一种检测HBV剪接型RNA的引物和探针组合物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种检测HBV剪接型RNA的引物和探针组合物及其应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)感染是世界范围内的公共卫生问题。

早期研究表明，HBV DNA水平是HCC发生发展的独立危险因素，HBV DNA水平越高，患者发生HCC的风险就越高。因此，针对HBV DNA水平高，并且引起肝脏损伤的CHB患者，国内外的《慢性乙型肝炎防治指南》均建议他们接受核苷(酸)类药物(NAs)或者聚乙二醇干扰素(Peg-IFN)治疗，以控制病毒复制，延缓疾病进展，进而降低HCC的发生风险。由于目前难以实现慢性HBV感染的治愈(HBsAg转阴、肝内cccDNA清除)，因此，科学家们将HBV DNA转阴(病毒学应答)、HBeAg血清学转换(HBeAg血清学应答)作为抗病毒治疗的应答指标，以评估抗病毒治疗药物的疗效。已有研究表明，在抗病毒治疗过程中，实现病毒学应答和HBeAg血清学应答的患者较非应答患者/应答不佳的患者，HCC发生风险显著下降，提示HBV DNA和HBeAg是监测慢乙肝患者抗病毒治疗疗效和慢性肝病进展的重要临床指标。

近年来，随着核苷类抗病毒药物在慢乙肝患者中的普遍应用，很多患者获得了很好的病毒抑制效果，大多数患者能够达到血清HBV DNA检测不到、HBeAg血清学转换，而HBsAg水平则变化不大。这种情况下，则需要新的且能够反应病情变化的指标。其中，HBVRNA作为cccDNA的直接下游产物，比HBV DNA更能代表肝内cccDNA的状态。已有研究表明，血清HBV RNA与肝内cccDNA转录活性相关，是慢乙肝患者抗病毒治疗应答的早期预测指标，并且可预测NAs停药后疾病复发。

实际上，血清HBV RNA的存在形式较HBV DNA复杂。科学家们发现，血清HBV RNA主要为HBV前基因组RNA(pgRNA)，但血清中的pgRNA长短不一，其中存在着大量的剪接型pgRNA(以下简称spRNA)。既往研究表明，部分肝细胞内的spRNA可以借助野生型pgRNA翻译的HBVDNA聚合酶进行逆转录形成剪接型DNA，并且发现血液中的剪接型DNA与肝脏疾病进展相关。至今，已有至少17种spRNA被发现存在于慢乙肝患者肝细胞内或者血液中，其中，SP1-RNA还可以翻译出剪接蛋白HBSP，据报道，血液中的HBSP也与肝病进展相关。

近年来，随着越来越多的研究揭示了血液中存在着HBV RNA，但是，作为剪接型DNA的前身物质--spRNA，其在血清HBV RNA中的占比如何以及具体的生物学功能如何，甚至对肝病进展的作用及影响，目前均没有明确的报道。因此，为了充分阐明上述问题，首先需要建立可特异性定量检测spRNA的方法，通过定量检测血清HBV RNA中spRNA水平，进而充分分析spRNA水平与肝病进展的关系，对于HBV领域的发展具有积极的意义。

发明内容

为此，本发明的第一个目的在于提供一种特异性定量检测乙型肝炎病毒(HBV)剪接型RNA的引物探针组合物，以解决现有技术中定量检测血清HBV RNA的定量方法绝大部分是同时检测了spRNA和非spRNA，无法对其中的spRNA水平进行特异性分析的问题；

本发明的第二个目的在于提供一种特异性定量检测乙型肝炎病毒(HBV)剪接型RNA的试剂盒，所述试剂盒通过设计HBV spRNA特异性探针引物，通过优化PCR反应体系，使得野生型pgRNA不能被定量检测，只能检测到spRNA，并通过构建系列spRNA和野生型pgRNA标准品进行验证检测特异性；

本发明的第三个目的在于提供上述引物探针组合物及试剂盒在HBV诊断、预防及治疗领域的应用。

为解决上述技术问题，本发明所述的一种检测HBV剪接型RNA的引物和探针组合物，包括分别在外显子剪接处上下游设计的正向引物spF、反向引物spR，以及特异性探针spProbe；其中，

所述正向引物spF选自如下SEQ ID No.13所示序列的片段或与SEQ IDNo.13所示序列的片段具有92％以上相似性的核酸序列：

SEQ ID No.13：

5’-GAATTAGTAGTCAGCTATGTCAATGTTAATATGGGCCTAAAAATCAG ACAACTACTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTTGGAAGAGAAACTGTTCTTGAGTATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCTGCTTACAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAAT-3’；

所述反向引物spR选自如下SEQ ID No.14所示序列的片段或与SEQ IDNo.14所示序列的片段具有92％以上相似性的核酸序列：

SEQ ID No.14：

5’-GAACATCAACTACCAGCACGGGACCATGCAAGACCTGCACGATTC CTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTT-3’；

所述特异性探针spProbe选自如SEQ ID No.13或SEQ ID No.14所示序列的片段或者与SEQ ID No.13或SEQ ID No.14所示序列的片段具有92％以上相似性的核酸序列。

本发明所述的一种检测HBV剪接型RNA的引物和探针组合物，所述引物探针组合物的靶基因位于HBV病毒基因组，例如可以是HBV亚型A、B、C、D、E、F、G、H或I基因型的基因组相同位置区域中的任意一种。

作为可以实施的方案，本发明所述的一种检测HBV剪接型RNA的引物和探针组合物，包括正向引物spF、反向引物spR以及探针spProbe；其中，

所述正向引物包括SEQ ID No.1-SEQ ID No.4任一项所示的核酸序列：

spF1：5’-AACTACTGTTGTTAGACGACGA-3’(SEQ ID No.1)；

spF2：5’-GAGGCAGGTCCCCTAGAAGA-3’(SEQ ID No.2)；

spF3：5’-TAGAAGAAGAACTCCCTCGCC-3’(SEQ ID No.3)；

spF4：5’-TTGGAGTGTGGATTCGCACTC-3’(SEQ ID No.4)；

所述反向引物包括SEQ ID No.5-SEQ ID No.8任一项所示的核酸序列：

spR1：5’-CCATAGGAATCTTGCGAAAGC-3’(SEQ ID No.5)；

spR2：5’-TGAGCCAGGAGAAACGGACTG-3’(SEQ ID No.6)；

spR3：5’-ATGGGAATACAAGTGCAGTTTCC-3’(SEQ ID No.7)；

spR4：5’-CAGGAATCGTGCAGGTCTTGCA-3’(SEQ ID No.8)；

所述探针包括SEQ ID No.9-SEQ ID No.12任一项所示的核酸序列：

spProbe1：5’-GTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGA-3’(SEQ ID No.9)；

spProbe2：5’-GGACCATGCAAGACCTGCACGAT-3’(SEQ ID No.10)；

spProbe3：5’-GTCGCAGAAGATCTCAATCTCG-3’(SEQ ID No.11)；

spProbe4：5’-ACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGC-3’(SEQ IDNo.12)。

具体的，所述检测HBV剪接型RNA的引物和探针组合物，所述探针包括TaqMan探针和/或杂交探针；

优选地，所述探针标记有荧光基团和/或淬灭基团；

优选地，所述荧光基团包括FAM、CYS、CY5、VIC、TET、JOE、HEX或ROX中的任意一种；

优选地，所述淬灭基团包括TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、NFQ、DABCYL或Eclipse中的任意一种。

本发明还公开了所述检测HBV剪接型RNA的引物和探针组合物用于制备检测HBV剪接型RNA的试剂盒的用途。

本发明还公开了一种用于检测HBV剪接型RNA的试剂盒，所述试剂盒包含所述的检测HBV剪接型RNA的引物和探针组合物。

具体的，所述试剂盒还包括预混液；

优选的，所述预混液包括酶混合液、dNTP混合液或PCR缓冲液中的一种或几种的混合溶液；

优选地，所述酶混合液包括DNA聚合酶和/或逆转录酶；

优选地，所述dNTP混合液包括dATP、dCTP、dGTP和dUTP；

优选地，所述PCR缓冲液中含有Mg

具体的，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。

本发明还公开了一种用于检测HBV剪接型RNA的RT-qPCR体系，包含所述的检测HBV剪接型RNA的引物和探针组合物。

具体的，所述RT-qPCR体系中：

所述引物和探针组合物中的引物在所述体系中的终浓度为0.1-1pmol/μL；

所述引物和探针组合物中的探针在所述体系中的终浓度为0.1-1pmol/μL。

作为优选的方案，所述体系还包括RNA模板、逆转录酶、DNA聚合酶、dNTPs和Mg

优选地，所述RNA模板在所述体系中的终浓度为10ng/μL-100μg/μL；

优选地，所述逆转录酶在所述体系中的终浓度为0.5-10U/μL；

优选地，所述DNA聚合酶在所述体系中的终浓度为0.005-0.05U/μL；

优选地，所述dNTPs在所述体系中的终浓度为20-200μmol/L；

优选地，所述Mg2+在所述体系中的终浓度为0.5-3.0mmol/L。

作为可实施的方案，所述的RT-qPCR体系，所述体系(20μl)包括：

具体的，本发明所述荧光定量PCR反应的条件可以根据实际体系进行常规的常识，如所述荧光PCR反应的条件为：92-98℃预变性10-30s；92-98℃变性10-20s，55-65℃退火40-60s，70-75℃延伸10-30s，共进行35-45个循环。优选地，在进行预变性之前，还包括45-55℃反转录5-10min的步骤。

本发明还公开了一种所述试剂盒或者所述RT-qPCR体系的非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，所述方法包括采用所述试剂盒或所述RT-qPCR体系对RNA样本进行RT-qPCR反应并检测的步骤。

本发明还公开了所述引物和探针组合物、或者所述试剂盒、或者所述RT-qPCR体系用于制备HBV相关疾病的诊断试剂的用途。

本发明所述检测HBV剪接型RNA的引物和探针组合物，通过针对性设计的引物和探针的组合物，并通过首次建立特异性定量检测spRNA的方法学，可以特异性定量检测血清spRNA水平，而野生型则不会被检出，有效解决了以往血清HBV RNA的定量方法不区分是否为剪接型的RNA进而影响检测结果判断的缺陷。

本发明所述检测HBV剪接型RNA的引物和探针组合物、试剂盒及RT-qPCR体系，可以实现HBV剪接型RNA的特异性检测，可用于特异性地分析spRNA的临床应用价值，临床上可用于阐明血清spRNA水平与肝病进展的相关性，具有较高的临床应用价值。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1为RT-qPCR标准品扩增曲线图；

图2为RT-qPCR标准曲线图(Crossing Point-Log Concentration)；

图3为已知的17种SpRNA结构；

图4为实施例4中血清样本中野生型pgRNA水平和spRNA水平检测结果；

图5为实施例5中患者SpRNA比例与ALT水平检测结果；

图6为实施例6中患者血清HBV spRNA水平检测结果；

图7为实施例7的设计策略示意图；

图8-9分别为对比例1-2的设计策略示意图。

具体实施方式

实施例1方法学的建立

HBV spRNA标准品的制备

在深圳华大基因(BGI，China)上合成部分sp1-RNA序列，并克隆至pGEM EasyVector(Promega)上，转染至大肠杆菌JM109(TAKARA)内，进行大量扩增。

本实施例中，所述部分sp1-RNA序列如下：

TTCACCTCTGCCTAATCATCTCATGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATTGACCCGTATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCTATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCATACAGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTGGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGACCCAGCATCCAGGGAATTAGTAGTCAGCTATGTCAATGTTAATATGGGCCTAAAAATCAGACAACTAYTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTTGGAAGAGAAACTGTTCTTGAGTATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCNGCTTACAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGAACATCAACTACCAGCACGGGACCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTGAACCCTAATAAAACCAAACGTTGGGGCTACTCCCTTAACTTCATGGGATATGTAATTGGAAGTTGGGGTACTTTACCNCAVGAACATATTGTACTAAAAMTCAAGCAATGTTTTCGNAAACTGCCTGTAAATAGACCTATTGATTGGAAAGTATGTCARAGAATTGTGGGTCTTTTGGGCTTTGCTGCCCCTTTTACACAATGTGGCTATCCTGCCTTVATGCCTTTATATGCATGTATA(SEQ ID No.15)。

使用Qiagen质粒Midi试剂盒(Qiagen)纯化含有目标序列的高质量DNA质粒。纯化后的质粒用Nde I(TAKARA)进行线性化，再使用T7RiboMAX

核酸提取

实验材料：

所述核酸提取的操作步骤如下：

(a)分别吸取888μl AL buffer至3管24.6μl carrier RNA，均匀吹打；

(b)加25μl蛋白酶到1.5ml ep管中，并加入200μl常温待提取血清(血清分装前吹打混匀)；

(c)每管加入200μl AL(carrier RNA浓度为28μg/ml)，涡旋震荡15s，并于56℃加热15分钟，加热时注意不要超过15min；

(d)加热后，瞬离加入250μl无水乙醇，涡旋震荡15s，室温放置5min；

(e)将过滤柱放置新的收集管，加入500μl Buffer AW1，于8000rpm离心1分钟；

(f)将过滤柱放置新的收集管，加入500μl Buffer AW2，8000rpm离心1分钟；

(g)将过滤柱放置新的收集管，加入650μl无水乙醇，8000rpm离心1分钟；

(h)将过滤柱放置新的收集管，14000rpm高速离心3min，2次；

(i)将过滤柱放置新的收集管，打开盖子，56℃加热3min；(该步骤收集管试剂盒无提供)，同时AVE预热；

(j)将过滤柱放置新的1.5ml ep管，加入53μl buffer AVE，室温放置5min；

(k)于13300rpm高速离心1min，操作2次，分装20μl-80°冻存，30μl进行DNase I消化处理。

DNase I消化处理

实验材料：DNase I(Thermo Fisher Scientific)，所述DNase I体系配置如下：

消化程序：37℃加热40min。

终止程序：加入EDTA(50mM)2μl，65℃加热10min。

RT-qPCR反应体系

实验材料：HBV spRNA特异性引物、探针、RNase-free water、4×

spF：5’-GAGGCAGGTCCCCTAGAAGA-3’(SEQ ID No.2)；

spR：5’-ATGGGAATACAAGTGCAGTTTCC-3’(SEQ ID No.7)；

HBV spProbe：5’-ACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGC-3’(SEQ ID No.12)。

具体的体系配置如下：

所述RT-qPCR反应参数如下表1。

表1 RT-qPCR反应参数

本实施例中，所述RT-qPCR标准品扩增曲线图如附图1所示，RT-qPCR标准曲线图如附图2所示。

实施例2方法学的特异性检验

构建SP2-SP17RNA标准品和野生型pgRNA标准品

依据已知HBV spRNA的结构(如图3所示)和野生型pgRNA结构，在深圳华大基因(BGI，China)上合成spRNA和野生型pgRNA标准品，经克隆至pGEM Easy Vector(Promega)上，转染至大肠杆菌JM109(TAKARA)内，进行大量扩增。

使用Qiagen质粒Midi试剂盒(Qiagen)纯化含有目标序列的高质量DNA质粒。纯化后的质粒用Nde I(TAKARA)线性化，再使用T7 RiboMAX

利用上述实施例1中建立的spRNA定量方法同时扩增检测其他spRNA和野生型pgRNA的具体扩增结果如下表2所示。

表2各种spRNA和野生型pgRNA的定量检测结果

可见，本发明所述方法能准确定量大部分的spRNA，而无法扩增检测到野生型pgRNA，可用于pgRNA的定量检测。

实施例3 spRNA定量检测方法的性能

针对实施例1-2中方法，本实施例中，通过检测10倍倍比稀释的spRNA标准品，构建spRNA方法的标准曲线，并通过标准曲线的斜率(E＝10(

同时，通过对系列梯度浓度的spRNA标准品进行检测，明确了spRNA定量方法的线性范围为2×10

进一步的，对高、中、低spRNA浓度的3份样本进行4次独立检测，每次检测设置3个复孔，所得到的结果显示，所有样本的重复结果的变异系数均小于15％。

此外，通过对30例非HBV感染者的血清进行spRNA检测，结果均为阴性，提示了该方法的临床特异性为100％。

本发明所述方法相关特性总结见下表3。

表3方法相关特异性总结

实施例4临床应用

本实施例利用建立的spRNA定量方法定量检测慢性乙型肝炎患者血清spRNA的水平。

在南方医院肝病门诊收集了279例慢性乙型肝炎患者的血清样本，分别按照前述实施例1中建立的方法，定量检测血清样本中野生型pgRNA水平和spRNA水平，结果如图4所示。

结果显示，spRNA与野生型pgRNA水平高度相关，相关系数达0.95，通过Bland-Altman分析，发现患者的spRNA水平较野生型pgRNA水平平均低1.99log

实施例5spRNA预测肝脏炎症

本实施例采用上述实施例1建立的spRNA特异性定量方法检测189例样本来源于普通肝炎患者血清HBV RNA水平，结果如图5所示。

经过统计学分析发现，普通肝炎患者中ALT水平与血清spRNA比例呈正比，提示血清spRNA与慢乙肝患者肝脏炎症呈正比，是肝脏炎症潜在的预测标志物。本发明所述引物和探针的组合物可以用于spRNA的定量检测，后续可用于肝脏炎症的预测。

实施例6 spRNA预测肝硬化

本实施例采用上述实施例1建立的spRNA特异性定量方法检测189例样本来源于普通肝炎患者和90例肝硬化患者血清HBV spRNA水平，结果如图6所示。

经统计分析发现，肝硬化组患者spRNA比例较普通肝炎患者高，多因素COX回归分析发现，校正各种混杂因素后，spRNA的比例是肝硬化的独立危险因素(见下表4)，提示spRNA可能是乙肝患者的肝硬化预测标志物。本发明所述引物和探针的组合物可以用于spRNA的定量检测，后续可用于肝硬化的预测。

表4肝硬化相关因素分析结果

注：较高spRNA比例定义为spRNA比例>1.27％，这还是所有入选患者中spRNA比例的中位数；ALT-丙氨酸转氨酶。

实施例7

如图7所示的设计思路，为了特异性定量检测spRNA，本实施例中，在外显子1和外显子2剪接处的上下游设计正向和反向引物，在剪接处上游设计特异性探针，然后通过调整优化PCR延伸时间，使得引物探针组合无法扩增、检测到野生型pgRNA(该引物探针组合扩增的野生型pgRNA为1469bp，而spRNA目的片段长度为213bp)。

本实施例设计如下引物探针组合，其中，引物序列为：

spF：5’-GAGGCAGGTCCCCTAGAAGA-3’(SEQ ID No.2)；

spR：5’-ATGGGAATACAAGTGCAGTTTCC-3’(SEQ ID No.7)；

spProbe：5’-ACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGC-3’(SEQ ID No.12)。

本实施例中，经过优化后的该引物探针组合可特异性地定量检测spRNA，却无法扩增到野生型的pgRNA。

对比例1

由于spRNA种类复杂，本对比例方案中，依据大部分spRNA共有的序列进行特异性引物、探针设计，以验证。

如图8所示的设计思路，为了特异性定量检测spRNA，本对比例中，在靶向外显子1和外显子2剪接处设计特异性探针，在剪接处上下游分别设计正向和反向引物。

利用NCBI网站上的引物设计工具设计了多对特异性引物探针，序列如下：

sp：5’-FAM-ATCTCGGGAAYCTCAATGATCDTCRAC-BHQ-3’(SEQ IDNo.16)。

经过反复实验，发现直接靶向剪接处的探针表现性能不佳，与系列上下游引物组合搭配均未能显示出较好的定量性能。可见，针对spRNA定量检测引物及探针的设计是十分复杂的。

对比例2

由于spRNA种类复杂，本对比例方案中，依据大部分spRNA共有的序列进行特异性引物、探针设计，以验证。

如图9所示的设计思路，为了特异性定量检测spRNA，本对比例中，基于外显子1和外显子2剪接处设计正向和反向引物，使得其理论上特异性检测spRNA。

利用NCBI网站上的引物设计工具设计了多对HBV spRNA特异性引物探针，经过系列实验探索，最终筛选到扩增性能较佳的引物探针组合，其中，引物序列为：

SP-F1：5'-AGTGTGGATTCGCACTCC-3’(SEQ ID No.17)；

SP-R1：5’-TGGTWGTTGATGWTCATTGAGATTC-3’(SEQ ID No.18)；

探针序列为SP-Probe：5’-ACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGC-3’(SEQ ID No.19)。

本对比例利用这对引物探针组合检测野生型pgRNA和spRNA，发现不管如果调整、优化反应条件，该引物探针组合总能检测到野生型的pgRNA，使得定量的spRNA结果可能存在高估的情况。因此，需进一步调整引物探针设计组合。

综上，本发明通过针对性设计的引物和探针的组合物，可以特异性定量检测血清spRNA水平，并通过首次建立特异性定量检测spRNA的方法学，有效解决了以往血清HBV RNA的定量方法不区分是否为剪接型的RNA进而影响检测结果判断的缺陷，进而将其运用于临床上，可特异性地分析spRNA的临床应用价值，进而用于阐明血清spRNA水平与肝病进展的相关性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。