用于检测赭曲霉毒素A的荧光探针及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及有害物检测技术领域，尤其涉及用于检测赭曲霉毒素A的荧光探针及其制备方法与应用。

背景技术

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是真菌属(曲霉等)产生的初级真菌毒素和次生真菌代谢物。它经常在食品(包括谷物及其衍生物、啤酒、葡萄酒、香料和咖啡)的生产、加工、储存和运输过程中由于处理不当产生。这种污染延伸到整个食品供应链，造成了巨大的经济损失。已有研究表明，OTA可以渗透到人类和动物的食物链中，对两者的健康产生严重的有害影响，如致癌性、肾毒性、肝毒性、遗传毒性和神经毒性。因此，OTA已被国际癌症研究机构(IARC)列为2B类致癌物。欧盟委员会制定了严格的指导方针，规定食品中OTA的最大允许残留量为0.5至30ppb。同样，中国食品安全国家标准GB2761-2017规定，食品中OTA的最大允许残留量(MRL)应在2-10ppb范围内。因此，开发食品中OTA的可靠分析方法具有至关重要的意义。

目前已经有多种检测OTA的方法。传统方法包括高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)、液相色谱-质谱法(LC-MS/MS)和高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS/MS)。虽然这些方法具有良好的灵敏度和准确性，但它们通常需要昂贵的仪器，专业的操作人员和复杂的样品制备过程，因而不足以轻松快速地检测实际样品中的分析物。

相比于传统方法，荧光法具有响应快、灵敏度高、选择性高、可直接原位检测目标物的特点和优势。到目前为止，已经报道了许多用于OTA检测的荧光探针。其中大多数是适配体探针，利用OTA特异性适配体作为识别片段。然而，这些感应探针的反应时间往往较长(＞10分钟)，这是由于修饰引起的与OTA的亲和力降低和适体重构过程缓慢。其他荧光方法都有各自的缺点，如灵敏度差、便携性差、适用范围窄等。因此，开发一种能够快速、方便地检测实际食品样品中OTA的方法是迫切需要的。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明提供了用于检测赭曲霉毒素A的荧光探针及其制备方法与应用，旨在解决现有检测方法检测赭曲霉毒素A时的高成本、检测速度慢、复杂操作和适用范围窄的技术问题。

具体地，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种用于检测赭曲霉毒素A的荧光探针，所述荧光探针为荧光染料DOCE与血清白蛋白(albumin,ALB)通过氢键结合的复合物；

所述荧光染料DOCE的化学结构式如下所示：

本发明还提供一种所述的荧光探针的制备方法，包括步骤：

将2-羟基苯乙酮和4-(二甲氨基)肉桂醛反应，得到中间产物HSF；

将所述中间产物HSF和2-乙基丁酰氯进行酯化反应，得到所述荧光染料DOCE；

将所述荧光染料DOCE与血清白蛋白混合，得到所述荧光探针。

所述的荧光探针的制备方法，其中，所述将2-羟基苯乙酮和4-(二甲氨基)肉桂醛反应，得到中间产物HSF的步骤，包括：

将2-羟基苯乙酮和4-(二甲氨基)肉桂醛溶于乙醇中，得到反应溶液，在所述反应溶液中加入氢氧化钾溶液，室温搅拌后置于冰浴中，加入双氧水溶液后，再放置于室温下进行搅拌，加入冰水和盐酸，得到沉淀物，将所述沉淀物过滤、洗涤，得到所述中间产物HSF。

所述的荧光探针的制备方法，其中，将所述中间产物HSF和2-乙基丁酰氯溶于N,N-二甲基甲酰胺中，得到混合溶液进行酯化反应，得到所述荧光染料DOCE的步骤，包括：

将所述中间产物HSF和2-乙基丁酰氯溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，得到混合溶液，在所述混合溶液中加入碳酸铯，室温搅拌，进行酯化反应后经二氯甲烷提取、干燥、减压蒸馏和纯化，得到所述荧光染料DOCE。

所述的荧光探针的制备方法，其中，所述荧光染料DOCE与所述血清白蛋白的摩尔比为1:1。

本发明提供了一种定量检测面粉中赭曲霉毒素A(OTA)的方法，包括：

将面粉浸泡在PBS缓冲液和甲醇的混合溶液中，得到面粉混合物，将所述面粉混合物涡旋、超声处理，得到悬浮液，离心后取上清液作为测试液；

在所述测试液中加入所述荧光探针，再滴加不同浓度梯度的赭曲霉毒素A溶液，测量荧光光谱，建立发射峰的荧光强度比率与赭曲霉毒素A浓度的标准曲线，确定赭曲霉毒素A的检测限；

利用所述标准曲线定量检测未知的面粉样品中赭曲霉毒素A的含量。

所述的定量检测面粉中赭曲霉毒素A的方法，其中，所述PBS缓冲液和所述甲醇的混合比例为4:1。

所述的定量检测面粉中赭曲霉毒素A的方法，其中，所述发射峰的荧光强度比率为荧光光谱中450nm和575nm的发射峰的比值。

本发明还提供了一种定性检测葡萄酒中赭曲霉毒素A的方法，包括：

将葡萄酒过滤，得到除去不溶物和色素的滤液，在所述滤液中加入所述荧光探针后作为空白组，进行紫外光照射，拍摄所述空白组的荧光颜色；

在所述滤液中加入赭曲霉毒素A溶液，再加入所述荧光探针后作为测试组，进行紫外光照射，拍摄所述测试组的荧光颜色；

对比所述空白组与所述测试组的荧光颜色，建立赭曲霉毒素A的定性分析标准；

利用所述定性分析标准对未知的葡萄酒样品中的赭曲霉毒素A进行定性检测。

所述的定性检测葡萄酒中赭曲霉毒素A的方法，其中，所述紫外光照射采用365nm激发波长。

有益效果：

本发明提供了用于检测赭曲霉毒素A的荧光探针及其制备方法与应用，将所述荧光探针为荧光染料DOCE与血清白蛋白ALB通过氢键结合的复合物，可用于快速定量或定性检测赭曲霉素A(OTA)，本发明中OTA的检测方法具有超快的响应速度(5秒)，高灵敏度(检测限为0.39ppb)，以及高选择性。所述荧光探针在检测OTA时，其荧光信号会实现从黄色到蓝色的颜色变化，该响应信号可以由智能手机直接识别，并已成功应用于面粉、白葡萄酒和红葡萄酒等真实食品样品的现场快检。

附图说明

图1为本发明实施例中荧光染料DOCE的化学结构的核磁共振氢谱。

图2为本发明实施例中荧光染料DOCE的化学结构的核磁共振碳谱。

图3为本发明实施例中荧光染料DOCE的化学结构的质谱。

图4中(a)为本发明实施例中血清白蛋白ALB滴定荧光染料DOCE(10μM)的荧光光谱(λ＝400nm)；(b)为荧光染料DOCE与血清白蛋白ALB以不同比例混合(总浓度保持在10μM)的峰强度Job’s plot分析；(c)为荧光染料DOCE与血清白蛋白ALB结合前后的荧光衰减曲线(IRF:仪器响应功能，激光源为392nm的NanoLED)；(d)为AutoDock 4.0分子对接实验结果图(荧光染料DOCE显示为黑色，血清白蛋白ALB显示为灰色)；(e)为Ligplot处理后的荧光探针DOCE@ALB二维图。

图5中(a)为各种真菌毒素的化学结构；(b)为利用分子对接技术(AutoDock 4.0)计算各真菌毒素与人血清白蛋白ALB(蛋白数据库：4K2C)的结合模式和结合能；(c)为荧光染料DOCE及荧光探针的化学结构图；(d)为荧光探针DOCE@ALB选择性检测OTA的IDA传感机制示意图。

图6为本发明实施例中荧光探针DOCE@ALB对赭曲霉毒素A(OTA)的传感性能测试图，其中包括：(a)荧光响应时间，(b)光谱响应方式，(c)线性响应曲线及检测限，(d)检测的特异性。

图7为本发明实施例中荧光探针DOCE@ALB对面粉提取液中OTA的传感性能测试图，其中包括：(a)面粉中OTA的提取步骤、(b)探针对OTA的荧光光谱响应、(c)荧光强度比率与OTA浓度的线性关系。

图8为本发明实施例中荧光探针DOCE@ALB对葡萄酒中OTA的快速定性检测结果图，其中包括：(a)白葡萄酒、(b)红葡萄酒；图中C为空白组(不含OTA)，T为测试组(含OTA)。

具体实施方式

本发明提供用于检测赭曲霉毒素A的荧光探针及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明的保护范围。

本发明实施例提供一种用于检测赭曲霉毒素A的荧光探针，所述荧光探针为荧光染料DOCE与血清白蛋白(albumin,ALB)通过氢键结合的复合物；

所述荧光染料DOCE的化学结构式如下所示：

荧光染料DOCE分子通过氢键结合到血清白蛋白ALB的药物位点(DS1)，形成络合物DOCE＠ALB。荧光染料DOCE与血清白蛋白ALB结合后，限制了荧光染料DOCE的分子内旋转，荧光寿命延长。其中，血清白蛋白ALB是一种在血清中含量丰富的蛋白质，具有多种拓扑结合腔，可与多种配体结合，如氨基酸、脂质、药物以及小分子荧光染料。因此，血清白蛋白ALB可以与荧光染料DOCE小分子通过氢键结合构建了主体-客体超分子体系，可作为用于检测赭曲霉毒素A的荧光探针。

本发明实施例提供一种荧光探针的制备方法，包括步骤：

将2-羟基苯乙酮和4-(二甲氨基)肉桂醛反应，得到中间产物HSF；

将所述中间产物HSF和2-乙基丁酰氯进行酯化反应，得到所述荧光染料DOCE；

将所述荧光染料DOCE与血清白蛋白ALB混合，得到所述荧光探针。

上述制备方法中通过Claisen-Schmidt缩合反应、Algar-Flynn-Oyamada反应和酯化反应等一系列化学反应合成了全新的荧光染料DOCE，其全称为：2-(4-(二甲基氨基)苯乙烯基)-4-氧代-4H-色烯-3-基-2-乙基丁酸(2-(4-(dimethylamino-)styryl)-4-oxy-4h-chromen-3-2-ethylbutyrate，DOCE)。

在一些实施方式中，所述将2-羟基苯乙酮和4-(二甲氨基)肉桂醛反应，得到中间产物HSF的步骤，包括：

将2-羟基苯乙酮和4-(二甲氨基)肉桂醛溶于乙醇中，得到反应溶液，在所述反应溶液中加入氢氧化钾溶液，室温搅拌后置于冰浴中，加入双氧水溶液后，再放置于室温下进行搅拌，加入冰水和盐酸，得到沉淀物，将所述沉淀物过滤、洗涤，得到所述中间产物HSF。

在一些实施方式中，将所述中间产物HSF和2-乙基丁酰氯溶于N,N-二甲基甲酰胺中，得到混合溶液进行酯化反应，得到所述荧光染料DOCE的步骤，包括：

将所述中间产物HSF和2-乙基丁酰氯溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，得到混合溶液，在所述混合溶液中加入碳酸铯，室温搅拌，进行酯化反应后经二氯甲烷提取、干燥、减压蒸馏和色谱柱纯化，得到所述荧光染料DOCE。

在一些实施方式中，所述荧光染料DOCE与所述血清白蛋白ALB的摩尔比为1:1。

本发明实施例提供了一种定量检测面粉中赭曲霉毒素A的方法，包括：

将面粉浸泡在PBS缓冲液和甲醇的混合溶液中，得到面粉混合物，将所述面粉混合物涡旋、超声处理，得到悬浮液，离心后取上清液作为测试液；

在所述测试液中加入所述荧光探针，再滴加不同浓度梯度的赭曲霉毒素A溶液，测量荧光光谱，建立发射峰的荧光强度比率与赭曲霉毒素A浓度的标准曲线，确定赭曲霉毒素A的检测限；

利用所述标准曲线定量检测未知的面粉样品中赭曲霉毒素A的含量。

在一些实施方式中，所述PBS缓冲液和所述甲醇的混合比例为4:1。

在一些实施方式中，所述发射峰的荧光强度比率为荧光光谱中450nm和575nm的发射峰的比值。

本发明实施例还提供了一种定性检测葡萄酒中赭曲霉毒素A的方法，包括：

将葡萄酒过滤，得到除去不溶物和色素的滤液，在所述滤液中加入所述荧光探针后作为空白组，进行紫外光照射，拍摄所述空白组的荧光颜色；

在所述滤液中加入赭曲霉毒素A溶液，再加入所述荧光探针后作为测试组，进行紫外光照射，拍摄所述测试组的荧光颜色；

对比所述空白组与测试组的荧光颜色，建立赭曲霉毒素A的定性分析标准；

利用所述定性分析标准对未知的葡萄酒样品中的赭曲霉毒素A进行定性检测。

上述定量或定性检测褚曲霉毒素A的方法中，采用荧光探针DOCE＠ALB，为一种主客体相互作用的超分子识别系统，依赖于通过靶分子和光学指示剂之间的竞争性结合过程产生的信号响应，称为指示剂置换测定(IDA)。IDA检测的显著特点为对目标分子的超快响应时间(以秒为单位)，因其对非共价键的变化敏感，而不基于反应的化学传感器中的共价键的变化。因此，本发明实施例中的检测方法具有快速、灵敏的优势。

褚曲霉毒素A(OTA)与血清白蛋白ALB的结合能为-10.35kcal/mol，而其它常见的真菌毒素，如黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、桔霉素(Citrinin)、脱氧雪腐镰刀菌醇(DON)和展青霉素(Patulin)，与血清白蛋白ALB的结合能为-7.88～-5.35kcal/mol。为此筛选一种荧光染料DOCE，其与血清白蛋白ALB的结合能为-8.59kcal/mol，表明其与血清白蛋白ALB的结合能力小于OTA，但是大于其它真菌毒素。因此，将荧光染料DOCE与血清白蛋白ALB复合并制备得到超分子的荧光探针DOCE＠ALB，OTA能够破坏荧光染料DOCE与血清白蛋白ALB之间的结合，从而引起荧光探针DOCE＠ALB的荧光响应，而其他的真菌毒素不会引起荧光信号的响应，因此将荧光探针DOCE＠ALB应用在定性和定量检测食品中褚曲霉毒素A时，能够达到高选择性的效果。

在一些具体的实施方式中，所述紫外光照射采用365nm激发波长。

下面以具体的实施例对本发明的方案作进一步的说明。

实施例1

荧光染料DOCE的合成路线为：

根据上述合成路线，具体制备步骤如下：

将2-羟基苯乙酮(10mmol)和4-(二甲氨基)肉桂醛(10mmol)溶于20mL乙醇中。然后，在反应溶液中加入10mL(50mmol/L)氢氧化钾水溶液，室温搅拌12小时。将反应器置于冰浴中，缓慢加入5mL 30％双氧水溶液，室温搅拌12小时。将混合物倒入冰水中，用稀盐酸中和。所得沉淀物经过过滤、收集，并用冷乙醇洗涤。得到中间产物HSF，收率为60％。然后，将10mmol中间产物HSF和10mmol 2-乙基丁酰氯溶解于20mL的超干N,N-二甲基甲酰胺中。在溶液中加入5mmol碳酸铯，室温搅拌12小时，反应完成后，加入100mL水。用20mL二氯甲烷提取3次，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，色谱柱纯化。得到最终产物荧光染料DOCE，产率为60％。

结构表征：荧光染料DOCE的核磁共振氢谱如图1所示，荧光染料DOCE的核磁共振碳谱如图2所示，荧光染料DOCE的质谱如图3所示。表明上述合成步骤通过Claisen-Schmidt缩合反应、Algar-Flynn-Oyamada反应和酯化反应等一系列化学反应合成了荧光染料DOCE。

实施例2

将荧光染料DOCE与重组的人血清白蛋白ALB(采购自Sigma-Aldrich公司，货号A9731)按1：1的摩尔比，制备得到超分子的荧光探针DOCE@ALB，荧光染料DOCE与血清白蛋白ALB结合前后的荧光光谱发生变化，其结合机理与荧光光谱变化如下：如图4中(a)所示，在水中荧光染料DOCE的荧光强度最小，但加入血清白蛋白ALB后，其荧光逐渐增强，在575nm处出现一次发射峰。如图4中(b)所示，Job’s plot实验明确地表明荧光染料DOCE和血清白蛋白ALB可以以1:1的摩尔比形成结合络合物。此外，与ALB相互作用后，荧光染料DOCE的荧光寿命从1.29ns延长至1.93ns，表明与ALB的结合限制了荧光染料DOCE的分子内旋转(RIR)，如图4中(c)所示。通过分子对接技术计算荧光探针DOCE@ALB可能的结合模式，如图4中(d)和(e)所示。结果表明，荧光染料DOCE通过氢键结合到白蛋白的药物位点(DS1)。

将荧光探针DOCE＠ALB溶液采取避光、低温(低于10摄氏度)的条件保存。

荧光探针DOCE@ALB快速、高选择性检测褚曲霉毒素A(OTA)的作用机理研究

如图5中(a)所示，当食物被霉菌污染时，OTA与各种真菌毒素同时产生，如黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、桔霉素(Citrinin)、脱氧雪腐镰刀菌醇(DON)和展青霉素(Patulin)。研究表明，所有这些真菌毒素都能与血清白蛋白(ALB)的药物位点1(DS1)结合。如图5中(b)所示，采用分子对接技术，计算真菌毒素与ALB之间的结合能，其值为-10.35～-5.35(kcal/mol)。可知，OTA与ALB的结合亲和力最高。基于IDA原理，假设通过使用一种与血清白蛋白ALB结合能恰好落在OTA和其他真菌毒素之间的合适荧光指示剂，只有OTA才能有效地将指示剂从其ALB复合物置换为自由分子形式。这个位移过程会触发指示剂的荧光变化，从而可以选择性地检测OTA。如图5中(c)所示，筛选一种荧光指示剂2-(4-(二甲基氨基)苯乙烯基)-4-氧代-4H-色烯-3-基-2-乙基丁酸(2-(4-(dimethylamino-)styryl)-4-oxy-4h-chromen-3-2-ethylbutyrate，DOCE)。该荧光染料DOCE与血清白蛋白ALB的结合能(-8.59kcal/mol)介于OTA与其他真菌毒素的结合能之间。理论上，这种定位可以使OTA有效地将DOCE从其ALB结合的复合物中取代，而其他真菌毒素则不能，进而实现高选择性地检测OTA，如图5中(d)所示。

实施例3

配制不同浓度梯度的OTA标准品

如图6中(a)所示，荧光探针DOCE＠ALB本身对紫外光照射具有较好的光稳定性,加入OTA后，荧光探针DOCE＠ALB在5秒内快速响应并达到峰值，信号稳定输出时间大于10分钟。如图6中(b)所示，在400nm激发光下，随着OTA浓度的增加，探针在575nm处的荧光峰持续下降，在450nm处的荧光峰持续上升，荧光颜色逐渐由黄色变为蓝色。如图6中(c)所示，荧光探针DOCE@ALB在450nm与575nm处的荧光强度比(I450/I575)与OTA的浓度呈现良好的线性关系，计算得出的检测限(LOD)为0.99nM(约0.39ppb)。如图6中(d)所示，荧光探针DOCE@ALB对OTA的荧光响应，远超其他常见的真菌毒素，如黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、桔霉素(Citrinin)、脱氧雪腐镰刀菌醇(DON)和展青霉素(Patulin)，证明该荧光探针DOCE@ALB具有良好的检测特异性。

实施例4

荧光探针DOCE@ALB用于快速定量检测面粉中OTA

如图7中(a)所示，面粉样品提取液的提取步骤分为5步：

(1)取5克面粉并浸泡在50毫升PBS缓冲液和甲醇(摩尔比为4:1)的混合溶液中，形成面粉混合物；

(2)将面粉混合物进行10分钟的涡旋；

(3)继续进行10分钟的超声处理，得到悬浮液；

(4)再将得到的悬浮液以7000转/分钟的速度通过离心机离心10分钟；

(5)取上清液，即面粉样品提取液作为测试液。

然后，将2mL测试液加入石英比色皿，用移液枪加入2μL浓度为1mmol/L的荧光探针DOCE@ALB，最后滴加不同浓度梯度的OTA溶液，在400nm激发光下，用荧光分光光度计测量荧光光谱。

以荧光光谱中450nm和575nm的发射峰的比值，建立荧光强度比率与OTA浓度的标准曲线，并确定OTA的检测限。

如图7中(b)所示，本实施例中加入含有不同浓度OTA(10nmol/L～1μmol/L)的面粉样品提取液，荧光探针DOCE@ALB的荧光光谱发生了快速的响应，探针在575nm处的荧光峰下降，在450nm处的荧光峰上升，荧光颜色逐渐由黄色变为蓝色。如图7中(c)所示，荧光探针DOCE@ALB在450nm与575nm处的荧光强度比(I450/I575)与OTA的浓度呈现良好的线性关系，建立荧光强度比率与OTA浓度的标准曲线，并确定OTA的检测限，检测限为3.7ppb。基于该曲线可以实现对未知面粉样品中OTA含量的快速检测。

实施例5

超分子荧光探针DOCE@ALB用于快速定性分析葡萄酒中OTA

如图7所示，白葡萄酒与红葡萄酒的检测方法是一致的，其处理步骤为：

将5mL的葡萄酒通过聚丙烯酰胺(PMA)的注射器过滤柱缓慢过滤，以除去葡萄酒中的不溶物和色素，得到滤液。

空白组：将2mL滤液加入石英比色皿，用移液枪加入2μL浓度为1mmol/L的荧光探针DOCE@ALB，作为空白组对照，利用手持式紫外灯(365nm激发波长)照射，拍摄比色皿中空白组溶液的颜色。

对照组：将已添加OTA的2mL滤液加入石英比色皿，用移液枪加入2μL浓度为1mmol/L的荧光探针DOCE@ALB，作为测试组，利用手持式紫外灯(365nm激发波长)照射，拍摄比色皿中测试组溶液的颜色。由图7所示，空白组的荧光颜色为黄色，测试组的荧光颜色为蓝色，利用空白组与测试组中荧光颜色的差异，建立OTA的定性分析的标准(RGB)。通过颜色对比即可对葡萄酒样品中OTA进行定性检测。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。