对免疫细胞进行细胞数、活力或凋亡测定的高精密度方法

技术领域

本发明属于细胞学领域，更具体地，本发明涉及对免疫细胞进行细胞数测定、活力测定或细胞凋亡测定的高精密度方法。

背景技术

免疫细胞治疗是一种新兴的治疗方式，是被认为最有前途的癌症治疗方法之一。其中，嵌合抗原受体(CAR-T)细胞疗法是近年来发展非常迅速的一种细胞治疗技术。目前在全球已有两款药物获得FDA的批准上市，分别是诺华的Kymriah和凯特的Yescarta，全世界有多家公司产品进入临床申报阶段，这种疗法已成为许多患者的选择。

免疫细胞作为“活”的药物，其浓度活率是产品的重要指标之一，FDA 在2011年颁布的法规(Guidance for industry:Preclinical Assessment of InvestigationalCellular and Gene Therapy Products)要求对细胞的浓度活率进行监控；另外免疫细胞培养过程中，对浓度活率的准确监控，有助于了解细胞状态，优化细胞培养方案。

免疫细胞不同于其它细胞的特点是：免疫细胞直径比较小，大概在 9-12um，在细胞因子的刺激下容易分化，不易准确计数。在培养过程中，免疫细胞也存在着生长缓慢，不易培养等问题。

现有技术中，动物细胞活力测定的方法主要分为2大类，一种是基于台盼蓝(TB)细胞活力测定方法，即细胞样品用台盼蓝染色后，基于血细胞计数器和基于成像的细胞计数仪进行测定。第二种是，基于荧光染料(比如与核酸结合的荧光染料：DAPI，Hoechst 33342，ethidium bromide(EB)，propidium iodide(PI)，SYTOX green/red等，酶催化染料：acridine orange(AO)，calcein AM和CFDA等)的细胞活力测定法，细胞样品用荧光染料染色后，进一步用流式细胞仪和基于成像的荧光细胞计数仪来测定。基于荧光染料的细胞活力测定方法，由于荧光染料是要么与核酸结合，要么需要进入细胞，被细胞内酶催化产生荧光，从而可实现细胞的计数。目前，有一些自动化的荧光成像细胞计数仪，能够快速进行细胞计数，捕捉明场和荧光下细胞图片，进行视觉确认。目前已有相关仪器用于免疫细胞培养过程中浓度和活力测定，比如 Cellometer Vision(Nexcelom Bioscience)，Tali(Invitrogen)，NucleoCounter (Chemometec)。

但是，本领域中还存在细胞计数和分析方面的一些缺陷：一方面，不同的染料对于不同的细胞对象的染色效果存在不确定性，使得研究过程中存在计数不准的问题；另一方面，现有的计数仪器对于不同的应用场景、不同的检测目标，还存在不稳定性。例如，对于外周血单个核细胞(PBMCs)此类免疫细胞，在研究过程中发现，当应用常规的计数以及常规染色条件时，染色效果不理想、检测误差较大，甚至还有检测过程中细胞状态不理想的情况，难以找到较为理想的检测条件。

本领域中，也会采用常规的基于流式细胞仪的细胞活力测定，特别是应用于测试细胞凋亡。流式细胞仪可同时针对百万级别的细胞进行计数，减少统计学误差，但是流式细胞方法的检测在实践中也常遇到染料运用不当导致检测精密度不稳定的问题；同时，流式细胞仪成本高昂，仪器维护成本也很高，而且对用户操作技能要求较高，使得一些小型实验室或中小医院等检测机构望之却步。此外，流式细胞仪没有成像结果，无法对异常结果进行判定，而无法满足大多数用户的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供对免疫细胞进行细胞数测定、活力测定或细胞凋亡测定的高精密度方法。

在本发明的第一方面，提供一种对免疫细胞进行细胞数(浓度)、活力或凋亡测定的方法，包括：利用

在另一优选例中，所述的方法为高精密度测定方法，所述的高精密度为当细胞在8×10

在另一优选例中，所述的免疫细胞包括：外周血单个核细胞(PBMCs)，或来自于外周血单个核细胞的细胞。

在另一优选例中，所述来自于外周血单个核细胞的细胞包括：淋巴细胞，单核细胞，NK细胞。

在另一优选例中，所述的淋巴细胞包括：T细胞，B细胞。

在另一优选例中，所述的淋巴细胞为携带有嵌合抗原受体的重组细胞，如CAR-T细胞。

在另一优选例中，吖啶橙和碘化丙啶混合染料中，AO:PI为0.8～1.2:0.8～ 1.2；较佳地为1:1。

在另一优选例中，异硫氰酸荧光素和7-氨基放线菌素D混合染料中，按照体积比，异硫氰酸荧光素和7-氨基放线菌素D的比例为1.5:4。

在另一优选例中，测定时，

在另一优选例中，测定时，

在另一优选例中，所述免疫细胞的浓度为：1×10

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1A、AO染料对于PBMCs细胞进行染色的结果。

图1B、PI染料对于PBMCs细胞进行染色的结果。

图2、

图3、

图4、AO/PI-

图5、AO/PI-

图6、

图7、PBMCs在流式细胞仪和

图8、随着温度从37℃上升到60℃，流式细胞仪和

具体实施方式

本发明人经过一系列的筛选和优化，提供了一种新的对免疫细胞进行计数(浓度、活率，细胞凋亡功能检测)的方法，克服了现有技术中对于免疫细胞缺乏高精密度的测定方法的缺陷。本发明的方法可应用于基于免疫细胞治疗为基础的一系列功能检测研究。本发明的方法成本低廉，为小型实验室和诊所进行免疫细胞相关研究，尤其为在无法获得流式细胞仪、激光扫描仪和荧光显微镜或需要快速分析数据的场景下的检测提供了一种快速、简单且廉价的检测手段。

测定方法

基于本发明的新发现，提供了一种对免疫细胞进行细胞数(浓度)、活力或凋亡测定的方法，包括：利用

如本发明所用，所述的“免疫细胞”包括外周血单个核细胞(PBMCs)或来自于PBMCs的细胞等；所述来自于外周血单个核细胞的细胞包括：淋巴细胞，单核细胞，NK细胞等。所述的淋巴细胞包括：T细胞，B细胞。

本发明中，所述的免疫细胞可以是天然存在的免疫细胞、分离的免疫细胞、免疫细胞培养物或传代的细胞。

本发明中，所述的免疫细胞可以是经过人工改造的基因重组细胞、经修饰的细胞，例如其为携带有嵌合抗原受体的重组淋巴细胞，更具体地如 CAR-T细胞。

如本发明所用，所述的“明场、FL1、FL2”

如本发明所用，所述的“增益”是一种

目前，本领域中应用于进行细胞染色的染料种类繁多，包括DAPI， Hoechst33342，ethidium bromide(EB)，propidium iodide(PI)，SYTOX green/red 等，酶催化染料：Acridine Orange(AO)，calcein AM和CFDA等，而本发明人经过筛选和优化，发现AO和PI的混合染料对于免疫细胞以及结合

作为本发明的优选方式，AO和PI混合染料中，AO:PI为0.8～1.2:0.8～1.2；较佳地为1:1。本发明人发现，这样的比例下，染料对于细胞的影响最小，细胞状态最为理想，检测精密度高。

作为本发明的优选方式，对应于1×10

作为本发明的优选方式，FITC和7-AAD混合染料中，按照体积比，AO 和PI的比例为：的比例为1.5:4。本发明人发现，这样的比例下，染料对于细胞的影响最小，细胞状态最为理想，检测精密度高。

除了对于染料的筛选和优化，本发明人也优化了利用

因此，作为本发明的优选方式，测定时，

作为本发明的优选方式，测定时，

作为本发明的优选方式，所述免疫细胞的浓度为：1×10

在本发明的具体实施例中，对PBMCs浓度、活率和凋亡进行了一些列的适用性、准确性、稳定性测试与对比。结果显示，本发明的方法精密度高，呈现良好的准确性和稳定性。

应用

本领域中目前常用台盼蓝(TB)染色细胞样品后加到血细胞计数器上，置于光学显微镜下通过人工计数死活细胞测定。虽然这是测定细胞浓度和活率的标准方法，但是这种方法仍然存在以下几个缺陷：第一，TB有毒性，必须短时间内对细胞染色后进行计数。第二，由于TB是细胞蛋白结合，因此可能会与非细胞物质结合，特别是在临床和原代细胞样品中，可能会导致测定结果不准确。第三，目前没有标准化的用于测量细胞活力的TB浓度。第四，这种方法需要凭借用户在光学显微镜下判定细胞死活的条件下来计数，这对于细胞形态多样、有许多非细胞碎片的细胞样品时就容易产生误差，不仅费时，而且具有操作依赖性。手动台盼蓝检测的低精确度和对操作者的依赖性 (不同操作者测得的细胞浓度和活率相差很大)是这一技术的一个瓶颈。此外，移液和转移过程中的错误可能会导致CV值的增加。

与上段情形相比，本发明针对免疫细胞，提出了比TB染料更为适用的染料，即AO/PI染料，其对于免疫细胞的毒性低，使得细胞状态良好，有利于检测。同时，本发明人也发现，AO/PI染料与

本领域中也已开发了基于图像的细胞计数(IBC)系统，例如Cellometer AutoT4(Nexcelom Bioscience)，Countess(Invitrogen)和NucleoCounter， NC-200(Chemometec)，解决人工计数方法的已知问题。但这些自动细胞计数器还是需要在明场下依据台盼蓝染色与否来区别死活细胞。对于复杂的细胞样品时，比如含细胞碎片和污染了无核的细胞样品，大大影响了其测定的准确性。流式细胞术测量中也发现，移液和转移过程中的错误可能会导致CV 值的增加。

以上问题通过本发明的方法可以得到有效地解决，本发明的方法中选用

在经典的Annexin-V测试细胞凋亡的基础上，传统染料组合为FITC+PI，改进后的染料组合为FITC+7-AAD，利用此染料组合对同一批PBMCs进行流式细胞仪和

因此，本发明的方法不仅可以进行细胞计数以及活率测定，而且还可以应用于细胞凋亡的检测，以一台仪器以及适当的染料即可完成。可用

此外，也可基于本发明的方法开发出快速检测试剂盒，从而为小型实验室和诊所进行免疫细胞相关研究，尤其是在无法获得流式细胞仪、激光扫描仪和荧光显微镜条件下或需要快速分析数据情况下，提供一种快速、简单且廉价的替代方法。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

PBMCs浓度、活率制备

PBMCs先在-196℃下的液氮罐里进行冻存，冻存一段时间后，从液氮罐里拿出一株细胞进行复苏，复苏细胞的步骤，大致可分为以下几步。第一，打开水浴锅加热至37℃；第二，将从液氮罐中拿出的细胞，用镊子夹在水浴锅中，放置3-5min；第三，在无菌操作台中，将细胞转移至T25方瓶中，并放在37℃，5％CO

当PBMCs长到4×10

将活率在95％之上，浓度在1～4×10

表1

诱导凋亡检测，将PBMCs放置热诱导温度：37℃，45℃，50℃，55℃， 60℃各放置20min，并设置对照空白PBMCs，室温下即可。

台盼蓝手动计数

分别取每个浓度和活率的样品细胞，将50毫升样品与50毫升0.4％台盼蓝混合轻轻吹打，然后将20毫升混合物装入每个中血细胞计数器的腔室。根据标准方法，在40X物镜下一式三份地进行计数。

AO/PI荧光染料

分别取每个浓度和活率的样品细胞，将60毫升样品与60毫升AO/PI荧光染料混合轻轻吹打，然后将20毫升混合物装入每个

对应于1×10

计数时，对染色后的细胞1分钟后上样到

AO/DAPI荧光染料NC-200计数仪计数

分别取每个浓度和活率的样品细胞，由于NC-200的AO/DAPI染料已经在计数板中了，所以不需要细胞样品与染料进行混合，直接用NC-200的计数板吸取细胞样品即可(每次取的细胞样品不低于200毫升)，同时NC-200 每次只能上一个样，所以需一个一个样进行测试，每组做3个平行。

计数时，对染色后1分钟的细胞进行计数。

流式细胞仪对PBMCs活率的测试

分别取不同活率的样品细胞，加入PI染料，进行样品细胞与PI混合，2 分钟后上流式细胞仪测试，每组做三个平行。

测试时，对染色后呈现2分钟后的细胞进行计数。

测试细胞凋亡实验步骤

(1)每个样品收集约30-50万个细胞于1.5ml离心管内(如细胞密度为100万个/mL，则取500μl体积悬液用于后续实验)；将细胞在400g转速条件下离心3min，弃上清，用200μlPBS进行重悬；用移液枪轻轻吹打混匀， 400g转速条件下离心3min，弃上清，用100μlAnnexin V Buffer重悬；

(2)向细胞悬液中加入1.5μl Annexin V FITC染色液；

(3)加入4μl 7-AAD染色液；

(4)混匀，室温避光孵育10-15min；

(5)400g转速条件下离心3min，弃上清，用100μl Annexin V Buffer进行重悬；

(6)再次400g转速条件下离心3min，弃上清，用100μl Annexin V Buffer 混匀样本，并在30min内完成检测。

染料中，FITC和7-AAD的比例为1.5ul：4ul。

实施例1、

1、不同染料的初步研究

本发明人利用

本发明人分析了一系列染料后，初步选择台盼蓝、acridine orange(AO)、propidium iodide(PI)以及AO和PI混合的染料AO/PI进行测试。结果显示， AO染料使得PBMCs细胞在

利用

预先进行细胞活力设定，使其活力分别为100％，80％，60％，40％，20％和0，记录预设值。之后，以不同和染料结合

2、运用不同染料进行PBMCs细胞浓度测定的精密度和准确性

本发明人设置了相对较低的细胞浓度，在不同细胞浓度梯度(0.49×10

表2

根据表2中测得的变异系数(CV)值，在细胞浓度较低的情况下， AO/PI-

3、运用不同染料进行细胞活率测定的精密度和准确性

比较运用不同染料进行

预先进行细胞活力设定，使其活力分别为100％，75％，50％，25％和0，记录预设值。比较运用不同染料进行

表3

根据，PBMCs活率测定中，利用AO/PI染料结合

综上，反复实验论证后，本发明人选择AO/PI染料，其为AO和PI染料的复合染色。

实施例2、

本发明人利用

在细胞浓度梯度的测试中，本发明人分别对

大量测试后，本发明人发现，对于PBMCs细胞而言，当明场、FL1、FL2 增益过低，低于1.5、2、2时，导致细胞在

同时，本发明人也发现曝光强度对于PBMCs细胞的计数而言也是较为重要的。当曝光时间过低，明场、FL1、FL2曝光时间低于100ms、2000ms、 2000ms时，导致细胞在

因此，本发明人将明场、FL1、FL2增益设置为3、3.5、3.5；曝光时间设置为250ms、8000ms、8000m。

实施例3、利用多种设备进行PBMCs检测的比较

1、PBMCs浓度线性、相关性和精确性分析

比较AO/PI-

对细胞进行浓度梯度稀释，记录每个稀释系统中的细胞浓度(预设浓度)。之后，利用三种方法分别进行检测，获得测定值。

在浓度梯度(8×10

表4、使用三种染色方法对浓度梯度稀释的细胞的检测(n＝3)

根据表4中测得的CV值，AO/PI-

上述测定结果说明，AO/PI-

并且，手动台盼蓝完成表4计数所需时间为20分钟，而采用 AO/PI-

2、PBMCs活率线性、相关性和精确性分析

比较AO/PI-

预先进行细胞活力设定，使其活力分别为100％，75％，50％，25％和0，记录预设值。之后，利用四种方法分别对预设细胞体系进行细胞活率的检测，获得测定值。

结果显示，与预设值相比较，这四种方法均呈现一定的线性关系，线性比较结果为：AO/PI-

表5、使用四种染色方法对活率梯度稀释细胞的检测(n＝3)

因此，PBMCs活率测定中，利用AO/PI-

3、PBMCs细胞凋亡测定的分析(并非用

比较

由

流式细胞仪和

不同温度下，两种不同测定方式的活细胞百分比统计数据如图8，可见，流式细胞仪和

这一结果说明，本发明优化的

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。