一种假马齿苋P450酶基因BmCYP068及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种假马齿苋P450酶基因BmCYP068及在制备23-OH-Dammarenediol II和25-OH-Dammarenediol II中的应用。

背景技术

假马齿苋Bacopa monnieri(L.)Wettst.是玄参科(Scrophulariaceae)假马齿苋属Bacopa Aubl.植物，主要分布在热带和亚热带地区，多见于水边、湿地及沙滩等地方，在我国主要分布在台湾、福建、广东、云南等省份。假马齿苋是印度传统阿育吠陀医学的一种备受推崇的草本植物，被公认为补脑的高价值药用植物，能够改善记忆和智力。全球不同的研究小组探索假马齿苋用于治疗痴呆症、健忘症、记忆功能障碍、帕金森病、阿尔茨海默病、癫痫发作和精神分裂症。除神经保护外，假马齿苋还具有镇静、抗菌、抗炎、抗惊厥、抗衰老、支气管血管扩张、抗癌、抗抑郁药、抗呕吐和抗溃疡活性。据报道，假马齿苋这些潜在的药理活性与其次生代谢物达玛烷型三萜皂苷密切相关。

假马齿苋中的三萜类皂苷含量丰富种类繁多，按其结构可以分为达玛烷型、葫芦烷型、羽扇豆醇型、乌苏烷型等。其中，达玛烷型三萜皂苷是最常见的一类成分，这些化合物与植物的潜在药理作用息息相关。该类化合物多以糖苷形式存在，其母核结构主要以酸枣仁皂苷元和伪酸枣仁皂苷元为主，这些化合物的区别在于连接的糖基种类和方式多种多样。

假马齿苋中的三萜皂苷含量低，结构复杂，从植物材料中提取需要大量的原材料。然而，目前假马齿苋现存资源多为野生状态，数量稀少且分布零散，而且分离的成本高，化学合成难度大，因此限制了假马齿苋中三萜皂苷的应用。因此，利用合成生物学的方法生产单体化合物是未来实现假马齿苋中三萜皂苷大规模生产的最有效和可行的方法之一。然而，目前对假马齿苋的研究主要集中在化合物的提取分离和药理活性鉴定，其三萜皂苷合成的分子机理尚不清楚。要想通过生物合成的方法获得假马齿苋中的达玛烷型三萜皂苷，首先要解析这些化合物的生物合成途径。

酸枣仁皂苷元和伪酸枣仁皂苷元作为假马齿苋三萜皂苷的关键中间体，鉴定其生物合成的酶成为重中之重。但迄今为止，负责假马齿苋中酸枣仁皂苷元和伪酸枣仁皂苷元生成的相关酶功能尚未得到验证，影响了假马齿苋中达玛烷型三萜皂苷生物合成工作的推进。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种假马齿苋P450酶基因BmCYP068，可作为假马齿苋三萜皂苷的生物合成中形成23-OH-Dammarenediol II和25-OH-Dammarenediol II调控基因以及应用于制备23-OH-Dammarenediol II和25-OH-Dammarenediol II。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供一种假马齿苋P450酶基因BmCYP068，假马齿苋P450酶基因BmCYP068核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列全长1554bp。

本发明第二方面提供上述假马齿苋P450酶基因BmCYP068编码蛋白，该编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码了518个氨基酸残基。

本发明第三方面提供含有上述假马齿苋P450酶基因BmCYP068的重组质粒。

进一步，优选的是，将假马齿苋P450酶基因BmCYP068与Y33载体同源重组，获得Y33-BmCYP068重组质粒。

本发明第四方面提供一种转基因工程菌，含有上述重组质粒，或，所述基因工程菌的基因组中整合有外源的上述假马齿苋P450酶基因BmCYP068。

进一步，优选的是，所述转基因工程菌为酿酒酵母Dammarenediol I I底盘细胞。

本发明第五方面提供上述假马齿苋P450酶基因BmCYP068编码得到的假马齿苋P450酶BmCYP068。

本发明第六方面提供上述假马齿苋P450酶基因BmCYP068在制备23-OH-Dammarenediol II和25-OH-Dammarenediol II中的应用。

进一步，优选的是，以底盘细胞产生的Dammarenediol II为底物，在由所述的假马齿苋P450酶基因BmCYP068编码得到的假马齿苋P450酶BmCYP068的催化下经过侧链23位或25位羟基化生成23-OH-Dammarenediol II和25-OH-Dammarenediol II。

本发明通过重组质粒，在酿酒酵母底盘细胞中表达后获得目标蛋白，经进一步对底物Dammarenediol II进行催化，直接生成23-OH-Dammarenediol II和25-OH-Dammarenediol II。

本发明所述的假马齿苋P450酶基因BmCYP068，是从假马齿苋的植株中，通过转录组测序及生物信息学技术，经大量实验后筛选后得以鉴定出来的；经过密码子优化，通过人工合成的方法获得。所述的假马齿苋P450酶基因BmCYP068的扩增引物如下所示：

5'F：ATGGCAGTTAAATTGAGCAGC；(SEQ ID NO.3)

3'R：TTACAATTTGTGCAAAACCATAGAAGC。(SEQ ID NO.4)

此外，与载体Y33进行同源重组时，BmCYP068基因则需要使用用带同源壁的引物进行扩增及回收，带同源壁的引物如下：

上游同源臂引物：5'F：cagtcgacctcgaatctaga ATGGCAGTTAAATTGAGCAGC；(SEQ IDNO.5)。

下游同源臂引物：3'R：

ctaattacatgatgcggcccTTACAATTTGTGCAAAACCATAGAAGC(SEQ ID NO.6)。

从假马齿苋中分离并鉴定的P450酶基因BmCYP068，可作为假马齿苋的分子辅助育种的重要标记基因，同时也可作为酵母底盘细胞构建中生产23-OH-Dammarenediol II和25-OH-Dammarenediol II及假马齿苋皂苷的重要候选基因。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明提供P450酶基因BmCYP068可作为23-OH-Dammarenediol II和25-OH-Dammarenediol II的生物合成调控基因，并应用于制备

23-OH-Dammarenediol II和25-OH-Dammarenediol II。

(1)随着生物信息学技术的飞速发展，极大地推进了三萜类化合物生物合成路径关键酶基因的挖掘，本发明中23-OH-Dammarenediol II和25-OH-Dammarenediol II的生物合成调控基因即P450酶基因BmCYP068，是在假马齿苋中首次鉴定并成功验证，开辟了一种生产23-OH-DammarenediolII和25-OH-Dammarenediol II的生物合成新方法。本发明通过在酿酒酵母内异源表达蛋白并进行催化的方式来获得目标产物，采用体内生物合成，进行定向生产，具有产量高等优点。

(2)本发明提供了含有该P450酶基因BmCYP068的重组质粒、基因工程菌，为通过生物工程方法大量合成23-OH-Dammarenediol II和25-OH-Dammarenediol II，进一步为构建产23-OH-Dammarenediol II和25-OH-Dammarenediol II的细胞工厂研究奠定基础。

(3)通过异源生物合成23-OH-Dammarenediol II和25-OH-Dammarenediol II，可控性强，可以减少对原料种植的需求，生产产物产量高，便于后期23-OH-Dammarenediol II和25-OH-Dammarenediol II的分离和纯化；还可减少化学合成困难，合成路径复杂等问题。所述P450酶基因BmCYP068作为23-OH-Dammarenediol II和25-OH-Dammarenediol II生物合成的关键基因，还可用于假马齿苋植物的育种研究。

附图说明

图1为23-OH-Dammarenediol II和25-OH-Dammarenediol II推导的合成路径示意图；

图2为重组表达质粒Y33-BmCYP068的构建示意图；

图3为假马齿苋P450酶基因BmCYP068重组后的电泳检测结果。其中，M为核酸Mar，1-6为阳性单菌落检测结果；

图4为HPLC检测假马齿苋P450酶基因BmCYP068在酵母体内对底物DammarenediolII的催化作用(DM+PPD标品：Dammarenediol II标准品和PPD标品出峰时间；DM底盘+Y33空载：对照组Y33空质粒作为阳性对照的反应结果；DM底盘+BmCYP068：假马齿苋P450酶基因BmCYP068在酵母体内催化底物Dammarenediol II反应结果，产物1和2出峰时间)。

图5为LC-MS检测结果，反应产物1的特征峰离子图(理论分子量460)。

图6为LC-MS检测结果，反应产物2的特征峰离子图(理论分子量460)。

图7为NMR检测结果，反应产物1的NMR

图8为NMR检测结果，反应产物1的NMR

图9为NMR检测结果，反应产物1HMBC谱。

图10为NMR检测结果，反应产物1的HSQC谱。

图11为NMR检测结果，反应产物1的COSY谱

图12为NMR检测结果，反应产物1的ROESY谱。

图13为NMR检测结果，反应产物2NMR

图14为NMR检测结果，反应产物2的NMR

图15为NMR检测结果，反应产物2的HMBC谱。

图16为NMR检测结果，反应产物2的HSQC谱。

图17为NMR检测结果，反应产物2的COSY谱

图18为NMR检测结果，反应产物2的ROESY谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1

基于假马齿苋转录组Unigene基本功能注释信息，在测序注释结果中进行筛选CYP候选基因，同时，以植物中鉴定的细胞色素P450单加氧酶(Cytochrome p450Monooxygenase，CYPs)为参考序列，通过序列本地BLAST分析，然后对筛选结果进行整理分析，最后筛选出20个CYP基因。其中BmCYP068的功能注释为细胞色素P450单加氧酶，最后根据Unigene所对应ID号，从fasta文件中提取Unigene核苷酸序列进行后续分析。之后进行密码子优化、人工合成、同源重组、酵母底盘细胞体内诱导表达，酵母代谢物提取，以及HPLC、LC-MS和NMR检测等一系列工作后，最终鉴定出BmCYP068基因可以催化Dammarenediol II侧链的23位或25位羟基化生成23-OH-Dammarenediol II和25-OH-Dammarenediol II(图1)。23-OH-Dammarenediol II和25-OH-Dammarenediol II合成的各阶段操作步骤如下(以下实施所用试剂、原料、仪器设备等均为市售)：

(1)BmCYP068基因的密码子优化及人工合成

将从转录组中注释到的P450合酶编码基因BmCYP068进行密码子优化后由公司进行人工合成。

(2)基因重组载体的构建与鉴定

同源重组的示意图详见图2。首先对载体Y33进行线性化，使用XbaI酶进行单酶切获得线性化载体，酶切体系(50μL)环状Y33载体1μg，10×NEBuffer5μL，RestrictionEnzyme 1μL，双蒸水补足至总体系50μL，将反应液放置在37℃温育15min，获得线性化载体Y33。回收使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit试剂盒，回收结束后测定其浓度，最后放-20℃冰箱中保存备用。同源重组时则按照同源重组酶试剂盒的操作说明进行组装，然后根据插入片段和载体的浓度，并按照重组说明计算各组分用量；最后在冰上将各组分加入到PCR反应管中，如表1。将假马齿苋P450酶基因BmCYP068与Y33载体同源重组获得重组质粒，命名为Y33-BmCYP068。将重组质粒转化到DH5α大肠杆菌中，挑选阳性克隆进行检测并送公司测序，组装后的电泳检测结果见图3，表明组装成功。按以下过程重组操作：

表1候选基因重组反应体系Table 1Candidate genes Recombination System

其中X＝(0.02×Y33碱基对数)ng/线化化Y33浓度ng/μL；Y＝(0.02×Y33碱基对数)ng/BmCYP068回收浓度ng/μL；

(3)重组质粒提取

吸取测序检测好的阳性单克隆保种液10μL置于6mL LB液体培养基中(100mg/mLAmp)，于37℃摇床(220r/min)培养过夜。按照质粒DNA小量制备试剂盒离心柱型(GenStar，中国深圳)中的说明抽提质粒，提取后质粒DNA在NanoReady超微量紫外可见分光光度计上测定其回收浓度，最后放-20℃冰箱中保存备用。

(4)DM酵母底盘细胞感受态制备

挑取SC-His-Leu平板上DM底盘细胞菌株接种进入100ml的SC-His-Leu液体培养基中，30℃，220rpm培养至OD＝0.8～0.9，用50mL的离心管进行分离，5000g/5min收集菌体。25mL灭菌水洗两次，重复离心步骤，清洗后的菌体用1mLddH o重悬混匀转移至1.5mL离心管，13000rpm，离心30s收集菌体。用600μL dd水重悬，分装每管100μL用于转化

(5)DM酵母底盘细胞转化

在掌上离心机离心20s，弃上清，加转化体系：PEG4000(50％)240μL，LAC(醋酸锂)1.0mol 36μL,SSDNA(蛙鱼精)2.0ug/μL 10μL,带目的片段的质粒(400ng)和ddH O共74μL。混合好的体重重悬30℃保温20min，42℃热激40min，取200μL菌液涂板SC-His-Leu-Ura，并倒置放入30℃培养箱培养2～4天后挑选阳性克隆菌株进行验证。

(6)阳性菌株克隆筛选

于0.2mL PCR管中各加入20μL ddH2O，挑取上述培养的单菌落各4个；于PCR仪95℃反应10min进行破壁处理。在PCR管中加入如下反应体系：Super 2x Mix 12.5μL，灭菌水10.5μL，通用正向引物(10mM)0.5μL，通用反向引物(10mM)0.5μL，1μL溶于水中的单克隆模板。其中检测通用引物采用软件(SnapGene 3.2.1)设计，检测的上游引物：

GATGCTTTCTTTTTCTCTTTTTTTACAGATC，下游引物：

GCGTGAATGTAAGCGTGAC；PCR扩增循环参数为：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃90S，35个循环；72℃5min，10℃5min。

(7)检测及测序

取1.0μL Loading buffer加5μL上述PCR产物，混匀，经1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，如与目的片段大小相近，则为真阳性酵母菌株，表示为转化成功。将鉴定为阳性克隆的菌液用SC-His-Leu-Ura液体培养基培养1天后保菌。方法为50％甘油与菌液按1:1加入保种管，充分混匀后放入-80℃超低温冰箱中保存，备用。

(8)酵母诱导表达及检测

挑选生长正常的阳性转化菌株在SC-His-Leu-Ura的液体培养基(50ml)中培养，在30℃，220rpm震荡培养5天后8000rpm离心5min收集细胞，用2ml裂解液(20％KOH，50％EtOH)，裂解破壁；用相同体积的正己烷萃取三次；将萃取液用旋蒸仪旋干，用3ml色谱甲醇溶解。通过HPLC对萃取的代谢产物进行分析。

HPLC检测条件如下：

HPLC检测所用仪器为安捷伦高效液相色谱仪。色谱柱为安捷伦EC-C18色谱柱(4.6×100mm，2.7um)，柱温：25℃；测定流动相为：水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0～10min，70％～75％B；10～20min，75％～85％B；20～22min，85％～100％B；22～25min，100％B；洗脱时采用的流动相A+B总计100％；采用线性梯度洗脱；洗脱时间：25min；进样量：10μL；流速：0.8ml/min；检测波长203nm，检测器为二极管阵列检测器。检测结果见图5，表明实验样品在假马齿苋P450酶BmCYP068的催化下有新的产物产生。

LC-MS检测条件如下：

为了进一步确认HPLC所检测到的反应产物，采用Agilent 1290UPLC/6540Q-TOF液相色谱质谱联用仪(LC/MS/MS)进行检测：质谱条件：离子源采用的是负离子模式，电压：3500V；碎裂电压：135V；锥孔电压：60V；射频电压：750V，扫描范围：100-1000m/z，扫描方式：SRM。色谱条件：色谱柱为安捷伦EC-C18色谱柱(4.6×100mm，2.7um)，柱温：25℃；测定流动相为：水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0～10min，70％～75％B；10～20min，75％～85％B；20～22min，85％～100％B；22～25min，100％B；洗脱时采用的流动相A+B总计100％；采用线性梯度洗脱；洗脱时间：25min；进样量：10μL；流速：0.8ml/min；检测波长203nm，检测器为二极管阵列检测器。使用MassHunter工作站(Agilent)软件进行数据分析。检测结果见图5～6。

根据以上检测分析，推测在假马齿苋P450酶BmCYP068的催化下，DammarenediolII分别在两个位点发生了羟基化。为了明确羟基化位点，我们对化合物1和2进行了NMR检测。NMR检测在Bruker AV-800MHz光谱仪(Santa Clara,USA)上进行，检测结果见图7～18。综上检测结果分析，化合物1确定为23-OH-Dammarenediol II，化合物2确定为25-OH-Dammarenediol II。