特异性结合黄曲霉毒素B1小分子的核酸适配体及应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及核酸适配体，尤其涉及一种特异性结合黄曲霉毒素B1小分子的核酸适配体及应用。

背景技术

黄曲霉毒素(Aflatoxin)是黄曲霉和寄生曲霉等某些菌株产生的一系列双呋喃环类化合物。它包括约20种毒素，其中黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1)在所有黄曲霉毒素中毒性最大。黄曲霉毒素B1具有很强的致癌、致突变和致畸特性，并且在加热时也很稳定。它在湿热地区食品和饲料中出现的机率最高，花生、玉米、谷物和油很容易被黄曲霉毒素B1污染，被黄曲霉毒素B1污染的食物可通过食物链进入体内并积聚，导致肝脏慢性损害甚至死亡。

黄曲霉毒素B1已被国际癌症研究机构列为I类致癌物，世卫组织和各国卫生组织都对其在各种食品和农产品中的含量做了明确规定，对黄曲霉毒素B1的检出是关于人的生命安全的重要屏障。目前针对黄曲霉毒素B1的检测方法是多样的，传统的仪器方法如高效液相色谱(HPLC)和液相色谱-质谱(LC-MS)，但这些方法需要训练有素的人员进行操作，仪器成本高昂且耗时。而基于ELISA的试剂盒以及相关的免疫传感器的各种产品都可以在市场上购买。然而抗体的生产成本、批次稳定性、交叉反应敏感性、时间消耗、假阳性或假阴性结果和基质干扰效应方面限制了它们的广泛使用。

近年来，核酸适配体(aptamer)已成为一种新的生物传感元件，用于检测从离子到细胞的分析物。核酸适配体是指通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选分离得到的DNA或者RNA分子，它可以与其他靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合。与传统方法和抗体相比，适配体具有成本低、稳定性好、操作简单、适用于各种分析方法等优点。基于此，本发明开发了一种能够与黄曲霉毒素B1特异性结合的核酸适配体来对黄曲霉毒素B1进行检测，这将为黄曲霉毒素B1的检测提供新的方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种特异性结合黄曲霉毒素B1小分子的核酸适配体，本发明首先获得高亲和力，高特异性，分子量低，易于修饰的黄曲霉毒素B1核酸适配体，取代复杂的质谱仪器以及抗体。

本发明还提供了上述核酸适配体的应用，利用适配体荧光竞争检测黄曲霉毒素B1含量的方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种特异性结合黄曲霉毒素B1小分子的核酸适配体，包括SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列；或者，与SEQ ID No.1核苷酸序列具有高同源性并且能够特异性结合黄曲霉毒素B1小分子的核苷酸序列；或者由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列衍生的能够特异性结合黄曲霉毒素B1小分子的核苷酸序列。

作为本发明的一种优选方案，所述具有高同源性是指与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同源性。

作为本发明的一种优选方案，所述核酸适配体包含与所述核苷酸序列互补的核苷酸序列并且保持亲和力。

作为本发明的一种优选方案，所述核酸适配体的核苷酸序列包含碱基修饰并且保持亲和力。

作为本发明的一种优选方案，所述碱基修饰为硫代修饰、磷酸化修饰、甲基化修饰、氨基化修饰、巯基化修饰、硒取代氧修饰或连接同位素修饰。

本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，可对上述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置进行修饰，例如，磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或连接同位素化等，条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合黄曲霉毒素B1小分子的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。

作为本发明的一种优选方案，所述核酸适配体的核苷酸序列包含标记物并且保持亲和力。

作为本发明的一种优选方案，所述标记物为荧光标记物，放射性标记物、治疗性标记物、生物素标记物、地高辛标记物、纳米发光材料标记物、小肽标记物、siRNA标记物或酶标记物。

本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，可在上述核酸适配体的核苷酸序列上连接荧光物质，放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、siRNA或酶标记等，条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合黄曲霉毒素B1小分子的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。

本发明还提供了上述的特异性结合黄曲霉毒素B1小分子的核酸适配体在检测黄曲霉毒素B1含量上的应用。

作为本发明的一种优选方案，采用荧光竞争法检测黄曲霉毒素B1小分子的含量。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)核酸适配体与抗体相比分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短，可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程，因此核酸适配体是一种非常理想的分子探针。针对于黄曲霉毒素B1小分子的核酸适配体还没有人公布且没有人应用该适配体，因此，本领域对针对黄曲霉毒素B1小分子有高结合亲和力的核酸适配体存在需求。

2)核酸适配体相较于抗体，更稳定，由于是化学合成，批间差异几乎没有；并将该核酸适配体成功用于黄曲霉毒素B1小分子的检测。

3)本发明得到的核酸适配体具有特异性高、稳定性高、方便合成且分子量低易于修饰，可以取代复杂的质谱仪器以及抗体。

4)本发明还提供了能够与黄曲霉毒素B1特异性结合的核酸适配体来对黄曲霉毒素B1进行检测，这将为黄曲霉毒素B1的检测提供新的方法。

附图说明

图1是本发明荧光竞争法检测黄曲霉毒素B1小分子示意图。

图2是实施例1iTC实验检测AFB1-05适配体与黄曲霉毒素B1小分子亲和力示意图。

图3是实施例2固定前后适配体溶液的吸收谱图。

图4是实施例2不同浓度黄曲霉毒素B1的荧光谱图。

图5是实施例2荧光强度与黄曲霉毒素B1浓度的函数图。

图6是实施例2荧光强度与黄曲霉毒素B1浓度的线性函数图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

等温量热滴定(iTC)验证AFB1-05核酸适配体与黄曲霉毒素B1小分子亲和力，包括以下步骤：

1.用二甲基亚砜将黄曲霉毒素B1(购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号A606874)溶解后用DPBS缓冲液稀释至1mM(含1％二甲基亚砜)，用DPBS将AFB1-05单克隆(序列为SEQ IDNo.1：TCCTCGGTACACACGGTCCAGGCTGGTCTCCCTCCC)，合成自通用生物(安徽)股份有限公司)溶解成5μM并使溶液中含有1％的二甲基亚砜，最后配置含有1％二甲基亚砜的DPBS缓冲液。

2.使用Malvern公司型号为iTC 200仪器进行实验。

仪器开机自检完成后，选择自动清洗滴定针与滴定池，清洗完成后使用超纯水滴定，检查仪器稳定性和滴定针与滴定池的清洁度。然后开始进样，用60μL黄曲霉毒素B1溶液滴定280μL含1％二甲基亚砜的DPBS缓冲液，获得对照组数据。再次清洗滴定针与滴定池，仪器进样，用60μL黄曲霉毒素B1溶液滴定280μL含1％二甲基亚砜的AFB1-05单克隆溶液，获得实验组数据。实验设置的滴定方式为第一滴注射0.4μL，后面19滴每滴注射3μL，每次注射时长为20s，注射间隔时间为150s。实验结束后，清洗滴定针与滴定池，关机。

如图2所示，用实验组数据扣除对照组数据，绘制出黄曲霉毒素B1与AFB1-05单克隆的滴定曲线，通过软件对每个放热峰的面积进行自动积分，得到结合等温曲线以及结合比，结合常数，焓变，熵变，吉布斯自由能等数据。从图中可以看出，黄曲霉毒素B1小分子与AFB1-05单克隆的结合常数为3.21*10

实施例2

荧光竞争法对黄曲霉毒素B1小分子的检测

如图1所示，本发明先合成了3’端荧光基团(FAM)修饰的AFB1-05-F单克隆以及5’端生物素(Biotin)和3’端猝灭基团(BHQ)修饰的B-MT-Q单克隆，这两条单克隆的部分序列可以碱基互补配对。利用链霉亲和素与生物素结合的特性，可以将AFB1-05-F和B-MT-Q形成的双链DNA固定到M-270链霉亲和素磁珠上，此时荧光基团和猝灭基团距离过近，会导致荧光猝灭。随后通过封闭和清洗步骤，加入检测靶标黄曲霉毒素B1小分子。黄曲霉毒素B1会与B-MT-Q相互竞争，并趋向于与适配体AFB1-05-F相结合，导致AFB1-05-F结构变化，双链被打开，此时黄曲霉毒素B1与AFB1-05-F复合物将游离在溶液中，最后通过离心磁吸获得上清并测量其荧光便可实现对黄曲霉毒素B1小分子的检测。

检测方法包括以下步骤：

1)用DPBS将5’端生物素(Biotin)和3’端猝灭基团(BHQ)修饰的B-MT-Q单克隆干粉(序列为SEQ ID No.2：5’-Biotin-AAAAACTACGTGGGA-BHQ-3’，合成自通用生物(安徽)股份有限公司)，以及3’端荧光基团(FAM)修饰的AFB1-05-F单克隆(序列为SEQ ID No.3：5’-TCCTCGGTACACACGGTCCAGGCTGGTCTCCCTCCCACGTAG-FAM-3’，合成自通用生物(安徽)股份有限公司)干粉12000rpm离心10min，然后用DPBS成100μM，震荡摇匀后4℃保存备用。

2)将溶解好的AFB1-05-F和B-MT-Q按照1:2的浓度比例混合添加到PCR管中缓慢变复性以形成双链结构(条件为：95℃保持10min，缓慢降温至60℃，保持1min，然后缓慢降温至25℃保持10min，降温速率均为是0.1℃/秒)，结束后将AFB1-05-F和B-MT-Q混合溶液4℃保存备用。随后取5μL DNA混合液进行紫外浓度检测，并记录紫外检测A260数据为A1。

3)取50μL 10mg/mL M-270链霉亲和素磁珠(购自赛默飞世尔科技公司，货号65305)用500μL DPBS缓冲液清洗三次。将1mL DNA混合液加入到磁珠中，混匀，旋转摇床室温孵育60min，结束后用强磁铁吸附所有磁珠，移去并保留上清。用移液器取微量上清检测紫外A260数值A2，用A2/A1的数值判断上清中未固定到磁珠上的DNA浓度来判断DNA与磁珠的固定效率，如图3所示，相比与未固定前的A260数值A1，上清中A2大幅减小，计算得出固定效率为75％。接着用400μL DPBS缓冲液清洗三次，加入100μM的Biotin溶液封闭2h。

4)封闭结束后用500μL DPBS缓冲液清洗三次，用DPBS定容成500μL。准备7支离心管，每支加入50μL封闭好的磁珠，磁吸移去上清后加入100μL DPBS缓冲液稀释好的黄曲霉毒素B1样品溶液(浓度依次为0ng/mL、0.18ng/mL、0.75ng/mL、1.36ng/mL、2ng/mL、8ng/mL和20ng/mL)，摇匀，旋转摇床室温孵育60min。

5)孵育结束后每份样品5000rpm离心2min，再用强磁铁吸附所有磁珠，将上清移至新的离心管。使用荧光分光光度计(日立公司，型号F-2700)测量每份样品上清中荧光基团的荧光强度并记录数据。

实验结果如图4所示，可以看到随着黄曲霉毒素B1浓度的升高，荧光强度逐渐增大。从图5和图6可以得出，在520nm处，黄曲霉毒素B1浓度与荧光强度呈现正相关且有较好的区分度。浓度在0.18ng/mL-2ng/mL范围内，浓度与荧光强度线性关系较好，说明AFB1-05单克隆与黄曲霉毒素B1具有良好的亲和力。因此，本发明的核酸适配体可以替代传统的质谱仪器检测以及替代抗体，从而为开发新的检测方法提良好的思路和方法。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。