草、银杏叶、黄芪、人参、丹参、赤勺、三七、当归、桃仁、红花、葛根、地龙、乳香、没药、血竭、土虫、水蛭、山楂、川芎、桂枝、天麻、僵虫、乌蛇、全蝎、蜈蚣等药物为原料。

但是现有技术中公开的药物或中药组合物，一般都组方复杂，少则十几味，多则几十味；不仅增加患者负担，而且不便于制剂。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种治疗心脑血管疾病的中药组合物。本发明的中药组合物组方简洁、疗效确切。

为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：

一种治疗心脑血管疾病的中药组合物I，原料包括如下重量份的中药材：

黄芪400-700重量份，三七200-400重量份，银杏叶500-800重量份，水蛭100-350重量份，地龙150-350重量份，冰片1-10重量份。

优选地，所述中药组合物I的原料包括如下重量份的中药材：

黄芪450-650重量份，三七200-350重量份，银杏叶500-700重量份，水蛭200-350重量份，地龙200-350重量份，冰片3-8重量份。

更优选地，所述中药组合物I的原料包括如下重量份的中药材：

黄芪500-600重量份，三七200-300重量份，银杏叶500-600重量份，水蛭300-350重量份，地龙250-350重量份，冰片5-7重量份。

作为一个优选的实施方案，本发明提供一种治疗心脑血管疾病的中药组合物I，原料由黄芪、三七、银杏叶、水蛭、地龙和冰片组成，各药材的重量份如前所定义。

本发明还提供一种治疗心脑血管疾病的中药组合物II，包括如下重量份的原料：

黄芪提取物50-120重量份，三七总皂苷20-40重量份，银杏叶提取物10-30重量份，水蛭提取物20-50重量份，地龙提取物25-60重量份，冰片1-10重量份；

其中，所述黄芪提取物通过如下方法制备：

取黄芪，加水煎煮三次，每次加5-10倍于黄芪重量的水，每次煎煮1-2小时；趁热过滤，合并滤液，滤液浓缩至每1ml相当于黄芪1-2g；加乙醇使含醇量为75％，冷藏放置12小时，取上清液，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至无醇味，加入糊精，使浸膏相对密度为1.03-1.05(40℃)，喷雾干燥，得到黄芪提取物；

所述三七总皂苷通过如下方法制备：

取三七，适当粉碎，用90％乙醇提取两次，第1次加2.5倍于三七重量的90％乙醇，回流提取10小时，第2次加2倍量90％乙醇，提取5小时；趁热过滤，合并滤液，回收乙醇至无乙醇味，加水稀释至浓度相当于0.25g生药/ml，搅匀，静置，滤过；滤液过大孔吸附树脂柱，用水冲洗，继用80％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至稠膏状、干燥，粉碎，得到三七总皂苷；

所述银杏叶提取物通过如下方法制备：

取银杏叶，加65％乙醇回流提取两次，每次加4-5倍于银杏叶重量的65％乙醇，每次1-2小时，趁热过滤，合并滤液；先用40％氢氧化钠溶液调pH值至7.5-8.0，静置12小时，过滤，再用10％盐酸溶液调pH值至5.0-6.0，回收乙醇至无醇味，按照每1g银杏叶5ml纯化水的比例加入纯化水，搅拌均匀，10％盐酸调pH值至4.0-4.5，离心，滤过，滤液过大孔吸附树脂柱，用水冲洗，继用20％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至稠膏状、干燥，得到银杏叶提取物；

所述水蛭提取物通过如下方法制备：

取水蛭，加水煎煮提取两次，每次加5-10倍于水蛭重量的水，每次1-2小时，趁热过滤，合并滤液；滤液减压浓缩至相对密度为1.10-1.20(35-40℃)，真空干燥，待浸膏粘稠时，加入水蛭重量18％-23％，优选20％的玉米淀粉，混合、干燥、粉碎，过80目筛，得到水蛭提取物；

所述地龙提取物通过如下方法制备：

取地龙，加水煎煮两次，每次加5-10倍于地龙重量的水，每次1-2小时，趁热过滤，合并滤液；滤液减压浓缩至相对密度为1.10-1.20(35-40℃)，真空干燥，待浸膏粘稠时，加入地龙重量13％-15％，优选14％的玉米淀粉，混合、干燥、粉碎，过80目筛，得到地龙提取物。

优选地，所述三七总皂苷的制备中，大孔树脂为D101大孔树脂，树脂用量为三七重量的0.6-1.5倍量，优选4/3倍量。

还优选地，所述三七总皂苷的制备中，冲洗用水的体积与大孔树脂重量比为2-4ml:1g，更优选为3ml:1g。

还优选地，所述三七总皂苷的制备中，80％乙醇的体积与大孔树脂重量比为1-2ml:1g，更优选为1ml:1g。

优选地，所述银杏叶提取物的制备中，大孔树脂为HPD450，树脂用量是银杏叶重量的0.5-2倍量，优选1倍量。

优选地，所述银杏叶提取物的制备中，冲洗用水的体积与大孔树脂重量比为1-2ml:1g，更优选为1ml:1g。

还优选地，所述银杏叶提取物的制备中，20％乙醇的体积与大孔树脂重量比为1-3ml:1g，更优选为1.5-2ml:1g。

优选地，所述中药组合物II包括如下重量份的原料：

所述黄芪提取物60-100重量份，所述三七总皂苷20-35重量份，所述银杏叶提取物10-25重量份，所述水蛭提取物25-50重量份，所述地龙提取物30-60重量份，冰片3-8重量份。

更优选地，所述中药组合物II包括如下重量份的原料：

所述黄芪提取物70-90重量份，所述三七总皂苷20-30重量份，所述银杏叶提取物10-20重量份，所述水蛭提取物30-50重量份，所述地龙提取物40-60重量份，冰片5-7重量份。

作为一个优选的实施方案，本发明提供一种用于治疗心脑血管疾病的中药组合物II，原料由所述黄芪提取物、所述三七总皂苷、所述银杏叶提取物、所述水蛭提取物、所述地龙提取物和冰片组成，各原料的重量份如前所定义。

本发明还有一个目的在于提供一种药物，包括上述中药组合物I或上述中药组合物II，还包括或不包括药学上可以接受的辅料。

所述药物是临床上可以接受的任意一种制剂，优选为口服制剂。

优选地，所述口服制剂选自汤剂、散剂、胶囊剂、片剂、蜜丸剂、水蜜丸剂、水丸剂、浓缩丸剂、糊丸剂、蜡丸剂、颗粒剂、口服液和滴丸剂中的一种或多种，更优选为颗粒剂、片剂和/或胶囊剂，最优选为颗粒剂和/或胶囊剂。

本发明还提供上述药物的制备方法，包括按照所述重量份准备各中药材或原料，按照本领域常规方法，加入或不加入药学上可以接受的辅料，制备成临床上可以接受的制剂。

本发明所述药学上可以接受的辅料，包括但不限于：(1)稀释剂，例如淀粉、糖粉、糊精、乳糖、预胶化淀粉、微晶纤维素、无机钙盐(如硫酸钙、磷酸氢钙、药用碳酸钙等)、甘露醇、植物油、聚乙二醇等；(2)粘合剂，例如蒸馏水、乙醇、淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素和乙基纤维素、羟丙甲纤维素等；(3)崩解剂，例如干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠等；(4)润滑剂，例如硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇类、月桂醇硫酸镁等。

作为一个优选的实施方案，本发明提供一种用于治疗心脑血管疾病的颗粒剂的制备方法，包括如下操作：

按照前述中药组合物I准备黄芪、三七、银杏叶、水蛭、地龙和冰片；冰片粉碎成细粉；其余5味加水煎煮1-3次，每次加5-10倍于药材总重量的水，每次煎煮1-2小时；趁热过滤，合并滤液；滤液浓缩至相对密度1.05-1.10(60℃)，加入部分糊精，混匀，喷雾干燥，再加入剩余糊精及冰片细粉，混匀，干法制粒，即得；其中糊精的总重量是药材总重量的30％-50％。

优选地，黄芪、三七、银杏叶、水蛭和地龙加水煎煮两次，第一次加10倍于药材总重量的水，煎煮1小时；第二次加8倍于药材总重量的水，煎煮1小时。

作为一个优选的实施方案，本发明提供一种用于治疗心脑血管疾病的胶囊剂的制备方法，包括如下步骤：

按照前述中药组合物II准备所述黄芪提取物、三七总皂苷、银杏叶提取物、水蛭提取物、地龙提取物和冰片；将所述重量份的冰片粉碎成细粉，过80目筛，与所述黄芪提取物、三七总皂苷、银杏叶提取物、水蛭提取物和地龙提取物混合均匀，再加入药学上可以接受的辅料至规定重量，混合均匀，干法制粒，装胶囊，即得。

优选地，所述药学上可以接受的辅料为微晶纤维素。

此外，本发明还有一个目的在于提供上述中药组合物I、上述中药组合物II、上述药物、上述颗粒剂或上述胶囊剂在制备治疗心脑血管疾病的药物中的应用。

本说明书中，各味中药材的“重量份”表示的是各味中药材之间的用量配比关系，而非实际的质量单位。根据实际情况，单位重量份可以是任意质量，如1重量份可以是1g、500g或1kg，甚至可以是15g、30g等。

本说明书中，如无特殊说明，“乙醇”浓度均为体积百分比浓度，所述“乙醇”为体积百分比浓度95％-100％的乙醇。除乙醇溶液外，其它溶液，如40％氢氧化钠溶液、10％盐酸溶液，其浓度均为质量百分比浓度。

本说明书中，所述“纯化水”是指经过蒸馏、去离子等处理得到的水。

本说明书中，所述“生药”或“生药量”可以互换，都是指以中药材为原料制备提取物或者临床上可以接受的制剂时，所投入的药材的总重量(质量)。

附图说明

以下结合附图，对本发明作进一步的说明。

图1：研究例3的空白对照组大鼠心脏切片经HE染色后的显微照片；其中，左侧的A图放大20倍，右侧的B图放大200倍。

图2：研究例3的模型对照组大鼠心脏切片经HE染色后的显微照片；其中，左侧的A图放大20倍，右侧的B图放大200倍。

图3：研究例3的阳性对照组大鼠心脏切片经HE染色后的显微照片；其中，左侧的A图放大20倍，右侧的B图放大200倍。

图4：研究例3的试验高剂量组大鼠心脏切片经HE染色后的显微照片；其中，左侧的A图放大20倍，右侧的B图放大200倍。

图5：研究例3的试验中剂量组大鼠心脏切片经HE染色后的显微照片；其中，左侧的A图放大20倍，右侧的B图放大200倍。

图6：研究例3的试验低剂量组大鼠心脏切片经HE染色后的显微照片；其中，左侧的A图放大20倍，右侧的B图放大200倍。

图7：研究例4的各组大鼠大脑TTC染色后的照片。

图8：研究例4的空白对照组大鼠大脑组织切片经HE染色后的显微照片；其中，左侧的A图放大20倍，右侧的B图放大200倍。

图9：研究例4的模型对照组大鼠大脑切片经HE染色后的显微照片；其中，左侧的A图放大20倍，右侧的B图放大200倍。

图10：研究例4的阳性对照组大鼠大脑切片经HE染色后的显微照片；其中，左侧的A图放大20倍，右侧的B图放大200倍。

图11：研究例4的试验高剂量组大鼠大脑切片经HE染色后的显微照片；其中，左侧的A图放大20倍，右侧的B图放大200倍。

图12：研究例3的试验中剂量组大鼠大脑切片经HE染色后的显微照片；其中，左侧的A图放大20倍，右侧的B图放大200倍。

图13：研究例3的试验低剂量组大鼠大脑切片经HE染色后的显微照片；其中，左侧的A图放大20倍，右侧的B图放大200倍。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。其中，部分试剂和药材购买情况如下：

黄芪：豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根。购自亳州神农谷中药控股有限公司。

三七：五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根。购自亳州神农谷中药控股有限公司。

地龙：钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum(E.Perrier)的干燥体。购自安徽鹤年堂中药饮片有限公司。

水蛭：水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigra Whitman的干燥全体。购自安徽鹤年堂中药饮片有限公司。

银杏叶：银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥叶。购自亳州神农谷中药控股有限公司。

冰片：购自安徽铜陵冰片厂。

实施例1

本实施例所述中药组合物I的组成为(1重量份＝1g)：

黄芪700重量份，三七400重量份，银杏叶800重量份，水蛭100重量份，地龙150重量份，冰片10重量份。

实施例2一种用于治疗心脑血管疾病的中药组合物I

本实施例所述中药组合物I的组成为(1重量份＝1g)：

黄芪450重量份，三七350重量份，银杏叶700重量份，水蛭重量200份，地龙200重量份，冰片3重量份。

实施例3

本实施例所述中药组合物I的组成为(1重量份＝1g)：

黄芪600重量份，三七200重量份，银杏叶500重量份，水蛭350重量份，地龙350重量份，冰片7重量份。

实施例4

本实施例所述中药组合物I的组成为(1重量份＝1g)：

黄芪500重量份，三七300重量份，银杏叶600重量份，水蛭300份，地龙250重量份，冰片5重量份。

实施例5

本实施例所述中药组合物I的组成为(1重量份＝1g)：

黄芪550重量份，三七250重量份，银杏叶550重量份，水蛭330重量份，地龙300重量份，冰片6重量份。

实施例6

取实施例5所述的中药组合物I；将冰片粉碎成细粉；其余5味加水煎煮2次，第一次加10倍于药材总重量的水，煎煮1小时，滤过；第二次加8倍于药材总重量的水，煎煮1小时，滤过，合并滤液，滤液浓缩至相对密度1.05～1.10(60℃)，加入投料量5％的糊精，混匀，喷雾干燥，得喷干粉。再加入计算量糊精及所述冰片细粉，混匀，干法制粒，共制成1000g，分装，每袋装2g。

实施例7

1.黄芪提取物的制备

取黄芪，加水煎煮三次，第一次加8倍于黄芪重量的水，浸泡30分钟，煎煮1.5小时；第二次加6倍于黄芪重量的水，煎煮1.5小时；第三次加5倍于黄芪总重量的水，煎煮1.5小时，趁热过滤，合并滤液；滤液浓缩至每1ml相当于黄芪1－2g(相对密度：1.14～1.23(40℃))，加乙醇使含醇量为75％，冷藏放置12小时，取上清液，滤过；滤液回收乙醇并浓缩至无醇味，加入约黄芪总重量10％的糊精，使浸膏的相对密度为1.03-1.05(40℃)，喷雾干燥，得到黄芪提取物；

2.三七总皂苷的制备

取三七，适当粉碎，用90％乙醇提取两次，第1次加2.5倍于三七重量的90％乙醇，回流提取10小时，第2次加2倍量90％乙醇，提取5小时；趁热过滤，合并滤液，回收乙醇至无乙醇味，加水稀释至药液浓度相当于0.25g生药/ml，搅匀，静置，滤过；滤液过D101大孔吸附树脂柱，按照每1g大孔树脂用3ml水的比例，用水冲洗大孔树脂柱，继用80％乙醇洗脱(每1g大孔树脂用1ml 80％乙醇)，收集洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至稠膏状、干燥，粉碎，得到三七总皂苷；

3.银杏叶提取物的制备

取银杏叶，用65％乙醇回流提取两次；第一次加入5倍于银杏叶重量的65％乙醇，浸泡2小时，回流提取2小时；第二次加入4倍于银杏叶重量的65％乙醇，回流提取1.5小时；趁热过滤，合并滤液；先用40％氢氧化钠溶液调pH值至7.5-8.0，静置12小时，过滤，再用10％盐酸溶液调pH值至5.0-6.0，回收乙醇至无醇味，加纯化水稀释(每1g银杏叶用5ml纯化水)，搅拌均匀，10％盐酸调pH值至4.0-4.5，离心，滤过，滤液过HPD450大孔吸附树脂柱(树脂与银杏叶的重量比为1:1)，按照每1g大孔树脂用1ml水的比例用水冲洗，继用20％乙醇洗脱(每1g大孔树脂用1.5ml 20％乙醇)，收集洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至稠膏状、干燥，得到银杏叶提取物；

4.水蛭提取物的制备

取水蛭，加水煎煮两次，第一次加入10倍于水蛭重量的水，浸泡30分钟，煎煮2小时，过滤；第二次加入8倍于水蛭重量的水，浸泡1小时，过滤，合并滤液；滤液减压浓缩至相对密度为1.10-1.20(35～40℃)，继续在70℃下真空干燥，待浸膏至粘稠时，加入约水蛭重量20％的玉米淀粉，混合、干燥、粉碎，过80目筛，得到水蛭提取物；

5.地龙提取物的制备

取地龙，加水煎煮两次，第一次加入10倍于地龙重量的水，浸泡20分钟，煎煮2小时，过滤；第二次加入8倍于地龙重量的水，煎煮1小时，过滤，合并滤液；滤液减压浓缩至相对密度为1.10-1.20(35-40℃)，继续在70℃下真空干燥，待浸膏至粘稠时，加入约为地龙重量14％的玉米淀粉，混合、干燥、粉碎，过80目筛，得到地龙提取物。

实施例8

本实施例所述中药组合物II的组成为(1重量份＝1g)：

黄芪提取物80重量份，三七总皂苷25重量份，银杏叶提取物17重量份，水蛭提取物40重量份，地龙提取物50重量份，冰片6重量份；

其中各提取物均按照实施例7所述方法制备。

实施例9

本实施例所述中药组合物II的组成为(1重量份＝1g)：

黄芪提取物90重量份，三七总皂苷20重量份，银杏叶提取物10重量份，水蛭提取物50重量份，地龙提取物60重量份，冰片5重量份；

其中各提取物均按照实施例7所述方法制备。

实施例10

本实施例所述中药组合物II的组成为(1重量份＝1g)：

黄芪提取物70重量份，三七总皂苷30重量份，银杏叶提取物20重量份，水蛭提取物30重量份，地龙提取物40重量份，冰片7重量份；

其中各提取物均按照实施例7所述方法制备。

实施例11

本实施例所述中药组合物II的组成为(1重量份＝1g)：

黄芪提取物120重量份，三七总皂苷35重量份，银杏叶提取物30重量份，水蛭提取物25重量份，地龙提取物30重量份，冰片3重量份；

其中各提取物均按照实施例7所述方法制备。

实施例12一种用于治疗心脑血管疾病的中药组合物II

本实施例所述中药组合物II的组成为(1重量份＝1g)：

黄芪提取物50重量份，三七总皂苷40重量份，银杏叶提取物25重量份，水蛭提取物20重量份，地龙提取物25重量份，冰片10重量份；

其中各提取物均按照实施例7所述方法制备。

实施例13

取实施例8所述的中药组合物II；将冰片粉碎成细粉，过80目筛；与所述黄芪提取物、所述三七总皂苷、所述银杏叶提取物、所述水蛭提取物、所述地龙提取物和微晶纤维素约182g，混合均匀，干法制粒，共得到400g颗粒，装胶囊，制成1000粒，0.4g/粒，铝塑包装，外加复合膜袋。

对比例1

本对比例所述中药组合物的原料组成为(1重量份＝1g)：

黄芪2000重量份，三七4000重量份。

1)取三七药材，按照中国专利申请200410098601.7说明书实施例1记载的颗粒制剂的制备方法制备得到三七总皂苷；

2)取黄芪药材，按照中国专利申请200410098601.7说明书实施例1记载的颗粒制剂的制备方法制备得到黄芪总皂苷；

3)取上述制备得到的三七总皂苷和黄芪总苷，混合均匀，即得。

对比例2

本对比例所述中药组合物的原料组成为(1重量份＝1g)：

黄芪提取物80重量份，三七总皂苷25重量份，银杏叶提取物17重量份，水蛭提取物40重量份，地龙提取物50重量份；

其中各提取物均按照中国专利申请200410098601.7说明书第9页记载的药味活性成分制备方法制备。

研究例1

SPF级SD大鼠140只，雌雄各半，体重230g-250g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，动物使用许可证号：SYXK(黑)2018-007，动物生产许可证号：SCXK(辽)2020-0001。随机分为14组，每组10只，雌雄各半。分别为空白对照组、阳性药组、试验1-10组和对比1-2组。各组分别灌胃给予以下药物：

空白对照组：蒸馏水，10ml/kg；

阳性药组：脑心通胶囊(产品批号：220918，陕西步长制药有限公司)内容物，每次0.432g/kg，给药容积为10ml/kg；

试验1-5组：实施例1-5的中药组合物按实施例6制备得到的喷干粉与冰片细粉的混合物，每次2.194g生药/kg体重，给药容积为10ml/kg体重；

试验6-10组：实施例8-12的中药组合物，每次0.432g/kg体重，给药容积为10ml/kg体重；

对比1-2组：对比例1-2制备的中药组合物，每次0.432g/kg体重，给药容积为10ml/kg体重。

各组均每天给药1次，连续10天。

末次给药1h后，大鼠眼眶取血，每隔15s掰断毛细玻管(华西医科大学仪器厂生产)直至出现血丝，从血液充满毛细玻管时开始记录至出现血丝的时间即凝血时间。

应用IBM SPSS25.0软件进行统计分析，所有数据均以均数±标准差(±s)表示，多组间比较符合正态分布且方差齐使用单因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果见表1。

表1本发明的中药组合物对大鼠凝血时间的影响

a

*

表1的数据示出，本发明的各中药组合物能够显著延长大鼠凝血时间(P＜0.05)，且作用强于对比组，有显著差异(P＜0.05)。此外，实施例8的中药组合物II延长大鼠凝血时间的作用最强。

研究例2

SPF级SD大鼠50只，雌雄各半，体重230g-250g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，动物使用许可证号：SYXK(黑)2018-007，动物生产许可证号：SCXK(辽)2020-0001。随机分为5组，每组10只，雌雄各半。分别为空白对照组、阳性对照组、试验组和对比1-2组。各组分别灌胃给予以下药物：

空白对照组：蒸馏水，10ml/kg；

阳性对照组：脑心通胶囊(产品批号：220918，陕西步长制药有限公司)内容物，每次0.432g/kg体重，给药容积为10ml/kg体重；

试验组：实施例8的中药组合物，每次0.432g/kg体重，给药容积为10ml/kg体重；

对比1-2组：对比例1-2制备的中药组合物，每次0.432g/kg体重，给药容积为10ml/kg体重。

各组均每天给药1次，连续10天。

末次给药1h后，腹腔注射水合氯醛(产品批号：20201215，天津市大茂化学试剂厂)麻醉，分离右颈总动脉及左颈外静脉，在三段聚乙烯管的中段放入一根长6厘米的四号手术线，将肝素(批号：FS208A，赛诺菲制药有限公司)生理盐水液(12.5U/ml)充满聚乙烯管腔。当管的一端插入左颈外静脉后，再将管的另一端插入右颈总动脉，打开动脉夹，则血液从右颈总动脉流经聚乙烯管，返回左颈外静脉。开放血流20分钟后，中断血流，迅速取出丝线称重，总重量减去丝线重量即血栓湿重。按下列公式计算抑制率：

应用IBM SPSS25.0软件进行统计分析，所有数据均以均数±标准差(±s)表示，多组间比较符合正态分布且方差齐使用单因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果见表2。

表2本发明的中药组合物对大鼠血栓形成的影响

注：与空白对照组相比，

表2的数据示出，相比空白对照组，试验组的血栓重量显著降低(P<0.05)，对比组的血栓重量有下降趋势，但是差异不显著。说明本发明的实施例8的中药组合物能够抑制血栓形成，作用显著强于各对比组。

研究例3

SPF级SD大鼠84只，雌雄各半，体重230g-250g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，动物使用许可证号：SYXK(黑)2018-007，动物生产许可证号：SCXK(辽)2020-0001。随机分为6组，每组14只，雌雄各半。分别为空白对照组、模型对照组、阳性对照组、试验高剂量组、试验中剂量组和试验低剂量组。

动物模型的制备：购入SD大鼠后，适应性喂养7天，随后进行随机分组，每组14只，适应期结束后，配置300mg/ml的ISO溶液。空白对照组不做任何处理，其余5组按照100mg/kg的给药量进行皮下注射，连续三天，且每次间隔24小时以上。

造模结束后各组开始灌胃给予相应药物，试验高、中、低3组分别灌胃给予实施例13制备得到的胶囊的内容物，给药剂量分别为0.864g/kg、0.432g/kg、0.216g/kg；阳性对照组灌胃给予脑心通胶囊0.432g/kg。给药容积均为10ml/kg。空白对照组和模型对照组给予相同体积蒸馏水。每天1次，连续给药14天。

末次给药后，采用10％水合氯醛(产品批号：20201215，天津市大茂化学试剂厂)溶液0.3ml/100g体重给予大鼠腹腔注射麻醉，(1)用一次性真空采血管(产品批号：21097004，河北鑫乐医疗器械科技有限公司)和采血针从腹主动脉采血。采血后约4000×g低温离心10min，用移液枪小心吸取上清液，分装于2ml离心管中，-80℃保存备用。采用Chemray240型全自动生化仪(深圳雷杜生命科技股份有限公司)检测大鼠心脏损伤情况。(2)快速摘取心脏，并使用生理盐水清洗，除去心脏中的血液，使用滤纸吸干水分后置于10％中性福尔马林固定液(批号：20220805，北京益利精细化学品有限公司)中固定，经HE染色后采用EclipseCi-L正置白光拍照显微镜(Nikon(Japan))观察心脏组织病理变化。

应用IBM SPSS25.0软件进行统计分析，所有数据均以均数±标准差(±s)表示，多组间比较符合正态分布且方差齐使用单因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

(1)心脏损伤结果见表3

表3本发明组合物对大鼠心脏损伤水平的影响

/>

注：与模型对照组组相比，

表3的结果示出，模型对照组大鼠的CK、CKMB、LDH值相比较空白对照组都极显著升高(P＜0.01)，显示造模成功。除低剂量组的LDH值外，各试验组大鼠的CK、CKMB、LDH值相比较模型对照组都显著降低(P＜0.01，P＜0.05)，提示本发明中药组合物具有显著抗凝血作用，且作用与阳性对照药相当。

(2)对心脏病理变化的影响

各组大鼠的心脏切片经HE染色后的显微照片，见图1-图6。

图1示出，空白对照组大鼠心脏组织心内膜、心肌膜及心外膜结构清晰，心壁及心腔未见明显异常；心肌纤维着色均匀，细胞分界清楚，走形一致，心肌细胞横纹清楚，明、暗相间，间质未见异常；未见明显的炎性改变。

图2示出，模型对照组大鼠心脏组织可见小面积心肌细胞坏死，核碎裂(箭头1所指)，结缔组织增生，伴少量淋巴细胞浸润(箭头2所指)。证明造模成功。

图3示出，阳性对照组大鼠心脏组织可见心内膜脱落，结缔组织排列稀疏，伴少量淋巴细胞浸润(箭头1所指)；心肌纤维着色均匀，细胞分界清楚，走形一致，心肌细胞横纹清楚，明、暗相间，间质未见异常。

图4示出，试验高剂量组大鼠心脏组织可见心外膜处少量淋巴细胞浸润(箭头1所指)；心肌纤维着色均匀，细胞分界清楚，走形一致，心肌细胞横纹清楚，明、暗相间，间质未见异常。

图5示出，试验中剂量组大鼠心脏组织可见心外膜水肿，结缔组织排列稀疏，伴少量淋巴细胞浸润(箭头1所指)；心肌纤维着色均匀，细胞分界清楚，走形一致，心肌细胞横纹清楚，明、暗相间，间质未见异常。

图6示出，试验低剂量组大鼠心脏组织可见心外膜水肿，结缔组织排列稀疏，伴少量淋巴细胞浸润(箭头1所指)；少量血管扩张(箭头2所指)；心肌纤维着色均匀，细胞分界清楚，走形一致，心肌细胞横纹清楚，明、暗相间，间质未见异常。

研究例4

动物模型的制备：使用线栓法制备MCAO模型(Middle Cerebral ArteryOcclusion,大脑中动脉栓塞模型)，线栓经过颈总动脉插入大脑中动脉，阻断血流引起急性脑缺血构建MCAO模型。各组大鼠适应性喂养一周后禁食不禁水12h，次日，称取大鼠体重，用10％水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉将模型对照组、本发明高中低剂量组、阳性药对照组大鼠均仰卧于手术台上，颈部备皮，使用碘伏进行范围性清理消毒，后打开颈部皮肤找到颈总动脉，并分离颈总动脉和神经，随后向大脑方向找到血管分岔口，确定颈内动脉和颈外动脉，结扎颈外动脉，随后结扎颈总动脉，并于颈总动脉处系一活结，随后用动脉夹夹闭颈内动脉，用眼科剪于颈总动脉上开一小口，将符合大鼠体重的线栓从颈总动脉插入，适度收紧活结，随后打开动脉夹，让线栓沿着颈内动脉向上直达大脑中动脉，延伸长度约为过分叉处20±2mm，随后收紧活结，系手术结，喷洒青霉素预防手术过程中可能引起的细菌感染，最后进行缝合，伤口处再用碘伏清理，假手术组除不进行线栓堵塞大脑中动脉的步骤外，其余同其他组操作。手术完成24小时后，对大鼠进行神经性评分，保证模型的构建，提尾时左侧前爪抱爪和前进时左侧转圈成追尾状的视为模型复制成功。

以1分为造模成功，并排除缺血性损伤过重的4分大鼠，避免实验过程中因为病情发展过快，导致大鼠批量死亡，评分标准为：0分：无神经损伤症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：向对侧转圈；3分：向对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。

评分后将造模成功的大鼠随机分为模型对照组、阳性对照组、试验高剂量组、试验中剂量组和试验低剂量组，每组14只，雌雄各半。

空白对照组14只大鼠，雌雄各半，不做任何处理。

造模结束后各组开始灌胃给予相应药物，试验高、中、低3组分别灌胃给予实施例13制备得到的胶囊的内容物，给药剂量分别为0.864g/kg体重、0.432g/kg体重、0.216g/kg体重；阳性对照组灌胃给予脑心通胶囊0.432g/kg体重。给药容积均为10ml/kg体重。空白对照组和模型对照组给予相同体积蒸馏水。每天1次，连续给药14天。

末次给药后，采用10％水合氯醛(产品批号：20201215，天津市大茂化学试剂厂)溶液0.3ml/100g体重给予大鼠腹腔注射麻醉，处死大鼠并快速取出大脑，置于10％中性福尔马林固定液(批号：20220805，北京益利精细化学品有限公司)中固定，经HE染色后采用Eclipse Ci-L正置白光拍照显微镜(Nikon(Japan))观察脑组织病理变化。

应用IBM SPSS25.0软件进行统计分析，所有数据均以均数±标准差(±s)表示，多组间比较符合正态分布且方差齐使用单因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

1、对大鼠大脑缺血损伤的影响

通过对MCAO大鼠大脑进行TTC染色，确定大鼠的脑梗死区域及面积，确定本发明组合物对MCAO大鼠脑部缺血的影响。结果发现高剂量组相对于阳性药对照组和中低剂量组具有明显的减轻梗死面积扩散的作用，阳性药对照组的作用效果介于中剂量组和低剂量组之间。见图7。

2、大脑病理变化的影响

2.1MCAO大鼠HE评分标准

对MCAO大鼠进行了纹状体的HE检测，发现MCAO模型对照组的大鼠与空白对照组相比出现了明显的变化，按照表4所示的评分标准对大脑损伤进行评判，结果见表5。

表4对MCAO大鼠的HE染色的评分标准

表5各组MCAO大鼠HE评分

注：与模型对照组相比，*：P<0.05，**：P<0.01

与空白对照组相比，模型对照组脑间质空泡化和碎裂情况严重，神经元特征形态消失，空泡化严重，细胞核出现固缩且着色加深，神经元周围水肿或者空泡化严重，轴突和树突损伤明显，典型形态基本丧失。因此，表5中模型对照组的总评分达到18.13±2.64。与模型对照组相比，阳性药对照组和试验高、中、低剂量组总评分均出现了明显下调(P＜0.01、P＜0.05)。

2.2对大脑病理变化的影响

各组代表性的大鼠大脑切片经HE染色后的显微照片见图8-图13。

图8示出，空白对照组大鼠大脑组织呈现致密状态，形态正常，无萎缩发生，细胞核形态正常，着色正常，无空泡或水肿，轴突及树突形态正常。

图9示出，模型对照组大鼠大脑组织呈明显碎裂状态，无特征性神经元形态，其周围出现大量空泡，细胞核皱缩呈圆形或类圆形，核着色显著加深，神经元周围出现大量空泡或水肿，轴突及树突损伤严重，无法观察到其典型形态。与空白对照组比较，说明造模成功。

图10示出，阳性对照组大鼠大脑组织呈现较疏松状态，脑间质出现少量空泡，神经元形态变化明显，其周围出现明显空泡，细胞核明显皱缩，其边缘着色加深，神经元周围出现明显空泡化或水肿，轴突及树突损伤严重，无法观察到其典型形态。与模型对照组比较，阳性对照药能够对急性脑缺血造成的脑组织损伤起到一定的改善作用。

图11示出，试验高剂量组大鼠大脑组织呈现较疏松状态，脑间质无明显空泡，少量神经元形态发生变化，其周围无空泡，细胞核明显皱缩，其边缘着色加深，出现中等水平空泡化或水肿。相比较模型对照组，高剂量试验药物能够显著改善急性脑缺血造成的脑组织损伤。

图12示出，试验中剂量组大鼠大脑组织较疏松状态，脑间质出现少量空泡，神经元形态变化明显，其周围出现明显空泡，大量细胞核皱缩，核着色加深，出现中等水平空泡化或水肿，轴突及树突损伤严重，无法观察到其典型形态。相比较模型对照组，中剂量试验药物能够在一定程度上改善急性脑缺血造成的脑组织损伤。

图13示出，试验低剂量组大脑组织呈现疏松状态，脑间质出现明显空泡，神经元形态变化明显，其周围出现明显空泡，大量细胞核皱缩，核着色加深，神经元周围出现明显空泡化或水肿，轴突及树突损伤严重，无法观察到其典型形态。相比较模型对照组，低剂量试验药物能够改善急性脑缺血造成的脑组织损伤。

研究例5

急性毒性试验：采用最大给药量方法，大鼠灌胃给予实施例13的胶囊剂内容物1.11g/ml，大鼠灌胃最大给药容积20ml/kg体重，一日内大鼠灌胃给药1次，连续观察14天内动物毒性反应及死亡情况。结果测得实施例13的胶囊剂最大给药剂量为22.22g/kg，相当于临床拟用剂量的102.87倍。从给药当日至观察结束所有大鼠一般状态良好，毛顺光亮，活动和饮食正常，粪便成形，无动物死亡。体重虽有个别时段出现异常，但体重均呈增长趋势，说明实施例13胶囊剂灌胃给药后未影响受试动物的生长。试验结束次日，肉眼观察未发现动物器官出现体积、颜色、质地等改变，脑、心、肝、脾、肺、肾等重要脏器未见出血、充血、渗出、溃疡、穿孔、炎症，胸腔、腹腔及心包腔均无积液。

3个月毒性研究：根据国家食品药品监督管理局2014年5月颁发的《药物重复给药毒性试验技术指导原则》，以实施例13胶囊剂临床用量10倍、20倍、40倍三个剂量及蒸馏水分别对大鼠连续灌胃3个月。结果，各给药组大鼠活动正常，行为活泼，被毛光润，未见差别和异常改变；给药期和恢复期各剂量组大鼠的平均摄食量和平均体重与同期对照组比较存在一定差异，但仅存在于个别检测时间点，没有规律性和趋势性变化，缺乏剂量反应关系，初步判断该差异性无毒理学意义；各组动物血液学及血液生化指标与同期对照组比较，有个别指标出现异常变化，但无剂量-反应相关性，分析可能为短暂一过性反应；尿常规指标与同期对照组比较，未见剂量-反应相关性的异常变化；给药结束及恢复期结束时各组间所有脏器系数亦均无毒理学意义的异常变化，所有镜检组织脏器未呈现量毒关系的病理学变化，亦未见延迟性毒性反应。在本实验条件下，大鼠三个月重复灌胃给予实施例13胶囊剂，8.64g/kg/d剂量下(约为临床用量的40倍)未发现明确的毒性靶器官与毒性反应。