一种分选、检测循环肿瘤细胞的试剂盒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种分选、检测循环肿瘤细胞的试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术

癌症是导致全球死亡的主要原因之一。研究发现，在癌症转移过程中，癌细胞通过血液、淋巴等循环系统从肿瘤原发部位扩散到其他组织和器官，然后在其他组织和器官中生长繁殖形成新的转移灶。这种来源于原发肿瘤或转移肿瘤脱离基底膜并通过组织基质进入血管或淋巴的肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞(CTC)。组织活检是目前癌症诊断的金标准，但由于组织活检是一种侵入性检查，对患者有一定的损伤，导致患者的顺应性较低。且对于已经有转移灶的癌症患者，难以进行多次组织活检以获得空间和时间样本。物理检测、磁共振成像、正电子发射层析扫描、X射线、超声等影像检查方法的检测范围十分有限，只有当肿瘤转移至身体其他部位形成较大的新转移灶时才能够被检测出来。液体活检是一种快速兴起的诊断技术。体液中的细胞、蛋白质、核酸等靶点可在疾病的早期阶段就出现变化，便于我们进行早期诊断并进行早期治疗。与组织活检相比，这种诊断方式更加灵活简便，易于患者接受，能够在治疗过程中或治疗后进行重复检测，具有个体化诊断与治疗的优势。

基于CTC的液体活检方式在近些年也得到了广泛的重视，通过对CTC数量的动态考察，不仅可以有效辅助癌症早期诊断，而且有利于预后评估。细胞结构完整的CTC不仅能够提供实体瘤的蛋白质表达异常、基因组突变、mRNA变异等信息，还能从细胞形态、迁移能力等方面对肿瘤的转移及耐药机制进行研究。然而，CTC在外周血中含量极低，且容易发生上皮-间质转换，导致其具有很高的异质性，这给CTC的临床应用带来了巨大挑战。针对上述问题，发展一些高性能的CTC富集方法至关重要。其中，基于CTC与其他细胞在物理特性方面的差异(如密度、尺寸、电泳登)的物理富集技术以及利用识别配体(如抗体、适配体)与CTC膜上的生物标志物之间特异性相互作用的免疫亲和技术是最为常用的富集方法。物理富集方法虽然简单简单经济，但分选纯度和通量较低。免疫亲和技术是利用抗体、适配体等识别配体与CTC表面抗原靶向结合，利用磁场或其它作用力实现CTC分离的技术，具有高特异性。其中上皮细胞粘附分子(EpCAM)抗体或适配体是最常用的识别配体。然而，由于血液中的CTC容易发生上皮细胞间质转变，而且不是每种肿瘤细胞都表达上皮标志物，因而用单一抗原富集CTC容易造成假阴性结果。

在种类繁多的生物材料中，水凝胶是一类具有三维网络结构的聚合物，具有较高的亲水性、生物安全性和易于基团修饰的特性，并且可表现出与不同生物组织或细胞相类似的机械性能，其光学透明度允许对分选后的CTC进行染色，标记和显微镜下的活细胞观察，因此非常适合作为细胞分选的界面。金纳米颗粒是一种由金原子组成的纳米尺度的颗粒，它们具有独特的光学性质，能够在可见光区域产生强烈的表面等离激元共振吸收。而这种吸收与金纳米颗粒的形状、大小、组成和分散状态密切相关，从而引起金纳米颗粒的颜色变化。例如巯基化合物易与金粒子之间形成Au-S共价键，使分散的粒子发生聚集。通过肉眼观察颜色变化或者检测吸光度大小，就可以实现对目标物的含量测定。这种基于金纳米颗粒的比色分析技术具有简单、快速、灵敏、直观和成本低等优点，因而被广泛应用于生物医学、环境监测和化学分析等领域。

为了实现CTC高效率分选、高灵敏检测以及分选和检测一体化的快速分析，本发明首先利用MeHA水凝胶分选CTC，然后进一步利用纳米金溶胶的显色特性对分选后的CTC进行快速定量分析，开发了一种分选、检测循环肿瘤细胞的试剂盒及其制备方法和应用。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种分选、检测循环肿瘤细胞的试剂盒及其制备方法和应用，通过分选探针捕获和分选出循环肿瘤细胞，识别探针识别出分选的循环肿瘤细胞，辅助试剂将识别到的循环肿瘤细胞进行吸光度检测，用于肿瘤患者的早期筛查。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

本发明的第一目的，提供一种分选、检测循环肿瘤细胞的试剂盒，包括分选探针、检测探针、辅助试剂；

所述分选探针包括经过氨基化EpCAM核酸适配体、氨基化CSV核酸适配体修饰的甲基丙烯酸透明质酸水凝胶；

所述检测探针，为在内部空腔包载半胱氨酸的介孔二氧化硅、并且在介孔二氧化硅的表面修饰有羧基化发夹型EpCAM核酸适配体、羧基化发夹型CSV核酸适配体；

所述辅助试剂，为纳米金溶胶；

所述分选探针用于捕获和分选出循环肿瘤细胞；所述识别探针用于识别出分选的循环肿瘤细胞；所述辅助试剂用于将识别到的循环肿瘤细胞进行检测。

进一步的，所述分选探针中，所述甲基丙烯酸透明质酸水凝胶上修饰的EpCAM适配体和CSV适配体的质量摩尔数分别为0.038nmol/g、0.06nmol/g。

进一步的，所选循环肿瘤细胞是对EpCAM和CSV适配体均具有特异性亲和力的细胞，优选为人肺癌细胞A549，人乳腺癌细胞MCF-7，人结肠癌细胞SW480、人肝癌细胞HepG2。

进一步的，所述介孔二氧化硅上修饰的羧基化发夹型EpCAM核酸适配体和羧基化发夹型CSV核酸适配体质量摩尔数分别为0.035nmol/mg、0.047nmol/mg。

进一步的，氨基化的直链EpCAM核酸适配体(SEQ ID NO.1)：

5'-NH2-CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-3’；

氨基化的直链CSV核酸适配体(SEQ ID NO.2)：

5'-NH2-CACGCATAGCCTTTGCTCCTCGTCTGGAACGTCGCAGCTTTAGTTCTGGGCCTATGCGTG-3’；

羧基化发夹型EpCAM核酸适配体(SEQ ID NO.3)：

5'-COOH-TAGACAGGGTGAAAAAAAAAAGTCCGGTTGGGGGGTACTGTTGCACCCTGTCTGCGTTGGAGACATCAC-3'；

羧基化发夹型CSV核酸适配体(SEQ ID NO.4)：

5'-COOH-TTTTTTTTTTCACGCATAGGCCCACGCATAGCCTTTGCTCCTCGTCTGGAACGTCGCAGCTTTAGTTCTGGGCCTATGCGTG-3’；

进一步的，所述纳米金溶胶中粒子的平均粒径约为13.2nm

本发明的第二目的，提供上述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)CTC分选探针的制备

将甲基丙烯酸透明质酸水凝胶和光引发剂进行照射，得到交联后的MeHA水凝胶；

活化交联后的MeHA水凝胶，加入氨基化EpCAM核酸适配体、氨基化CSV核酸适配体的混合溶液，进行孵育，制备得到CTC分选探针；

(2)检测探针的制备

将氨基化介孔二氧化硅进行分散，然后加入半胱氨酸，进行反应，经过离心洗涤，制备得到包载半胱氨酸的介孔二氧化硅；

活化羧基化发夹型EpCAM核酸适配体、羧基化发夹型CSV核酸适配体，然后加入包载半胱氨酸的介孔二氧化硅，进行孵育，得到检测探针；

(3)辅助试剂的制备

将HAuCl4溶液加热至沸腾后，加入柠檬酸钠溶液，混合后冷却至室温，得到纳米金溶胶。

进一步的，所述CTC分选探针的制备，包括以下步骤：

a)交联后的MeHA水凝胶的制备

将50mg/mL MeHA水凝胶和0.5mg/mL光引发剂共同照射，得到交联后的MeHA水凝胶；

b)CTC分选探针的制备

使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的PBS混合溶液，进行羧基活化交联后的MeHA水凝胶；再与氨基化EpCAM核酸适配体、氨基化CSV核酸适配体的混合溶液，室温下孵育，制备得到CTC分选探针。

进一步的，所述检测探针的制备，包括以下步骤：

a)氨基化的介孔二氧化硅的制备

将氨水与去离子水混合均匀，加入CTAB和TEOS进行搅拌，经过离心、洗涤后，加入盐酸和甲醇进行回流反应，待反应结束后，萃取去除表面活性剂模板，再次离心、洗涤、干燥，得到介孔二氧化硅；加入APTES进行回流反应，制备得到氨基化的介孔二氧化硅；

b)包载半胱氨酸的介孔二氧化硅的制备将氨基化的介孔二氧化硅进行分散，然后加入半胱氨，进行搅拌反应，经过离心洗涤，制备得到包载半胱氨酸的介孔二氧化硅；

c)检测探针的制备

利用TECP羧基化发夹型EpCAM核酸适配体、羧基化发夹型CSV核酸适配体分别活化，然后加入包载半胱氨酸的介孔二氧化硅，室温下孵育，经过洗涤和离心后，得到复合二氧化硅检测探针。

本发明的第三目的，提供上述所述试剂盒的应用，将试剂盒，应用到泛癌种的早期筛查。

进一步的，所述泛癌种包括肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌。

本发明的有益效果是：

1.本申请提供的试剂盒，所述分选探针和检测探针上均连接有EpCAM适配体和CSV适配体，双重保证了不表达或低表达EpCAM或CSV的CTC能够被分选和检测出来，避免了EpCAM表达阴性细胞的“漏捕”和“漏检”。因而相对于单一适配体修饰的探针而言，这两种探针对异质型循环肿瘤细胞具有显著升高的分选效率和检测灵敏度，对CTC的分选效率达到91％，最低可检测出3个CTC/mL；

2.本申请提供的试剂盒，检测探针，采用了类似夹心结构的检测原理：即CTC在中间，两端均有识别CTC的特异性适配体，这种检测方式保证了结果的准确度，排除了其他非CTC细胞对检测信号的干扰；

3.本申请提供的试剂盒，选择EpCAM适配体和PTK7适配体共同作为识别CTC的标志物。由于这两种标志物在多种类型CTC上均有高表达，可以用于肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌中CTC的分选和检测，因而本试剂盒适用于泛癌种的早期筛查。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是MeHA水凝胶的SEM图；

图2是纳米金溶胶的TEM图；

图3是MeHA水凝胶探针与A549、SW480、HepG2、MCF-7细胞和THP-1对照细胞孵育后的富集效率的比较结果示意图(细胞个数均为300个/mL)；

图4是富集A549细胞后的MeHA水凝胶的SEM图；

图5是单适配体与双适配体修饰的MeHA水凝胶探针与A549细胞孵育后的富集效率的比较结果示意图(细胞个数均为300个/mL)。

图6是不同数量的(3～800个/mL)A549在MeHA水凝胶探针上的富集效率结果示意图；

图7是MeHA水凝胶探针在1～8周内与200个A549细胞孵育后富集效率的比较结果示意图；

图8是纳米金溶胶与不同浓度的半胱氨酸(0.1，0.3，0.5，0.8，1.0和1.2μM)反应15分钟后的吸收图谱以及相应的颜色变化图；

图9是不同数量(5～500个/mL)A549细胞在MeHA水凝胶探针上被富集，然后加入检测探针后所引起的金溶胶520nm处吸光度的变化(A)以及线性回归曲线(B)示意图；

图10是单适配体与双适配体修饰的检测探针对200个A549细胞检测结果的比较结果示意图；

图11是检测探针对200个MCF-7、SW480、A549、HepG2细胞和THP-1对照细胞的检测结果的比较结果示意图；

图12是分选探针与A549孵育孵育不同时间以及不同浓度的检测探针与A549孵育后，细胞活力的变化示意图；

图13是收集的肿瘤患者的1.5ml血液中检测到的CTC个数示意图(比例尺：20μm)。

具体实施方式

为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。

如本文所使用的，“和/或”包括任何和一个或多个关联列出项的所有组合的术语。这里使用的术语仅用于描述具体实施例的，而不是意在限制本发明。如本文所使用的，单数形式“一”，“一个”，“一种”和“该”也意图包括复数形式，除非上下文另外明确指出。进一步理解，“包括”在本说明书中使用时，指定所陈述的特征，整数，步骤，操作，元素和/或组成，但不排除存在或附加一个或多个其它特征，整数，步骤，操作，元件，组成和/或它们的组合。

除非另有定义，本文使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有本发明所属的技术领域中普通技术人员普遍理解的相同的含义。进一步理解，术语，诸如在常用词典中定义，解释与它们在相关领域的环境下的含义一致，并且不是理想化或过于正式的意义，除非这里明确地如此定义。

在此描述的示例性发明可以适当地缺少任何一种或多种要素限制，这里没有特别公开。因此，“包含”，“包括”，“含有”等的术语应被宽泛和非限制性地理解。另外，本文所使用的术语表达被用作描述，没有限制，并且在使用这些不包括任何等价特性的术语表达是无意的，只是描述它们的一部分特性，但是根据权利，在本发明的范围内各种修改是可能。因此，虽然本发明已通过优选实施例和任选特征被具体公开，在此公开的修改以体现的本发明的变化可能会被本领域的技术人员记录，并且这样的修改和变化会被认为在本发明的范围之内。

本发明实施例与对比例中使用的原料或试剂均购自市场主流厂家，未注明生产厂商者或者未注明浓度者，均为可以常规获取的分析纯级的原料或试剂，只要能起到预期的作用，并无特别限制。本实施例中使用的磁力搅拌器等仪器设备均购自市场主要厂家，只要能起到预期的作用，并无特别限定。本实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

本申请为了实现对CTC高效率分选、高灵敏检测以及分选和检测一体化的快速分析，利用MeHA水凝胶天然的适合细胞粘附、高生物相容性、多孔的特性，同时利用对上皮表达和间质表达细胞具有高特异性的适配体，结合CTC触发引起的半胱氨酸从二氧化硅体系中的释放，引起纳米金溶胶的聚集，导致其光学性能发生改变，对分选到水凝胶上的CTC的数量进行颜色观察和吸光度的检测，从而完成对CTC的捕获、分选、识别、检测的过程，提供一种分选、检测循环肿瘤细胞的试剂盒及其制备方法和应用。

一种分选、检测循环肿瘤细胞的试剂盒包括分选探针、检测探针、辅助试剂；

所述分选探针包括经过氨基化EpCAM核酸适配体、氨基化CSV核酸适配体修饰的甲基丙烯酸透明质酸水凝胶；

所述检测探针，为在内部空腔包载半胱氨酸的介孔二氧化硅、并且在介孔二氧化硅的表面修饰有羧基化发夹型EpCAM核酸适配体、羧基化发夹型CSV核酸适配体；

所述辅助试剂，为纳米金溶胶；

所述分选探针用于捕获和分选出循环肿瘤细胞；所述识别探针用于识别出分选的循环肿瘤细胞；分选探针具体为氨基化EpCAM核酸适配体和氨基化CSV核酸适配体修饰的甲基丙烯酸透明质酸水凝胶(MeHA)，氨基化EpCAM核酸适配体、氨基化CSV核酸适配体是通过MeHA上的负电荷和两种适配体所带正电荷相连接；

检测探针，为复合二氧化硅检测探针，用于识别分选探针所分选出来的CTC；复合二氧化硅检测探针是通过在介孔二氧化硅内部空腔包载半胱氨酸，并且表面修饰发夹型EpCAM和CSV核酸适配体所制得；

所述辅助试剂用于将识别到的循环肿瘤细胞进行检测。纳米金溶胶，用于检测CTC触发引起的半胱氨酸从介孔二氧化硅中的释放，导致金溶胶的团聚以及吸光度的变化，进而辅助检测CTC。

具体的，所选循环肿瘤细胞是对EpCAM和CSV适配体均具有特异性亲和力的细胞，优选为人肺癌细胞A549，人乳腺癌细胞MCF-7，人结肠癌细胞SW480、人肝癌细胞HepG2。

上述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)CTC分选探针的制备

a)交联后的MeHA水凝胶的制备

将50mg/mL MeHA水凝胶和0.5mg/mL光引发剂(Irgacure 2959)共同照射，得到交联后的MeHA水凝胶；

b)CTC分选探针的制备

使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的PBS混合溶液，进行羧基活化交联后的MeHA水凝胶；再与氨基化EpCAM核酸适配体、氨基化CSV核酸适配体的混合溶液，室温下孵育，制备得到CTC分选探针。

(2)检测探针的制备

a)氨基化的介孔二氧化硅的制备

将氨水与去离子水混合均匀，加入CTAB和TEOS进行搅拌，经过离心、洗涤后，加入盐酸和甲醇进行回流反应，待反应结束后，萃取去除表面活性剂模板，再次离心、洗涤、干燥，得到介孔二氧化硅；加入APTES进行回流反应，制备得到氨基化的介孔二氧化硅；

b)包载半胱氨酸的介孔二氧化硅的制备将氨基化的介孔二氧化硅进行分散，然后加入半胱氨，进行搅拌反应，经过离心洗涤，制备得到包载半胱氨酸的介孔二氧化硅；

c)检测探针的制备

(3)辅助试剂的制备

利用TECP羧基化发夹型EpCAM核酸适配体、羧基化发夹型CSV核酸适配体分别活化，然后加入包载半胱氨酸的介孔二氧化硅，室温下孵育，经过洗涤和离心后，得到复合二氧化硅检测探针。

具体的，所述试剂盒的制备方法，步骤以下步骤：

(1)分选探针的制备

a.甲基丙烯酸透明质酸水凝胶(MeHA)的制备：

在4℃下将1.0g HA溶解于50ml去离子水中。剧烈搅拌下，继续加入33mL DMF，然后将1.22g MA滴加到混合溶液中反应4小时，用1M NaOH将溶液pH调节至8～9，保持在4℃过夜反应。随后，在乙醇沉淀之前将NaCl溶解在溶液中。收集沉淀的MeHA并用乙醇洗涤。最后，将MeHA溶于去离子水中，并透析7天来纯化，冷冻干燥收集纯化后的产物。将50mg/mL MeHA和0.5mg/mL光引发剂(Irgacure 2959)共同照射，得到交联后的MeHA水凝胶。

b.CTC分选探针的制备

在上述水凝胶中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的PBS混合溶液，用以进行羧基的活化，然后进一步与氨基化EpCAM适配体和CSV适配体的混合溶液，室温下孵育2.5小时，制备CTC分选探针；MeHA水凝胶上修饰的EpCAM适配体和CSV适配体的质量摩尔数分别优选为0.038nmol/g、0.06nmol/g。

(2)检测探针的制备

a.介孔二氧化硅的合成

将氨水与去离子水混合均匀，在45℃下，加入CTAB和TEOS进行搅拌，经过离心、洗涤后，加入盐酸和甲醇进行回流反应，待反应结束后，萃取去除表面活性剂模板，再次离心、洗涤、干燥，得到介孔二氧化硅。然后加入APTES进行回流反应，制备氨基化的介孔二氧化硅；

b.介孔二氧化硅中包载半胱氨酸

将所得的氨基化介孔二氧化硅分散至去离子水中，然后加入半胱氨酸的水溶液，进行搅拌反应，经过离心洗涤，制备包载半胱氨酸的介孔二氧化硅；

c.检测探针的制备

利用TECP将羧基化的EpCAM适配体和CSV适配体分别活化，然后加入步骤b中的探针，室温下孵育2小时，经过充分的洗涤和离心后，得到复合二氧化硅检测探针；复合二氧化硅检测探针上修饰的羧基化发夹型EpCAM核酸适配体和羧基化发夹型CSV核酸适配体质量摩尔数分别为0.035nmol/mg、0.047nmol/mg。

(3)纳米金溶胶的制备

将50mL的0.01％ HAuCl4溶液加热至沸腾后，在剧烈搅拌下快速加入5mL 1％的柠檬酸钠溶液，将溶液煮沸30分钟，然后缓慢冷却至室温，得到纳米金溶胶；

上述所述试剂盒的应用，应用到泛癌种的早期筛查。所述泛癌种包括肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌。

应用步骤包括：a.根据48孔板中每孔大小，将步骤3中制备的分选探针(CTC分选水凝胶)切割成独立的小片，放置在孔板中；

b.然后将含有一定数量CTC(3～800个/mL)的PBS溶液或模拟血液滴加到水凝胶表面，进行CTC的识别和捕获；

c.接着向捕获有CTC的水凝胶探针表面继续滴加复合二氧化硅检测探针(检测探针)，继续反应。在此过程中，检测探针表面的发夹型EpCAM适配体和发夹型CSV适配体会特异性识别水凝胶上的CTC，导致发夹打开，半胱氨酸被释放出来；

d.然后加入纳米金溶胶与释放出来的半胱氨酸反应，观察溶胶颜色变化，同时将反应后的溶液置于紫外-可见分光光度计上检测吸光度，并带入建立的标准曲线中，计算出溶液中含有的CTC数量，表征此试剂盒的应用价值；

标准曲线的建立：

在使用时，将不同浓度的半胱氨酸水溶液加入到纳米金溶胶中反应，然后置于紫外-可见分光光度计上，检测每一份溶液在520nm处的吸光度，根据该处吸光度的变化，绘制半胱氨酸浓度与金溶胶吸光度之间的标准工作曲线。

具体的，复合二氧化硅检测探针、纳米金溶胶以体积比为1：0.5～1：1与含有不同数目的循环肿瘤细胞溶液或者模拟血液混合；分选探针，富集细胞时，是把分选探针(水凝胶)剪成跟48孔板内孔直径相同大小的圆形，将分选探针放入，然后再加入细胞溶液。每次加进去的细胞溶液是300μL。

下述通过具体实验过程对本发明作进一步的说明。

1.试剂

本发明中涉及的氨基化的直链EpCAM和氨基化的CSV核酸适配体、以及羧基化发夹型EpCAM和羧基化发夹型CSV核酸适配体的序列如下：

氨基化的直链EpCAM核酸适配体(SEQ ID NO.1)：

5'-NH2-CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-3’；

氨基化的直链CSV核酸适配体(SEQ ID NO.2)：

5'-NH2-CACGCATAGCCTTTGCTCCTCGTCTGGAACGTCGCAGCTTTAGTTCTGGGCCTATGCGTG-3’；

羧基化发夹型EpCAM核酸适配体(SEQ ID NO.3)：

5'-COOH-TAGACAGGGTGAAAAAAAAAAGTCCGGTTGGGGGGTACTGTTGCACCCTGTCTGCGTTGGAGACATCAC-3'；

羧基化发夹型CSV核酸适配体(SEQ ID NO.4)：

5'-COOH-TTTTTTTTTTCACGCATAGGCCCACGCATAGCCTTTGCTCCTCGTCTGGAACGTCGCAGCTTTAGTTCTGGGCCTATGCGTG-3’；

2.实验方法

2.1双适配体修饰MeHA水凝胶的制备

在4℃下将1.0g HA溶解于50ml去离子水中直至完全溶解。在剧烈搅拌下将33mLDMF加入HA溶液中，以获得水/DMF混合物(3：2，v/v)。然后将1.22g MAA滴加到混合溶液中4小时，同时用1MNaOH溶液将pH始终保持在8-9。在连续搅拌下将反应物保持在4℃过夜。随后，在乙醇沉淀之前将NaCl溶解在溶液中。收集沉淀的MeHA并用乙醇洗涤三次。最后，将MeHA溶于水中，并通过对去离子水透析7天来纯化。通过冷冻干燥获得纯化的产物，并在使用前储存在4℃下。将50mg/mL MeHA和0.5mg/mL光引发剂(Irgacure2959)共同照射5min，得到交联的MeHA水凝胶。

将制得的MeHA水凝胶切割成与48孔板内孔直径相同大小的圆形，然后放置在48孔板中。向孔中加入200μL EDC(50mg/mL，0.1MPBS)/NHS(50mg/mL，0.1M PBS)的混合溶液，室温孵育2h，活化水凝胶上的羧基。将多余的EDC和NHS混合溶液吸出，用PBS(pH7.4)冲洗后，加入500μL 1μM NH

2.2纳米金溶胶的制备

将50mL 0.01％ HAuCl

2.3复合二氧化硅检测探针的制备

将3mL浓氨水(wt 28％)与10mL去离子水混合均匀，在45℃下，加入0.02g表面活性剂十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)和0.05g原硅酸四乙酯(TEOS)进行搅拌，反应7小时，然后离心、三次洗涤后，得到介孔二氧化硅。然后加入0.2mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，并在50℃下搅拌3h，再次离心、洗涤，制得氨基化的介孔二氧化硅。

称取10mg氨基化的介孔二氧化硅，并分散至10mL去离子水中，然后加入0.121g半胱氨酸，室温下搅拌反应6小时。10000rpm转速下离心15min，弃去上清，将得到的固体重新分散在1mL去离子水中。利用TECP将羧基化的发夹EpCAM适配体和CSV适配体分别活化，然后加入上述反应中得到的包载半胱氨酸的介孔二氧化硅，室温下孵育2小时，经过充分的洗涤和离心后，得到复合二氧化硅探针，将此探针作为CTCs的检测探针。

2.4细胞培养及处理

本申请中涉及到的阳性CTCs为A549(人肺癌细胞)，SW480(人结肠癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)、HepG2(人肝癌细胞)。THP-1为阴性对照细胞。

上述细胞培养于添加了10％胎牛血清及双抗(100U/ml青霉素、100U/ml链霉素)的1640培养基中。所有细胞均置于37℃、5％ CO

2.5CTCs的分选

CTCs阳性和阴性细胞先用生理盐水稀释至10万个/mL，再稀释至10、20、40、100、200、400、1000个/mL的细胞溶液，向装有水凝胶分选探针的48孔板中分别加入300μL细胞溶液和300μL空白PBS溶液(对照)，室温下孵育30min，然后取出孔中剩余溶液，加入PBS溶液反复清洗。对富集细胞后的水凝胶进行DAPI染色，在倒置荧光显微镜下观察富集后的细胞。同时取200μL上清液，在流式细胞仪上对未富集到的细胞进行计数，计算分选效率(分选效率(％)＝(富集到的细胞数量/加入的细胞数量)×100％)。按照上述方法，考察并比较水凝胶分选探针对其他细胞的分选情况。

2.6CTCs的检测步骤

CTCs阳性和阴性细胞先用生理盐水稀释至10万个/mL，再稀释至3、20、50、100、200、400、1000个/mL的细胞溶液，向装有水凝胶分选探针的48孔板中分别加入300μL细胞溶液和300μL空白PBS溶液(对照)，室温下孵育30分钟，然后取出孔中剩余溶液，加入PBS溶液反复清洗。接着向清洗后的孔板中加入新鲜制备的100μL 0.5mg/mL复合二氧化硅检测探针，同样在室温下孵育40min。然后调节溶液pH为5.0左右，依次加入200μL 1M的NaCl溶液，50～100μL纳米金溶胶，室温下反应15min，使用移液器将溶液吸出，在紫外-可见分光光度计上测试溶液的吸收图谱。将细胞组的检测结果与空白PBS组进行对比，验证是否可以通过金溶胶在520nm处吸光度的变化(△A)反映CTCs的数量。

2.7MTT实验验证分选和检测探针的生物安全性

将生长状态良好的A549细胞种植于96孔板中，数量为5×10

％＝([OD]

3.结果与讨论

图1是MeHA水凝胶的SEM图。从图中可看出，所合成的水凝胶呈现高度交联的三维网格结构，这种结构为细胞粘附提供了非常优异的负载界面。

图2是纳米金溶胶的TEM图。所述纳米金溶胶中粒子的平均粒径约为13.2nm。同时，在其对应的紫外-可见吸收光谱图上，能够观察到在520nm处出现了一个最大吸收峰，对应于纳米金溶胶的等离子体吸收，且溶胶溶液颜色为酒红色，这表明纳米金溶胶粒子的成功合成。

本发明中制备的水凝胶分选探针上连接有EpCAM适配体和CSV适配体，这两种蛋白在很多类型的CTC上均有显著表达；为了凸显出分选探针在泛癌种筛查的应用，我们挑选了A549(人肺癌细胞)，SW480(人结肠癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)、HepG2(人肝癌细胞)作为CTC阳性细胞。由于EpCAM和CSV在THP-1上没有明显表达，所以将此细胞作为阴性对照细胞。

参考图3，该分选探针对几种CTC阳性细胞都表现出了较高的富集能力，分选效率都能够达到90％左右，如对A549的分选效率为89％，SW480为91％。然而，在相同条件下，探针对THP-1的分选效率仅有27％左右，远低于几种CTC阳性细胞。这种显著差异充分说明我们的探针对CTC具有高度特异性。同时，为了更加直观地观察到水凝胶上富集到的CTC，我们采集了富集A549细胞后的水凝胶的SEM图。

如图4所示，可以清楚地看到A549细胞被探针捕获而附着于探针表面。进一步观察可发现被富集到的A549细胞已伸出少许伪足来固定自身，这也间接表明分选探针具有足够高的生物安全性。

我们接着比较了单EpCAM和单CSV适配体修饰探针与双适配体修饰的水凝胶探针对A549、SW480和MCF-7细胞的分选能力。如图5所示，可以看出，由于每种类型CTC上蛋白表达情况不同，上述三种探针对细胞的分选能力有所差别。但总体而言，对于这三种CTC，双适体修饰的探针的分选效率都要显著高于单EpCAM和单CSV适配体修饰探针。这也充分证实，我们通过在水凝胶上同时修饰两种适配体进行CTC的识别和富集，来进一步提高富集效率的策略，是非常可行的。

我们考察并比较了在PBS和稀释后血液两种介质中，分选探针对3～800cell/mL的A549细胞的分选能力。从图6中可以看出，在PBS溶液中，当3个A549细胞加入到水凝胶表面，能够富集到2个，分选效率达到67％。随着加入细胞数量的增加，被探针识别到的细胞个数也线性增加，如细胞个数为90时，可以识别到81个细胞，分选效率达到90％。此后，继续增加细胞数量，分选效率均能够保持在90％以上。同时，我们发现，即便是在裂解后的血液中，探针仍旧能够获得较高的分选效率。虽然与PBS中的数据相比，有稍许下降，但两者并无显著性差异，平均分选效率也能够达到85％左右。这组实验结果充分说明了我们设计的水凝胶探针具备在临床应用的巨大潜力。

通过比较探针在1～8周内对相同数量的A549细胞的分选效率，验证了探针在肿瘤早筛应用中的稳定性。参考图7，探针在上述四个时间点，得到的分选效率均无明显差异，上下维持在90％左右。这充分说明水凝胶作为一种可靠、稳定的细胞负载界面，能够储存较长时间，避免了因为自身稳定性而影响检测分析结果。并且这种稳定性要优于常规的磁性分选探针。

对于CTC的检测，我们考察了半胱氨酸(Cys)诱导金溶胶发生聚集的能力。从图8中可以看出，纳米金溶胶的最大吸收峰出现在520nm左右。当0.1μM半胱氨酸加入后，520nm处的等离子体吸收强度发生明显下降，这是由于聚集体中相邻粒子之间的电偶极子-偶极子相互作用和耦合。随着半胱氨酸浓度的逐渐加大，峰的强度也越来越小。同时，我们也观察到在此过程中，金溶胶的颜色也逐渐从酒红色变为浅紫色。这说明我们利用半胱氨酸诱导金溶胶团聚所引起的吸光度的变化，进而用于检测CTC的策略，是可行的。

接着我们尝试利用上述检测探针和纳米金溶胶，建立CTC的比色分析技术。我们将5，50，100，200，300和500个A549细胞首先用水凝胶探针富集，然后分次加入检测探针和纳米金溶胶，室温下孵育15分钟后，检测其在520nm处的吸光度值，并与空白纳米金溶胶的吸光度值比较，通过计算△A值(△A＝A0-A，A0为不加细胞和检测探针时的金的吸光度值，A为加入细胞和检测探针后的金的吸光度值)，对CTC的数量进行检测。

从图9中可以看出，在PBS溶液中，随着加入的A549细胞数量的增加，被水凝胶探针富集到的细胞个数逐渐增加。加入检测探针后，检测探针上的发夹DNA识别到细胞，从而从二氧化硅里释放出半胱氨酸。并且随着细胞数量的增加，释放下来的半胱氨酸的数量逐渐增多，因而导致金的聚集程度越来越大，在520nm处的吸光度值下降的程度也越来越明显。我们将该波长下的△A作为定量依据，该值与A549细胞在5～500/mL范围内呈现良好的线性关系。线性回归方程为Y＝0.0003X+0.626，相关系数(R2)为0.99，其中Y和X分别表示为△A和A549细胞数量。

本发明中对CTC的检测，是通过将两种发夹结构的核酸适配体修饰在二氧化硅表面，进而达到封装半胱氨酸的作用。在CTC的触发下，发夹结构打开，包封的半胱氨酸释放出来，引起金溶胶的团聚。为了验证上述两种适配体的同时修饰对检测灵敏度的提升作用，我们比较了单EpCAM和单CSV适配体修饰检测探针以及EpCAM和CSV双适配体修饰探针对200个A549细胞的△A值。

如图10所示，可以看出，单适配体修饰的两种检测探针，其△A值要明显低于双适配体探针。造成上述结果的主要原因在于：探针上只有一种适配体存在时，识别到的CTC数量较少，发夹结构打开程度低，使得从二氧化硅种释放出来的半胱氨酸浓度较低，所以金团聚的程度就下降。

同样，我们也考察了检测探针是否能够用于多种类型CTC的检测。我们首先利用水凝胶探针分别富集200个A549，SW480、MCF-7和HepG2后，进一步加入检测探针和金溶胶，观察是否能够产生吸光度的变化。如图11所示，加入上述几种CTC阳性细胞后，都能引起金溶胶在520nm处的吸光度发生明显的改变，几种细胞之间无明显差异。然而，对于THP-1细胞，由于分选探针无法识别，后续继续加入检测探针和金溶胶，也不会引起金溶胶吸光度的改变。由此进一步说明，我们设计的这种分离和检测CTC的试剂盒，能够对血液中CTC的特异性识别和检测起到双重保险作用，这对于痕量物质分析，大大提高了数据的精准度。

为了验证本发明中的分选探针和检测探针是否对细胞具有足够高的安全性，我们进行了MTT实验。如图12A所示，随着A549细胞和水凝胶探针孵育时间的增加，未发现明显的细胞活性下降，且细胞存活率最低为86％(P>0.05，无统计学差异)。同样，对于检测探针，我们也发现，不同浓度的探针对细胞活性的影响也较小(图12B)。虽然随着探针浓度的增加，细胞活性有稍许下降，但在本实验所选择的浓度范围内(100μg/mL)，细胞的存活率较高，能够达到85.8％，因而对于细胞仍然是安全的，不影响后续分析。

最后，我们收集了临床肺癌、肝癌、结肠癌患者以及健康志愿者的1.5mL血液，然后按照上述研究过程，利用分选探针和检测探针，对其血液中的CTC个数进行了分析。参考图13，4位健康志愿者血液中检测到的CTC个数为0或1。而12位肿瘤患者的血液中，则检测出了数量不等的CTC，其数量范围在5～37之间。这说明我们所设计的试剂盒能够敏感地肿瘤患者血液中极少数的CTC，具备了在临床开发和推广使用的巨大潜力。

上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。