一种莱氏绿僵菌及其在草地贪夜蛾蛹期的生物防治方法与应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种莱氏绿僵菌及其在草地贪夜蛾蛹期的生物防治方法与应用。

背景技术

草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)俗称秋黏虫，属鳞翅目夜蛾科灰翅夜蛾属，是一种起源于美洲的重大迁飞性、杂食性农业害虫，主要危害玉米、水稻、甘蔗等作物，具有适生区域广、繁殖能力强、防治难度大等特点。目前草地贪夜蛾防控主要依赖化学农药，但该虫对农药具有较强抗性，而且过度依赖和滥用农药易对环境和非靶标生物造成伤害，还使害虫产生抗药性，增加了防治难度。利用昆虫病原物开展“以菌治虫”是农业害虫生物防治的主要措施之一，也是推动农药减量控害的关键手段，对科学持续控害、保护生态平衡具有重要意义。

莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)是一种广泛分布的昆虫病原真菌，可侵染多种鳞翅目害虫，尤其对甜菜夜蛾、大豆夜蛾、斜纹夜蛾等夜蛾科害虫的侵染力极高，并且能引起害虫的田间流行病。莱氏绿僵菌主要通过产生附着胞、芽管等特殊结构侵入害虫体壁。之后在昆虫体内快速生长、繁殖，破坏害虫生理机能最终导致害虫死亡。真菌菌剂采用田间喷雾施药，易受温度、湿度等环境因子的影响，导致防治效果难以发挥。草地贪夜蛾幼虫大都在土壤中化蛹，土壤湿度条件容易发挥真菌菌剂的致病效果，而且草地贪夜蛾蛹期时间较长，常温下8～10天，因此蛹期是利用真菌菌剂进行地下防治的的重要时期。目前尚未见对该虫的地下防治真菌菌剂，如能开发一种在蛹期进行防治的真菌菌剂，将能有效控制草地贪夜蛾的种群数量，对草地贪夜蛾的防治意义重大。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种莱氏绿僵菌及其在草地贪夜蛾蛹期的生物防治方法与应用。本发明提供的莱氏绿僵菌对草地贪夜蛾蛹具有强致病力，可显著降低草地贪夜蛾蛹的羽化率，并对羽化后的成虫具有较高的致畸率和致死率，为后期安全有效的防治草地贪夜蛾奠定了基础，同时为利用环保健康的生物防治法防治草地贪夜蛾的前期施用推广提供了实验依据。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)FJMR2，保藏编号为CGMCCNo.18553。

本发明提供了上述技术方案中所述的莱氏绿僵菌FJMR2的培养方法，包括如下步骤：a)将莱氏绿僵菌FJMR2接种至SMAY固体斜面培养基进行培养，收集孢子；b)将孢子接种于大量草地贪夜蛾幼虫体壁进行扩大培养，待虫尸长满孢子粉且成散落状后收集孢子。

优选的，所述步骤a)的培养条件为：温度25～28℃，培养时间7-9d。

优选的，所述步骤b)的草地贪夜蛾幼虫为4～5龄幼虫；所述步骤b)的培养条件为温度25～28℃，培养时间9～11d。

本发明提供了上述技术方案中所述的莱氏绿僵菌FJMR2在防治草地贪夜蛾中的应用。

本发明提供了一种草地贪夜蛾蛹期的生物防治方法，将上述技术方案中所述的莱氏绿僵菌FJMR2施加作物的根围土壤中进行防治。

优选的，所述莱氏绿僵菌以孢子悬浮液的形式保存；所述孢子悬浮液的浓度优选为(1～6)×10

优选的，所述孢子悬浮液的施用的量优选为800～1200mL/亩。

优选的，所述莱氏绿僵菌间隔10～15d施用一次，连续施用1～2次。

优选的，所述作物的种类包括玉米、小麦、甘蔗、花生和薏米。

有益效果：

本发明提供了一种莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)FJMR2，保藏编号为CGMCCNo.18553。本发明提供的莱氏绿僵菌FJMR2对草地贪夜蛾蛹具有强致病力，可显著降低草地贪夜蛾蛹的羽化率，并对羽化后的成虫具有较高的致畸率和致死率，能有效控制草地贪夜蛾种群数量的增长，且该菌对环境友好，对人畜安全。采用本发明提供的莱氏绿僵菌FJMR2防治草地贪夜蛾蛹克服了虫生真菌无法侵染土壤中虫蛹的缺陷，切断了草地贪夜蛾的生活史，有效降低了种群密度。本发明提供的莱氏绿僵菌FJMR2防治草地贪夜蛾能够解决现有技术中采用化学农药防治草地贪夜蛾污染环境，易产生抗药性、地下蛹防治难度大的技术问题。

生物保藏说明

莱氏绿僵菌FJMR2，拉丁文为Metarhizium rileyi，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCC No.18553，保藏日期2019年09月23日，保藏地址北京市朝阳区北辰路西路1号院3号。

附图说明

图1为本发明提供的莱氏绿僵菌FJMR2在PDA培养基上的的菌落形态图；

图2为本发明提供的莱氏绿僵菌FJMR2的菌丝体和孢子形态的显微图；

图3为本发明提供的莱氏绿僵菌FJMR2的系统发育树结果；

图4为不同龄期草地贪夜蛾幼虫的感染症状图；A为低龄幼虫感染症状，B为4～5龄幼虫感染症状；

图5为4～5龄幼虫扩大培养莱氏绿僵菌FJMR2孢子；

图6为本发明提供的感染莱氏绿僵菌FJMR2的蛹及成虫症状图；其中A为蛹感染初期症状；B为羽化后成虫感染初期症状；C为蛹感染后期症状，D为成虫感染后期症状。

具体实施方式

本发明提供了一种莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)FJMR2，保藏编号为CGMCCNo.18553。本发明提供的莱氏绿僵菌FJMR2在PDA培养基上的菌落直径为5～8mm，白色凸起，质地丝绒状，反面土黄色，无渗出液产生，无可溶性色素产生。显微镜下观察，本发明莱氏绿僵菌FJMR2菌丝缠绕分枝分隔，壁平滑透明，直径1.1～4.5μm；分生孢子梗发生于气生菌丝，瓶梗轮生，每轮3～5个，基部明显膨大，向上有明显细颈，大小(2.4～5.0)×(1.6～2.5)μm；分生孢子椭圆形或卵圆形，大小(2.5～4.0)×(1.2～2.5)μm，壁平滑。本发明提供的莱氏绿僵菌FJMR2的26S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：

ATCTGGTCCCCAGGGCCCGAGTTGTAATTTGCAGAGGATGCTTTTGGCGAGCGCCTTCCGAGTTCCCTGGAACGGGACGCCATAGAGGGTGAGAGCCCCGTCTGGTTGGATGCCGAGCCTCTGTAAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTAGTTTGGGAATGCTGCTCTAAATGGGAGGTATATGTCTTCTAAAGCTAAATACCGGCCAGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGGGTTAAATAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTATGACCAGACTTGGGCCCGGTGAATCATCCAGCGTTCTCGCTGGTGCACTTTGCCGGGCTCAGGCCAGCATCAGTTTGCCCCGGGGGATAAAGGCTTTGGGAATGTGGCTCCCTCGGGAGTGTTATAGCCCATTGCACAATACCCTGGGGCGGACTGAGGTTCGCGCATCTGCAAGGATGCTGGCGTAATGGTCATCAGCGACCCGTC TTGA。

将本发明提供的莱氏绿僵菌FJMR2的26S rDNA核苷酸序列与Metarhizium rileyiCBS 806.71有99.90％的同源性。系统发育分析表明，FJMR2菌株与绿僵菌属菌株聚集在一个进化支上。综合FJMR2菌株的培养和形态学特征以及分子鉴定，确定菌株FJMR2为莱氏绿僵菌Metarhizium rileyi。

本发明提供的莱氏绿僵菌FJMR2对草地贪夜蛾蛹具有强致病力，可显著降低草地贪夜蛾蛹的羽化率，并对羽化后的成虫具有较高的致畸率和致死率，能有效控制草地贪夜蛾种群数量的增长，且该菌对环境友好，对人畜安全。采用本发明提供的莱氏绿僵菌FJMR2防治草地贪夜蛾蛹克服了虫生真菌无法侵染土壤中虫蛹的缺陷，切断了草地贪夜蛾的生活史，有效降低了种群密度。本发明提供的莱氏绿僵菌FJMR2防治草地贪夜蛾能够解决现有技术中采用化学农药防治草地贪夜蛾污染环境、易产生抗药性、地下蛹防治难度大的技术问题。

本发明提供了上述技术方案中所述的莱氏绿僵菌FJMR2的培养方法，包括如下步骤：a)将莱氏绿僵菌FJMR2接种至SMAY固体斜面培养基进行培养，收集孢子；b)将孢子接种于大量草地贪夜蛾幼虫体壁进行扩大培养，待虫尸长满孢子粉且成散落状后收集孢子。

本发明将莱氏绿僵菌FJMR2接种至SMAY固体斜面培养基进行培养，收集孢子。本发明对SMAY固体斜面培养基没有特殊要求，采用本领域技术人员公知的SMAY培养基即可。在本发明中，所述培养的温度优选为温度25～28℃，进一步优选为26℃。本发明对光照条件没有特殊要求。在本发明中，所述培养的时间优选为7-9d，进一步优选为8d。本发明采用SMAY固体斜面培养基对莱氏绿僵菌FJMR2进行培养能够提高莱氏绿僵菌FJMR2的孢子产量，以利于后续的扩大培养。

得到孢子后，本发明将孢子接种于大量草地贪夜蛾幼虫体壁进行扩大培养，待虫尸长满孢子粉且成散落状后收集孢子。在本发明中，所述草地贪夜蛾幼虫优选为4～5龄幼虫，进一步优选为4龄幼虫。在本发明中，所述培养的温度优选为温度25～28℃，进一步优选为26℃。在本发明中，所述培养的时间优选为9～12d，进一步优选为10d。本发明选择草地贪夜蛾幼虫对莱氏绿僵菌FJMR2进行扩大培养，不仅操作简单，且在短时间内即可获得大量莱氏绿僵菌FJMR2孢子。

本发明提供的莱氏绿僵菌FJMR2的培养方法不仅操作简单，而且产孢量大，可实现规模化生产，满足莱氏绿僵菌FJMR2生产的需要。

本发明提供了上述技术方案中所述的莱氏绿僵菌FJMR2在防治草地贪夜蛾中的应用。本发明莱氏绿僵菌FJMR2不仅对草地贪夜蛾蛹具有强致病力，对草地贪夜蛾幼虫也具有良好的致病效果，采用该菌防治草地贪夜蛾，能消退害虫种群数量，使种群密度处于经济阈值之下，避免或减少因不合理使用化学农药所带来的抗药性、食品安全、环境污染等问题。

本发明提供了一种草地贪夜蛾蛹期的生物防治方法，将上述技术方案中所述的莱氏绿僵菌FJMR2施加作物的根围土壤中进行防治。

本发明提供的生物防治方法优选针对草地贪夜蛾蛹期阶段，莱氏绿僵菌FJMR2对草地贪夜蛾蛹具有强致病力，可显著降低草地贪夜蛾蛹的羽化率，并对羽化后的成虫具有较高的致畸率和致死率，能有效控制草地贪夜蛾种群数量的增长，且该菌对环境友好，对人畜安全。在本发明中，所述莱氏绿僵菌FJMR2施加作物的根围土壤中对草地贪夜蛾进行防治，不易受温度、湿度等环境因子的影响，防治效果稳定。在本发明中，所述作物的种类优选包括玉米、小麦、甘蔗、花生和薏米；进一步优选为玉米。在本发明中，所述莱氏绿僵菌优选以孢子悬浮液的形式保存。在本发明中，所述孢子悬浮液的浓度优选为(1～6)×10

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种莱氏绿僵菌及其在草地贪夜蛾蛹期的生物防治方法与应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1：莱氏绿僵菌FJMR2菌株的分离与鉴定

1FJMR2菌株分离纯化及致病性测定

本发明莱氏绿僵菌FJMR2于2019年8月6日采自福建省建瓯市东峰镇玉米种植区罹病草地贪夜蛾幼虫虫尸。将采集到的虫尸置于5mL无菌EP管中带回，在PDA培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL)上轻轻抖动虫尸至少许分生孢子落于培养基上，置于26℃生化培养箱中培养，产孢后将分生孢子转接到新的PDA培养基上进行纯化，即得FJMR2菌株。

将纯化得到的FJMR2菌株采用SMAY培养基(麦芽糖40g、蛋白胨10g、酵母浸膏2g、琼脂20g、蒸馏水1000mL)于26℃生化培养箱中培养。采用孢子悬浮液浸渍接种法进行菌株致病性测定，孢子悬浮液的浓度为3×10

2FJMR2菌株形态鉴定

将分离并纯化得到的FJMR2菌株接于PDA培养基上，26℃培养7d，菌落直径5～8mm，白色凸起，质地丝绒状，反面土黄色，无渗出液产生，无可溶性色素产生，如图1所示。显微观察发现：菌丝缠绕分枝分隔，壁平滑透明，直径1.1～4.5μm；分生孢子梗发生于气生菌丝，瓶梗轮生，每轮3～5个，基部明显膨大，向上有明显细颈，大小(2.4～5.0)×(1.6～2.5)μm；分生孢子椭圆形或卵圆形，大小(2.5～4.0)×(1.2～2.5)μm，壁平滑，如图2所示。初步鉴定菌株FJMR2为莱氏绿僵菌Metarhizium rileyi。

3FJMR2菌株分子鉴定

将分离纯化获得的FJMR2菌株接种于PDA培养基上，26℃培养7d。收集菌丝，研磨至细粉状，依据改良CTAB法提取DNA。采用26SrDNA引物扩增26S rDNA序列。PCR反应体系总体积25μL，由以下组分组成:2×PCR Buffer 12.5μL，引物(20μmo1/L)各1.0μL，DNA模板1.0μL(50ng/μL)和余量水。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸5min。扩增后用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化。将纯化后的PCR产物送往上海生工生物技术有限公司测序，26S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将26S rDNA基因片段的测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对。FJMR2的26SrDNA基因序列与Metarhizium rileyi CBS 806.71有99.90％的同源性。系统发育树的结果见图3。系统发育树的分析表明，FJMR2菌株与绿僵菌属菌株聚集在一个进化支上。综合FJMR2菌株的培养和形态学特征以及分子鉴定，确定菌株FJMR2为莱氏绿僵菌Metarhizium rileyi。

实施例2：莱氏绿僵菌FJMR2对不同龄期草地贪夜蛾幼虫的侵染特性

a.将莱氏绿僵菌FJMR2接种于SMAY固体斜面培养基，于26℃，培养7～9d，培养结束后收集孢子；

b.用毛刷蘸取少量孢子粉，分别刷于低龄幼虫(1-3龄幼虫)和高龄幼虫(4～5龄)草地贪夜蛾幼虫体壁，于26℃培养7～12d，观察莱氏绿僵菌FJMR2莱氏绿僵菌FJMR2对不同龄期草地贪夜蛾幼虫的侵染特性。

结果：低龄幼虫最早第4d即可出现因感染莱氏绿僵菌而死亡的个体，死亡初期，虫体表面覆盖一层薄薄菌丝，后期虫体瘪掉僵硬，未见孢子出现；高龄幼虫死亡时间相对较晚，死亡后24h长出致密白色菌丝覆盖虫体，48h后虫体表面布满浅绿色分生孢子，后期孢子颜色变深散落。图4为不同龄期草地贪夜蛾幼虫的感染症状图；A为低龄幼虫感染症状，B为4～5龄幼虫感染症状。鉴于此，选择4～5龄幼虫培养莱氏绿僵菌孢子。

图5为4～5龄幼虫扩大培养莱氏绿僵菌FJMR2孢子，待虫尸长满孢子粉且成散落状后即可收集大量孢子。

实施例3：FJMR2菌株对草地贪夜蛾蛹的致病性测定

1不同FJMR2孢子浓度对草地贪夜蛾蛹的致病力测定

采用实施例2的培养方法收集莱氏绿僵菌FJMR2孢子。将莱氏绿僵菌FJMR2孢子采用无菌质量百分含量为0.05％吐温-80的水溶液配制成浓度分别为3.00×10

表1 FJMR2不同孢子浓度下的草地贪夜蛾蛹羽化率和存活率

由表1的结果可知，不同浓度莱氏绿僵菌FJMR2孢子悬浮液对蛹均有致病力，蛹的羽化率和累积存活率均随孢子浓度增大而降低。接种12d后，孢子浓度为3.00×10

应用Probit模型，得到莱氏绿僵菌FJMR2对蛹的致病力回归方程y＝-4.406+0.753x，致死中浓度LC

2FJMR2对草地贪夜蛾不同日龄蛹的致死效果测定

选取大小一致、健康的1日龄、3日龄、5日龄草地贪夜蛾蛹采用浸渍法进行接种。将供试蛹置于浓度为3.00×10

表2莱氏绿僵菌FJMR2对不同时期蛹的羽化率和存活率的影响

由表2的结果可知，莱氏绿僵菌FJMR2对1日龄、3日龄、5日龄的草地贪夜蛾蛹均有一定的致病力。其中对1日龄的致病力最强，接菌第12d后的羽化率和存活率分别为22.67％和15.75％，显著高于3日龄和5日龄蛹。3日龄和5日龄蛹的羽化率和存活率差异不显著，羽化率范围38.06％-40.72％，存活率范围27.29-31.46％，均显著低于对照组。这些结果表明，菌株FJMR2能有效侵染草地贪夜蛾的蛹，且对不同日龄蛹均有效果。

实施例4：FJMR2对土壤中草地贪夜蛾蛹的侵染致病力试验

1不同土壤含菌量对草地贪夜蛾蛹的致死效果

将莱氏绿僵菌FJMR2孢子采用无菌质量百分含量为0.05％吐温-80的水溶液配制成浓度为3×10

分别在直径为8cm，高为8cm的塑料盒中加入适量相等的混合土，将15只蛹埋置距土表2cm左右处，盒盖具有通气控孔。将塑料盒置于26℃、相对湿度为70％、光周期16L:8D的人工气候箱中，模拟草地贪夜蛾蛹田间生存环境。试验期间按需向土中添加少量无菌水进行保湿，每处理3次重复，每重复15只蛹。第8天开始观察羽化成虫数量，直至连续观察至12日无羽化成虫，停止观察。

表3不同接种量下草地贪夜蛾蛹的羽化率和存活率

由表3的结果可知，蛹的羽化率和累积存活率均随混合土孢子浓度增大而降低，当混合土孢子含量达到1.0×10

2FJMR2不同处理时间对蛹的致死效果

采用无菌质量百分含量为0.05％吐温-80的水溶液将FJMR2孢子与土壤配成含菌量为1.00×10

表4 FJMR2不同接种时间对蛹的致死效果

由表4的结果可知，接菌后0d、3d和5d后再接蛹，蛹的羽化率和累积存活率均显著低于对照组。接菌当天后接蛹效果最显著，羽化率和存活率分别为35.00％和21.28％；其次为接菌3d后再接蛹，羽化率和存活率分别为43.33％和37.67％，与5d相比无显著差异，均显著低于对照组。

实施例5：FJMR2对草地贪夜蛾蛹的大田防效评价

防治试验在建瓯市东峰镇玉米地开展，土壤相对含水量35％左右。玉米处于拔节期，菌剂处理之前采用五点取样法调查虫口基数，每点选择3棵玉米，挖开玉米根际直径1～20cm范围内、距地表1～8cm深度内的土壤，调查土壤中蛹的数量。处理1，用清水将莱氏绿僵菌FJMR2孢子稀释至浓度2.00×10

表5 FJMR2田间试验校正防治结果

由表5的结果可知，3种浓度处理下，莱氏绿僵菌FJMR2对草地贪夜蛾蛹均有防治效果。浓度为2.00×10

上述实施例的结果可知，本发明提供的莱氏绿僵菌FJMR2对草地贪夜蛾蛹具有强致病力，可显著降低草地贪夜蛾蛹的羽化率，并对羽化后的成虫具有较高的致畸率和致死率，能有效控制草地贪夜蛾种群数量的增长。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所

<120> 一种莱氏绿僵菌及其在草地贪夜蛾蛹期的生物防治方法与应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 513

<212> DNA

<213> 莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)

<400> 1

atctggtccc cagggcccga gttgtaattt gcagaggatg cttttggcga gcgccttccg 60

agttccctgg aacgggacgc catagagggt gagagccccg tctggttgga tgccgagcct 120

ctgtaaagct ccttcgacga gtcgagtagt ttgggaatgc tgctctaaat gggaggtata 180

tgtcttctaa agctaaatac cggccagaga ccgatagcgc acaagtagag tgatcgaaag 240

atgaaaagca ctttgaaaag agggttaaat agtacgtgaa attgttgaaa gggaagcgct 300

tatgaccaga cttgggcccg gtgaatcatc cagcgttctc gctggtgcac tttgccgggc 360

tcaggccagc atcagtttgc cccgggggat aaaggctttg ggaatgtggc tccctcggga 420

gtgttatagc ccattgcaca ataccctggg gcggactgag gttcgcgcat ctgcaaggat 480

gctggcgtaa tggtcatcag cgacccgtct tga 513