一种基于有关物质鉴别合成姜黄素的方法

技术领域

本发明涉及一种姜黄素鉴别方法，尤其涉及一种基于有关物质鉴别合成姜黄素的方法。

背景技术

姜黄素类化合物也称总姜黄素，化学结构上因携带甲氧基个数不同分为三种化合物，包括姜黄素、脱甲氧基姜黄素、双脱甲氧基姜黄素，其含量之和称为总姜黄素含量。姜黄素作为一种天然植物多酚类物质，具有抗氧化、抗炎等多种活性，在医学界具有广泛的开发应用前景，有许多含姜黄素的保健品在售卖，同时，姜黄素已被批准用做禽类、鱼类饲料添加剂，2014年，农业农村部批准将姜黄素在淡水鱼类饲料中的添加，在淡水鱼类饲料中的推荐添加量为200mg/kg-400mg/kg，最高限量为600mg/kg(以干物质含量为88％的配合饲料为基础，以姜黄素总量计)。2019年，农业农村部决定将姜黄素的适用范围扩大至肉仔鸡，在肉仔鸡配合饲料中的推荐添加量为50mg/kg-150mg/kg，最高限量为150mg/kg(以干物质含量为88％的配合饲料为基础)。

由于从植物中提取天然姜黄素的成本较高，人们转而寻找合成姜黄素的途径。目前，以1964年Padon研制的方法最为便利，成本也低，是目前合成姜黄素最广泛的方法，该方法将合成姜黄素的成本压缩至提取姜黄素的1/3-1/2，是目前成本最低的合成方法。该合成方法以乙酰丙酮与香草醛作为原材料，在硼作催化剂，正丁胺作碱的条件下合成姜黄素，该反应的原理是氧化硼与乙酰丙酮的醇式构型进行反应得到相应的硼酸酯，硼的空轨道与β位羰基氧的孤对电子间形成配位键进而形成稳定的六元环，再在正丁胺的作用下，以硼酸三丁酯作为除水剂的条件下，与两分子香草醛缩合得到姜黄素硼络合物，最后水解得到姜黄素粗品，在水/乙腈中重结晶得到姜黄素。在该过程中，会产生少量乙酰丙酮只与一分子香草醛缩合反应得到的副产物(命名为：有关物质M)，本发明通过优化乙酰丙酮与香草醛的比例和反应时间即可改变反应的主要产物，再经过纯化后获得高纯度有关物质M，并经过质谱和核磁确证其化学结构。

具体反应如下：

但是合成姜黄素未经过完整的安全性和有效性评价，并未被批准使用。一些商家违规用合成姜黄素替代天然姜黄素以获取更大的利益，因此，有必要建立一种方法来鉴别天然和合成的姜黄素。

现有的检测技术中，有高效液相和气相色谱方法根据天然姜黄素中的其他微量成分来鉴别天然姜黄素与合成姜黄素，但这些方法均需要从姜黄中提取出高纯度的微量成分进行对照，如韩海涛等人就建立了一种检测芳姜黄酮的高效液相-串联气相的方法，该方法根据检测到的芳姜黄酮与姜黄素的含量比来鉴别姜黄素，但提取这些微量成分的成本较大，准确度和灵敏度低，且无法鉴别是否掺杂合成姜黄素。

C是有机物的骨架，在自然接种天然产生的产物中的C为14C，而来源于石化产品的物质中的C由于衰变，14C的含量下降，其放射性也与天然产物不同，因此可以通过检测14C来确定检测物是否为天然产品。但14C检测技术成本高，虽然其能够准确给出所检测样品是否为生物来源，但是检测涉及到放射性，而且费用昂贵，也无法确定样品中是否掺杂化学合成姜黄素。在合成过程中需要用到催化剂硼，虽然后续存在纯化过程，但依旧会有少量硼的残留。因此也有通过电感耦合等离子体质谱仪检测样品中是否含有硼元素，来鉴别所测姜黄素是否为合成姜黄素，但硼元素的检测方法灵敏度较低，且由于硼既普遍存在与自然界又广泛应用于化工产业，水、玻璃等物质中均含有硼，因此硼元素的检测极易受到干扰，消解过程复杂。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种基于副产物鉴别合成姜黄素的方法。

本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种基于有关物质鉴别合成姜黄素的方法，所述有关物质为乙酰丙酮与香草醛反应合成姜黄素的过程中的有关物质M，其结构式为：

有关物质M的合成方法为以乙酰丙酮与香兰素为原料，氧化硼做催化剂，正丁胺提供碱性条件，N,N二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，通过控制原料的摩尔比为1:1合成有关物质M，并经过反复重结晶得到有关物质M对照品，对其采用质谱、核磁、红外和紫外进行结构确证并进行质量研究。

所述方法首先以乙腈为溶剂，配制不同浓度的有关物质M系列溶液，采用液相色谱-串联质谱测定有关物质M，获得多反应监测色谱图，以测得的峰面积为纵坐标，以有关物质M浓度为横坐标，绘制标准曲线，以所得多反应监测色谱图与标准曲线作为参照标准；其次，根据不同的姜黄素实样采用不同的前处理方法制得待测样品，采用高效液相色谱-串联质谱法对待测样品进行检测，将检测结果与参照标准对比，根据有关物质M的保留时间及定性/定量离子的丰度比进行定性，根据标准曲线计算待测样品中有关物质M的含量；

高效液相色谱-串联质谱检测所采用的方法参数为：

色谱柱：Hypersil GOLD，5μm，150mm*2.1mm；

柱温：30℃；

流动相：A：0.1％乙酸水，B：乙腈；

洗脱方式：等度，A:B＝40:60，5min；

流速：0.3mL/min；

进样量：5μL；

离子源：电喷雾离子源；

扫描方式：正离子模式；

检测方式：多反应监测。

质谱离子对信息见表1：

表1质谱参数

本发明适用于鉴别以香草醛为原料合成的姜黄素，因为其在合成过程中必不可少的会产生有关物质M，利用液质联用检测，优化质谱参数确定的最优离子对，建立多离子反应监测(MRM)模式，比较分析待测产物、有关物质M的特定离子对图谱就能检测出待测产物是否为合成姜黄素。

进一步地，前处理步骤中，当待测样品为姜黄素时，称取一定量供试品姜黄素样品，置于容量瓶中，先溶解于少量乙腈中，溶解完成后定容得到终浓度为1mg/mL的供试品溶液，检测时用流动相稀释，经滤膜过滤后得待测液。

进一步地，前处理步骤中，当检测样品为含姜黄素的保健品时，处理方法为称取一定量供试样品，加入乙腈定容，使姜黄素含量约为1mg/mL，超声提取，过滤，取续滤液得待测液。

进一步地，前处理步骤中，当检测样品为添加姜黄素的饲料时，处理方法为称取一定量供试样品，加入甲醇水溶液定容，超声提取，过滤，得提取液。另取HLB小柱，依次用甲醇、水活化后，将上述提取液加样于小柱，用5％甲醇水淋洗，淋洗完成后抽干，之后用2％氨化甲醇洗脱并收集，氮气吹干，最后用甲醇溶解，过滤膜得待测液。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明通过检测合成姜黄素中常见的有关物质M来建立检测手段，只需检测样品中是否含有该物质即可断定检测样品是否为合成姜黄素。

2、本发明的检测方法成本低，方便快捷，LC-MS只需要5min，大大缩短检测所需的时间。

3、本发明的检测方法灵敏度高，对于姜黄素原料检测限＜1μg/kg，对于姜黄素保健品和饲料检测限＜5μg/kg。

4、本发明检测方法适用范围广，可用于检测姜黄素、以姜黄素为主成分的保健品、饲料添加剂姜黄素等。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明合成有关物质M的核磁共振氢谱检测图；

图2为本发明合成有关物质M的核磁共振碳谱检测图；

图3为本发明实施例中有关物质M溶液的多反应监测色谱图；

图4为本发明实施例中天然姜黄素供试样品中有关物质M的多反应监测色谱图；

图5为本发明实施例中合成姜黄素供试样品中有关物质M的多反应监测色谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1有关物质M的合成与结构确证

有关物质M的合成：将圆底烧瓶置于水浴锅中，在烧瓶中依次加入氧化硼3.5g、乙酰乙酸乙酯25mL、乙酰丙酮5g，开启搅拌，加热，升温至80℃后保温搅拌2h，加入硼酸三丁酯11g、正丁胺0.3mL、滴加香草醛7.5g，反应过程中会有少量姜黄素生成，薄层层析监控反应进程，展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝3：1。

(1)待反应结束后，将反应液冷却至室温，抽滤，收集滤液。

(2)将滤液逐滴滴加至不断搅拌的200mL冰水中，可见固体析出，待析出完全后，抽滤，收集滤液。

(3)将第二步收集的滤液用乙酸乙酯萃取两次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩。

(4)浓缩后的产物使用乙酸乙酯进行重结晶，可得精制的有关物质M，淡黄色结晶性粉末。

有关物质M的结构确证：取有关物质M约5mg溶解于d6-DMSO中，将溶液装入核磁管中，以四甲基硅烷(TMS)为内标，在400MHz Varian NMR spectrometer(Palo Alto,CA,USA)上记录1H和13C-NMR波谱。所得核磁共振氢谱与碳谱如图1、图2所示，数据与报道一致。

实施例2标准曲线及检测限

称取一定量供试样品，加入甲醇水溶液定容，超声提取，过滤，得提取液。另取HLB小柱，依次用甲醇、水活化后，将上述提取液加样于小柱，用5％甲醇水淋洗，淋洗完成后抽干，之后用2％氨化甲醇洗脱并收集，氮气吹干，最后用甲醇溶解，过滤膜得待测液，配制3个水平的基质匹配有关物质M溶液，用液相色谱串联质谱检测对所得溶液进行检测；

具体的方法参数为：

色谱柱：Hypersil GOLD，5μm，150mm*2.1mm；

柱温：30℃；

流动相：A：0.1％乙酸水，B：乙腈

洗脱方式：等度，A:B＝40:60，5min

流速：0.3mL/min；

进样量：5μL；

离子源：电喷雾离子源；

扫描方式：正离子模式；

检测方式：多反应监测；

质谱离子对信息见表1；

其中，流动相需超声处理20min，乙腈为质谱级，0.1％乙酸水的配制过程为：量取500mL超纯水，移取500μL分析纯乙酸于容量瓶中。

以有关物质M的定量离子的峰面积(y)为纵坐标、质量浓度(x，μg/L)为横坐标绘制曲线，得到线性方程y＝1.0152x-0.0724，其相关系数为R＝0.997，线性关系良好；根据信噪比(S/N)得到有关物质M的在姜黄素原料中检出限(LOD)为0.13μg/kg，定量限(LQO)为1μg/kg，在姜黄素保健品和饲料中检出限(LOD)为1.64μg/kg，定量限(LQO)为5μg/kg。

实施例3回收率

按实施例2方法，在空白饲料中添加有关物质M溶液，加标量分别为5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg的加标样品，按前处理方法及测定条件进行回收率实验，每个添加水平做3次平行测定。根据结果计算其RSD，结果如表2所示。

表2回收率考核结果

实施例4

从市面上随机选取5个不同来源的姜黄素原料，按下列步骤操作：

称取一定量供试品姜黄素样品，置于容量瓶中，先溶解于少量乙腈中，溶解完成后定容得到终浓度为1mg/mL的供试品溶液，检测时用流动相稀释，经滤膜过滤后得待测液。检测分析方式同实施例2，测定结果见表3。

表3供试品中姜黄素和有关物质M的测定结果

实施例5

从市面上选取5个不同来源的姜黄素保健品，按下列步骤操作：

称取一定量供试样品，加入乙腈定容，使姜黄素含量约为1mg/mL，超声提取，过滤，取续滤液得待测液。检测分析方式同实施例2，测定结果见表4。

表4供试品中姜黄素和有关物质M的测定结果

参见表4，本实施例中，测试保健品均为天然姜黄素。

实施例6

从市面上从市面上选取不同来源的添加姜黄素的饲料，其中鱼饲料5份，鸡饲料5份，按下列步骤操作：

样品处理：一定量供试样品，加入甲醇水溶液定容，超声提取，过滤，得提取液。另取HLB小柱，依次用甲醇、水活化后，将上述提取液加样于小柱，用5％甲醇水淋洗，淋洗完成后抽干，之后用2％氨化甲醇洗脱并收集，氮气吹干，最后用甲醇溶解，过滤膜得待测液。

利用液相色谱串联质谱检测待测液，具体操作如实施例2；将供试品的离子流图与对照品的离子流图进行比对，并根据供试品峰面积和对照品峰面积计算供试品中姜黄素与有关物质M的含量，测定结果见表5。

表5供试品中姜黄素和有关物质M的测定结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。