一种双十八烷基二甲基溴化铵微生物的检测方法

技术领域

本发明涉及药用辅料中微生物检测技术领域，具体涉及一种双十八烷基二甲基溴化铵微生物的检测方法。

背景技术

双十八烷基二甲基溴化铵是南京威尔药业集团股份有限公司研发的新型药用辅料。作为一种阳离子脂质材料，它在医药领域具有重要的应用价值，特别是在免疫反应刺激、巨噬细胞激活以及与抗原的结合方面。

除了上述应用，这种物质还被研究作为牛病毒性腹泻病毒(BVDV)灭活疫苗的新佐剂。它的独特性质使其成为疫苗研发领域的重要组成部分。

目前，尽管双十八烷基二甲基溴化铵具有重要的医疗价值，但在实际应用中面临着一个关键问题：该物质在中国药典规定的常用稀释液中不溶，而传统的增溶剂调节手段也未能达到溶解该物质的效果。这一特性给其微生物检测带来了显著难度，因为无法使用常规的微生物检测方法。

由于缺乏有效的微生物检测方法，对双十八烷基二甲基溴化铵的质量控制和安全性评估造成了障碍。同时，由于目前该产品在市场上尚无正式的质量标准，对其进行准确的微生物检测变得尤为重要。

鉴于其在药品辅料领域的新颖性，以及在药品安全性和有效性评估中的重要性，开发一种适用的微生物检测方法显得尤为重要。然而，由于其在常规稀释液中的不溶性，传统的微生物检测方法难以适用。

为了克服这一挑战，本发明提出了一种创新的微生物检测方法。该方法利用双十八烷基二甲基溴化铵在pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中形成乳膏状的特性，通过加入氯化钠溶液实现破乳，从而成功分离出澄清的供试品溶液进行微生物检测。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明提出一种双十八烷基二甲基溴化铵微生物的检测方法，利用了供试品在常规稀释液pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中形成乳膏状，加入氯化钠溶液破乳后取水层进行微生物的检测，可有效解决样品在常规稀释液中不能溶解、分散的问题，同时解决样品多次稀释后检测数据准确性差的缺点。

为实现上述目的，本发明提供一种双十八烷基二甲基溴化铵微生物的检测方法，包括：

步骤S1：制备铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌液；

步骤S2：从供试品中提取溶液，用于后续的微生物计数；

步骤S3：进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的计数回收率测试。

进一步地，步骤S1中铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的制备具体如下：

步骤S11：接种至10ml胰酪大豆胨液体培养基；

步骤S12：在30～35℃条件下培养18～24小时；

步骤S13：用0.9％无菌氯化钠溶液稀释至10^

进一步地，步骤S1中白色念珠菌的制备具体如下：

步骤S14：接种至10ml沙氏葡萄糖液体培养基；

步骤S15：在20～25℃条件下培养2天；

步骤S16：用0.9％无菌氯化钠溶液稀释至10^

进一步地，步骤S1中黑曲霉的制备如下：

步骤S17：接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面，在20～25℃条件下培养7天，产生孢子；

步骤S18：加入5ml含0.05％聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，振摇后用无菌吸管吸取菌液加入蒙有灭菌纱布的无菌试管中；

步骤S19：用含0.05％聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至10^

进一步地，步骤S2具体如下：

步骤S21：无菌条件下，取10g供试品，加入含3％氯化钠的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至400ml，转移至无菌输液瓶中；

步骤S22：闭塞后充分振摇，倒置输液瓶使分层；

步骤S23：用无菌注射器取下清液作为1∶40的供试液。

进一步地，步骤S3具体如下：

步骤S31：试验组的制备：吸取1:40供试液4ml至96ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，混匀，震荡，使充分溶解，平行制备7份混合溶液。

步骤S32：取步骤S31中5份混合溶液，分别加入1ml菌落数不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉试验菌，分别过滤，再用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，每膜每次冲洗量为100ml，共冲洗3次，冲洗结束，取下滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，倒置于30℃～35℃培养3～5天，观察结果；

步骤S33：取步骤S31中余下2份混合溶液，分别加入1ml菌落数不大于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉试验菌，分别过滤，再用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，每膜每次冲洗量为100ml，共冲洗3次，冲洗结束，取下滤膜，菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，倒置于20℃～25℃培养5～7天，观察结果；

步骤S34：吸取1:40供试液4ml至96mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，混匀，制备2份，分别过滤(过滤前先用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液对滤膜进行润洗，润洗量100ml/膜)，再用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，每膜每次冲洗量为100ml，共冲洗3次。冲洗结束，取下滤膜。1份菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，倒置于30℃～35℃培养3～5天，观察结果。用来测定供试品需氧菌本底数；

步骤S35：取步骤S34中制备的另一份滤膜，菌面朝上贴于沙氏葡萄糖大豆胨琼脂培养基平板上，倒置于20℃～25℃的培养箱中培养5～7天，观察结果，用来测定供试品霉菌和酵母菌本底数；

步骤S36：取100mlpH7.0加入不大于100cfu的试验菌(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌每种试验菌各制备1张滤膜，白色念珠菌、黑曲霉各制备2张滤膜)进行过滤，过滤前先用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液对滤膜进行润洗，润洗量100ml/膜，再用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，每膜每次冲洗量为100ml，共冲洗3次，冲洗结束，取下滤膜；

步骤S37：将接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的各1张滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，倒置于30℃～35℃培养3～5天，观察结果；

步骤S38：取步骤S36中制备得白色念珠菌、黑曲霉各1张滤膜，菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，倒置于20℃～25℃的培养箱中培养5～7天，观察结果；

步骤S39：结果判断，比较试验组和对照组的比值，如果比值在0.5～2范围内，则测定供试品的需氧菌总数和霉菌和酵母菌总数；如果不在该范围内，则需采取其他方法进行检测。

进一步地，步骤S19中的菌液可在2～8℃保存24小时内使用。

进一步地，步骤S3中使用薄膜过滤法，转速120rpm。

进一步地，步骤S32和步骤S33中过滤前先用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液对滤膜进行润洗，润洗量100ml/膜。

进一步地，步骤S39中比值计算公式如下：

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.本发明提供了一种双十八烷基二甲基溴化铵微生物的检测方法，通过加入氯化钠溶液成功破坏了乳膏状物质，从而使双十八烷基二甲基溴化铵在常规稀释液中形成分层。这种方式有效地解决了原料在标准稀释液中的不溶性问题。

2.本发明提供了一种双十八烷基二甲基溴化铵微生物的检测方法，由于减少了样品的多次稀释，这种方法提高了检测数据的准确性，减少了因多次稀释导致的数据偏差，使用薄膜过滤法消除了样品的抑菌性，这一步骤对提高供试品的回收率至关重要。

3.本发明提供了一种双十八烷基二甲基溴化铵微生物的检测方法，通过使用已灭菌的输液瓶和一次性注射器进行样品处理，简化了实验操作步骤，提高了实验效率，对于那些在常规稀释液中不溶或难以处理的样品特别有用，显示出良好的适应性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明步骤流程示意图。

具体实施方式

下面将结合附图、通过对本发明的优选实施方式的描述，更加清楚、完整地阐述本发明的技术方案。

如图1所示，本发明为：

步骤S1：制备铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌液；

步骤S2：从供试品中提取溶液，用于后续的微生物计数；

步骤S3：进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的计数回收率测试。

具体如下：

1仪器与材料

1.1仪器如表1所示：

表1

1.2试剂与药品

1.2.1供试品品名：双十八烷基二甲基溴化铵批号：20230801K、20230901K、20230902K1.2.2培养基如表2所示：

表2

1.2.3稀释液如表3所示：

表3

1.3实验条件

温度：18～26℃；湿度：45％～65％

1.4试验用菌种如表4所示：

表4

1.5实验用具

锥形瓶、培养皿(9cm)、量筒(100ml)、试管(18×180mm)及塞、微生物检测仪、移液枪、一次性无菌枪头、

2、方法和结果

2.1、制备铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌液；

分别接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜斜面菌种至10ml胰酪大豆胨液体培养基，30～35℃培养18～24小时，用0.9％无菌氯化钠溶液分别稀释至10

接种白色念珠菌的新鲜斜面菌种至10ml沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2天，用0.9％无菌氯化钠溶液稀释至，10

接种黑曲霉的新鲜菌种至沙氏葡萄糖琼脂斜面20～25℃培养7天，使产生孢子。加入5ml含0.05％聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，振摇后用无菌吸管吸取菌液加入蒙有灭菌纱布的无菌试管中，用含0.05％聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液稀释至10

2.2、供试品溶液的制备：

无菌条件下取供试品10g，加入含3％氯化钠的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至400ml，转移至无菌输液瓶中，闭塞，振摇，倒置输液瓶使分层，用无菌注射器取下清液作为1∶40的供试液。

2.3计数试验薄膜过滤法(转速120rpm)

(a)试验组供试液的制备：

吸取1:40供试液4ml至96mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，混匀，震荡，使充分溶解，平行制备7份混合溶液。

需氧菌总数计数：

⑴取上述7份混合溶液中的5份混合溶液，分别加入1ml菌落数不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉试验菌。分别过滤(过滤前先用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液对滤膜进行润洗，润洗量100ml/膜)，再用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，每膜每次冲洗量为100ml，共冲洗3次，冲洗结束，取下滤膜。

⑵将接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各1份的滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，倒置于30℃～35℃培养3～5天，观察结果。

霉菌和酵母菌总数计数：

⑴取上述7份混合溶液中2份混合溶液，分别加入1ml菌落数不大于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉试验菌，分别过滤(过滤前先用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液对滤膜进行润洗，润洗量100ml/膜)，再用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，每膜每次冲洗量为100ml，共冲洗3次，冲洗结束，取下滤膜。

⑵将接种白色念珠菌、黑曲霉各1份的滤膜，菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，倒置于20℃～25℃培养5～7天，观察结果。

(b)供试品对照组

需氧菌总数计数：

吸取1:40供试液4ml至96mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，混匀，制备2份，分别过滤(过滤前先用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液对滤膜进行润洗，润洗量100ml/膜)，再用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，每膜每次冲洗量为100ml，共冲洗3次。冲洗结束，取下滤膜。1份菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，倒置于30℃～35℃培养5天，观察结果。用来测定供试品需氧菌本底数。

霉菌和酵母菌总数计数：

取(b)中制备的2份中的另一份滤膜，菌面朝上贴于沙氏葡萄糖大豆胨琼脂培养基平板上，倒置于20℃～25℃的培养箱中培养5～7天，观察结果。用来测定供试品霉菌和酵母菌本底数。

(c)菌液组

需氧菌总数计数：

⑴取100mlpH7.0加入不大于100cfu的试验菌(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌每种试验菌各制备1张滤膜，白色念珠菌、黑曲霉各制备2张滤膜)进行过滤(过滤前先用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液对滤膜进行润洗，润洗量100ml/膜)，再用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，每膜每次冲洗量为100ml，共冲洗3次，冲洗结束，取下滤膜。

⑵将接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的各1张滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，倒置于30℃～35℃培养3～5天，观察结果。

霉菌和酵母菌总数计数：

取(c)中制备得白色念珠菌、黑曲霉各1张滤膜，菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，倒置于20℃～25℃的培养箱中培养5～7天，观察结果。

结果判断

⑵若试验组比值在0.5～2范围内，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的需氧菌总数和霉菌和酵母菌总数。

⑶若任一次试验中试验组比值不在0.5～2范围内，采用培养基稀释法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。

⑷若验证符合要求，以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检验。需氧菌总数计数适用性检验结果如表5所示：

表5(双十八烷基二甲基溴化铵三批a.20230801K b.20230901K c.20230902K)

霉菌和酵母菌计数适用性检验结果如表6所示：

表6(双十八烷基二甲基溴化铵三批a.20230801K b.20230901K c.20230902K)

3.实验结论

无菌条件下取供试品10g，加入含3％氯化钠的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至400ml，转移至输液瓶中，闭塞，振摇，倒置输液瓶使分层，用无菌注射器取下清液作为1∶40的供试液。取1:40供试液4ml，按《中华人民共和国药典2020年版(四部)》微生物限度检查法薄膜过滤法进行本产品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌数检验(需氧菌总数每1g不得过10

本发明利用了供试品在常规稀释液pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中形成乳膏状，加入氯化钠溶液破乳后取水层进行微生物的检测，可有效解决样品在常规稀释液中不能溶解、分散的问题，同时解决样品多次稀释后检测数据准确性差的缺点。

上述具体实施方式仅仅对本发明的优选实施方式进行描述，而并非对本发明的保护范围进行限定。在不脱离本发明设计构思和精神范畴的前提下，本领域的普通技术人员根据本发明所提供的文字描述、附图对本发明的技术方案所作出的各种变形、替代和改进，均应属于本发明的保护范畴。本发明的保护范围由权利要求确定。