一种胸腺法新中三乙胺溶剂的检测方法

技术领域

本发明具体涉及一种胸腺法新中三乙胺溶剂的检测方法。

背景技术

胸腺法新又称胸腺肽α

胸腺法新的合成方法主要为固相多肽合成法，在合成过程中，不同厂家使用了不同的有机溶剂，如甲醇、乙腈、二氯甲烷、醋酸乙酯、吡啶、三乙胺等。程磊等采用气相色谱法测定了胸腺法新中5种有机溶剂甲醇、乙腈、二氯甲烷、吡啶、N,N-二甲基甲酰胺的残留量，张洁等采用了气相色谱法测定了胸腺法新中乙腈、二氯甲烷、醋酸乙酯、苯和苯甲醚5种溶剂的残留，目前还没有胸腺法新中三乙胺残留的检测方法研究。有必要开发一种针对胸腺法新中三乙胺残留的测定方法，以更全面控制胸腺法新的质量。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种胸腺法新中三乙胺的检测方法，它是采用顶空气相色谱法检测，具体步骤如下：

1)对照品溶液制备：取三乙胺，加N,N-二甲基甲酰胺溶解，溶解液加碱性溶液混匀，得对照品溶液；

2)供试品溶液的制备：取胸腺法新，加碱性溶液溶解，再加N,N-二甲基甲酰胺混匀，得供试品溶液；

3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入顶空气相色谱仪，色谱条件如下：以6％氰丙基苯-94％二甲基聚硅氧烷为固定液或极性相近的毛细管柱为色谱柱；色谱柱程序升温：起始温度为35～45℃，维持6分钟，再以每分钟8℃的速率升温至90℃，维持2分钟，再以每分钟20℃的速率升温至200℃，维持5分钟。

进一步地，步骤1)所述溶解液每1ml中含三乙胺100～10000μg。

进一步地，步骤1)所述溶解液与碱性溶液的体积比为1～5：1～5。

进一步地，步骤2)所述胸腺法新、碱性溶液和N,N-二甲基甲酰胺的质量体积比为0.1～1g：1ml：1ml。

更进一步地，所述碱性溶液为氢氧化纳溶液，优选1mol/L氢氧化钠溶液。

进一步地，步骤3)所述色谱柱为Agilent DB-624，30m*530μm*3μm或HP-5，30m*530μm*3μm。

进一步地，所述顶空气相色谱仪的顶空进样参数为：定量环温度：100℃；传输线温度：105℃；顶空加热箱温度：80℃；进样持续时间：1min；样品瓶平衡：30min；GC循环：30min。

更进一步地，所述顶空进样参数还包括进样口温度为200℃；分流比：10～50：1；检测器:FID，检测器温度：250℃；空气流量：300ml/min；氢气燃气流量：40ml/min；载气为氮气，色谱柱流量N2：2ml/min，优选分流比为50:1。

进一步地，步骤3)所述色谱柱程序升温中起始温度为40℃。

进一步地，所述胸腺法新中三乙胺的含量按外标法以峰面积计算。

本发明胸腺法新中三乙胺溶剂的检测方法，通过特定的顶空进样参数和气相色谱条件，能准确测定胸腺法新中三乙胺，且灵敏度和精确度高，检测限低，具备实际推广应用价值。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1专属性试验色谱图

图2溶剂色谱图

图3乙腈定位色谱图

图4二氯甲烷定位色谱图

图5乙酸乙酯定位色谱图

图6苯定位色谱图

图7三乙胺定位色谱图

图8苯甲醚定位色谱图

图9三乙胺检出限色谱图

图10三乙胺定量限色谱图

图11三乙胺线性1色谱图

图12三乙胺线性2色谱图

图13三乙胺线性3色谱图

图14三乙胺线性4色谱图

图15三乙胺线性5色谱图

图16三乙胺线性6色谱图

图17线性回归方程曲线图

图18三乙胺回收试验色谱图

图19三乙胺回收试验对照色谱图

图20三乙胺回收试验样品色谱图

图21三乙胺准确度试验色谱图

图22三乙胺准确度样品色谱图

图23三乙胺中间精密度试验色谱图

图24三乙胺中间精密度对照色谱图

图25三乙胺中间精密度样品色谱图

图26三乙胺进样精密度色谱图

图27三乙胺溶液稳定性1试验色谱图

图28三乙胺溶液稳定性2试验色谱图

图29三乙胺溶液稳定性3试验色谱图

图30三乙胺检测方法耐用性试验(初始温度35℃)色谱图

图31三乙胺检测方法耐用性试验(初始温度45℃)色谱图

图32三乙胺检测方法耐用性试验(分流比5:1)色谱图

图33三乙胺检测方法耐用性试验(分流比10:1)色谱图

图34三乙胺检测方法耐用性试验(分流比20:1)色谱图

图35三乙胺检测方法耐用性试验(更换色谱柱)色谱图

图36三乙胺检测方法耐用性试验(原条件)色谱图

图37三乙胺残留检测(样品)色谱图

图38三乙胺残留检测(对照)色谱图

具体实施方式

实施例1、胸腺法新中三乙胺残留检测

1)对照品溶液的制备：精密称取三乙胺，用N,N-二甲基甲酰胺定量稀释制成每1ml中含三乙胺1000μg的溶液，取该溶液1.0ml与1.0ml的1mol/L氢氧化钠溶液一并置于20ml顶空瓶中，混匀，密封，作为对照品溶液；

2)供试品溶液的制备：精密称定胸腺法新0.2g，置20ml顶空瓶中，精密加入1mol/L氢氧化钠溶液1.0ml溶解，再精密加入N,N-二甲基甲酰胺1.0ml，混匀，密封，作为供试品溶液；

3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入顶空气相色谱仪，色谱条件如下：色谱柱：Agilent DB-624(30m*530μm*3μm)；色谱柱程序升温：起始温度为40℃，维持6分钟，再以每分钟8℃的速率升温至90℃，维持2分钟，再以每分钟20℃的速率升温至200℃，维持5分钟；顶空进样参数：定量环温度：100℃；传输线温度：105℃；顶空加热箱温度：80℃；进样持续时间：1min；样品瓶平衡：30min；GC循环：30min；进样口温度为200℃；分流比：50:1；检测器:FID，检测器温度：250℃；空气流量：300ml/min；氢气燃气流量：40ml/min；载气为氮气，色谱柱流量N2：2ml/min；

4)按外标法以峰面积计算胸腺法新中三乙胺含量。

实施例2、胸腺法新中三乙胺残留检测

1)对照品溶液的制备：精密称取三乙胺，用N,N-二甲基甲酰胺定量稀释制成每1ml中含三乙胺1000μg的溶液，取该溶液1.0ml与1.0ml的1mol/L氢氧化钠溶液一并置于20ml顶空瓶中，混匀，密封，作为对照品溶液；

2)供试品溶液的制备：精密称定胸腺法新0.2g，置20ml顶空瓶中，精密加入1mol/L氢氧化钠溶液1.0ml溶解，再精密加入N,N-二甲基甲酰胺1.0ml，混匀，密封，作为供试品溶液。；

3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入顶空气相色谱色谱仪，色谱条件如下：色谱柱：HP-5(30m*530μm*3μm)；色谱柱程序升温：起始温度为35℃，维持6分钟，再以每分钟8℃的速率升温至90℃，维持2分钟，再以每分钟20℃的速率升温至200℃，维持5分钟；顶空进样参数：定量环温度：100℃；传输线温度：105℃；顶空加热箱温度：80℃；样持续时间：1min；样品瓶平衡：30min；GC循环：30min；进样口温度为200℃；分流比：10:1；检测器:FID，检测器温度：250℃；空气流量：300ml/min；氢气燃气流量：40ml/min；载气为氮气，色谱柱流量N2：2ml/min；

4)按外标法以峰面积计算胸腺法新中三乙胺含量。

实施例3、胸腺法新中三乙胺残留检测

1)对照品溶液的制备：精密称取三乙胺，用N,N-二甲基甲酰胺定量稀释制成每1ml中含三乙胺1000μg的溶液，取该溶液1.0ml与1.0ml的1mol/L氢氧化钠溶液一并置于20ml顶空瓶中，混匀，密封，作为对照品溶液；

2)供试品溶液的制备：精密称定胸腺法新0.2g，置20ml顶空瓶中，精密加入1mol/L氢氧化钠溶液1.0ml溶解，再精密加入N,N-二甲基甲酰胺1.0ml，混匀，密封，作为供试品溶液；

3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入顶空气相色谱仪，色谱条件如下：色谱柱：HP-5(30m*530μm*3μm)；色谱柱程序升温：起始温度为45℃，维持6分钟，再以每分钟8℃的速率升温至90℃，维持2分钟，再以每分钟20℃的速率升温至200℃，维持5分钟；顶空进样参数：定量环温度：100℃；传输线温度：105℃；顶空加热箱温度：80℃；进样持续时间：1min；样品瓶平衡：30min；GC循环：30min；进样口温度为200℃；分流比：5:1；检测器:FID，检测器温度：250℃；空气流量：300ml/min；氢气燃气流量：40ml/min；载气为氮气，色谱柱流量N2：2ml/min；

4)按外标法以峰面积计算胸腺法新中三乙胺含量。

实施例4、胸腺法新中三乙胺残留检测

1)对照品溶液的制备：精密称取三乙胺，用N,N-二甲基甲酰胺定量稀释制成每1ml中含三乙胺1000μg的溶液，取该溶液1.0ml与1.0ml的1mol/L氢氧化钠溶液一并置于20ml顶空瓶中，混匀，密封，作为对照品溶液；

2)供试品溶液的制备：精密称定胸腺法新0.2g，置20ml顶空瓶中，精密加入1mol/L氢氧化钠溶液1.0ml溶解，再精密加入N,N-二甲基甲酰胺1.0ml，混匀，密封，作为供试品溶液；

3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入顶空气相色谱仪，色谱条件如下：色谱柱：Agilent DB-624(30m*530μm*3μm)；色谱柱程序升温：起始温度为40℃，维持6分钟，再以每分钟8℃的速率升温至90℃，维持2分钟，再以每分钟20℃的速率升温至200℃，维持5分钟；顶空进样参数：定量环温度：100℃；传输线温度：105℃；顶空加热箱温度：80℃，进样持续时间：1min；样品瓶平衡：30min；GC循环：30min；进样口温度为200℃；分流比：20:1；检测器:FID，检测器温度：250℃；空气流量：300ml/min；氢气燃气流量：40ml/min；载气为氮气，色谱柱流量N2：2ml/min；

4)按外标法以峰面积计算胸腺法新中三乙胺含量。

以下通过试验例来说明本发明的有益效果。

试验例1分析方法学验证

1、仪器与试剂

1.1气相色谱仪Agilent Technologies 7890B GC System，包含：

1.2其他仪器设备

1.3试剂与试药

表1分析方法学验证用对照品及试药信息

1.4样品信息

表2样品信息

1.4气相色谱条件

2、三乙胺残留溶剂方法学验证

表3三乙胺残留方法学验证结果

3、专属性与系统适用性试验

分别取乙腈、二氯甲烷、醋酸乙酯、苯、三乙胺、苯甲醚，加N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解作为对应的定位溶液；取DMF作为空白溶剂；取上述各溶剂混合后作为混合定位溶液；精密量取1mol/L氢氧化钠溶液1ml置20ml顶空瓶中，再精密加入上述各溶液1ml，混匀，密封，进样，记录色谱图。试验结果见表4，图谱见图1～图8。

表4专属性试验结果

试验结果表明：三乙胺与其他已知各溶剂的分离度符合要求，表明本方法专属性好(醋酸乙酯在加入氢氧化钠溶液后，发生反应，未检出)。

5、检出限与定量限

精密称取三乙胺适量，置10ml量瓶中，用DMF溶解并稀释至刻度，作为三乙胺储备液，精密量取三乙胺储备液适量，逐级稀释，以信噪比(S/N)约为3时的进样浓度为其检出限(LOD)，以信噪比(S/N)约为10时的进样浓度为其定量限(LOQ)，并平行配制3份定量限浓度溶液，进行检测。

检出限与定量限结果见表5～6，图谱见图9～图10。

表5三乙胺检出限

表6三乙胺定量限

上述试验结果表明，三乙胺的检出能力均低于限度的5％，三乙胺的定量限不高于限度的10％。

6、线性与范围

精密称取三乙胺约1250mg置25ml量瓶中，加DMF溶解并稀释至刻度，作为三乙胺储备液；精密量取三乙胺储备液用DMF逐级稀释，制成系列溶剂的线性溶液。精密量取1mol/L氢氧化钠溶液1ml置20ml顶空瓶中，再精密加入上述各线性溶液1ml置同一顶空瓶中，密封，混匀，顶空进样，记录各浓度下线性溶液的峰面积，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标作线性回归，结果见表7。图谱见图11～图17

表7三乙胺线性

7、准确度

对照品溶液：精密量取1mol/L氢氧化钠溶液1ml与1ml的“6、线性与范围”项下200％浓度的线性溶液，置顶空瓶中，密封，混匀，作为对照品溶液。

供试品加标溶液：取胸腺法新约200mg，精密称定，分别置顶空瓶中，分别精密加入1mol/L氢氧化钠溶液1ml，使样品溶解后，再分别精密加入“6、线性与范围”项下100％、200％、300％线性溶液1ml，密封，混匀，即制得限度浓度50％、100％、150％的供试品加标溶液，每个浓度平行制备3份。

样品溶液：取胸腺法新约200mg，精密称定，置顶空瓶中，分别精密加入1mol/L氢氧化钠溶液1ml，使样品溶解后再精密加入DMF 1ml，密封，混匀。

照拟定的色谱条件进行检测，试验结果见表8，图谱见图18～图20。

表8三乙胺准确度试验

结果表明，三乙胺的加样回收率为93.06％之间，RSD％≤5.0％。

8、精密度

8.1重复性

精密量取1mol/L氢氧化钠溶液1ml与1ml的“6、线性与范围”项下200％浓度的线性溶液，置顶空瓶中，密封，作为对照品溶液。

供试品溶液：参照准确度试验项下100％浓度供试品加标溶液配制方法平行配制6份。照拟定色谱条件进行测定，计算每份样品中三乙胺的回收率含量，结果见表9，图谱见图21～图22。

表9三乙胺重复性试验结果

由上表可知，三乙胺的回收率在98.35％～105.64％之间，RSD为2.73％；说明拟定的检测方法重复性符合要求。

8.2中间精密度

照重复性项下，更换试验人员，用相同方法各制备6份加标供试品溶液，在不同时间，按照拟定的色谱条件进行测定，计算每份样品中各已知溶剂的含量，计算回收率。试验结果见表10，图谱见图23～图25。

表10三乙胺中间精密度试验结果

由上表可知，12份加标供试品溶液中三乙胺的平均回收率为102.00％，RSD为3.13％；说明拟定的检测方法精密度符合要求。

8.3进样精密度

精密量取1mol/L氢氧化钠溶液1ml与1ml的“7、准确度”项下200％浓度的线性溶液，置顶空瓶中，密封，混匀，平行制备6瓶，按照拟定的方法测定，记录色谱图，考察进样精密度，结果见表11，图谱见图26。

表11三乙胺进样精密度试验结果

9、溶液稳定性

参照准确度项下试验方法，配制对照品溶液，在室温下放置不同的时间，按照拟定检测方法进行测定，考察各溶液的稳定性，试验结果见表12，图谱见图27～图29。

表12对照品溶液稳定性考察结果表

试验结果表明：室温条件下，对照品溶液放置24小时，测得三乙胺峰面积的RSD为4.05％，16小时RSD为2.26％，稳定性良好，建议三乙胺溶剂测定应在16小时内完成。

10、耐用性试验

为了考察拟定的色谱条件发生微小变动时，测定结果的准确性不受影响的程度，我们对此方法的耐用性进行了考察。分别改变起始柱温箱温度、分流比、色谱柱等因素，具体的色谱条件见表13。以结果的变化情况为衡量指标，考察拟定方法的耐用性，试验结果见表13，图谱见图30～36。

表13耐用性试验色谱条件及结果

结果表明，当起始柱温变化5℃、分流比变化或者更换不同的色谱柱时，各已知溶剂间、已知溶剂与未知杂质间分离度良好，均能达到测定要求，说明拟定的方法耐用性良好。

11、样品测定

取胸腺法新按照拟定的检测方法测定，试验结果见表14，图谱见图37～图38。

表14胸腺法新中三乙胺检测结果

12、最终确定的检测方法

残留溶剂照残留溶剂测定法(通则0861)测定

色谱条件与系统适用性试验以6％氰丙基苯-94％二甲基聚硅氧烷为固定液(或极性相近)的毛细管柱为色谱柱，起始温度为40℃，维持6分钟，再以每分钟8℃的速率升温至90℃，维持2分钟，再以每分钟20℃的速率升温至200℃，维持5分钟；进样口温度为200℃，检测器温度为250℃，顶空瓶平衡温度为80℃，平衡时间为30分钟。取系统适用性溶液顶空进样，各峰之间的分离度均应符合要求。

系统适用性溶液的制备分别取乙腈、二氯甲烷、醋酸乙酯、苯和苯甲醚各适量，用N,N-二甲基甲酰胺定量稀释制成每1ml中含乙腈82μg、二氯甲烷120μg、醋酸乙酯1000μg、苯0.4μg、三乙胺1000μg和苯甲醚1000μg的混合溶液，精密量取1mol/L氢氧化钠溶液1.0ml与此混合溶液1.0ml，置20ml顶空瓶中，混匀，密封，作为系统适用性溶液。

供试品溶液的制备取本品约0.2g，精密称定，置20ml顶空瓶中，精密加入1mol/L氢氧化钠溶液1.0ml使供试品溶解后，再精密加入N,N-二甲基甲酰胺1.0ml，混匀，密封，作为供试品溶液。

对照品溶液的制备精密称取三乙胺适量，用N,N-二甲基甲酰胺定量稀释制成每1ml中含三乙胺1000μg的溶液，精密量取1mol/L氢氧化钠溶液1.0ml与此溶液1.0ml，置20ml顶空瓶中，混匀，密封，作为对照品溶液。

测定法取对照品溶液和供试品溶液照上述方法顶空进样，记录色谱图，供试品溶液色谱图中如有与三乙胺保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，三乙胺不得过0.5％。

综上，本发明胸通过特定的顶空进样参数和气相色谱条件，能准确测定胸腺法新中三乙胺，且灵敏度和精确度高，检测限低，具备实际推广应用价值。