一种羊栖菜多糖及寡糖的制备方法

技术领域

本发明涉及羊栖菜多糖技术领域，尤其涉及一种能溶于水的褐藻硫酸化羊栖菜多糖及寡糖的制备方法。

背景技术

海洋是地球上极为重要的组成部分，孕育了二十多万种生物，是一个独特的生态系统。因其特有的生态环境，产生了许多与陆地生物完全不同的结构新颖的生物活性物质，在很多领域都具有重要价值。目前，海洋已经成为最具开发潜力的领域之一。碳水化合物类是海洋中极为丰富的一类活性物质，又称糖类化合物，主要有单糖、低聚糖和多聚糖；近年来，由于海藻多聚糖在农业生产中具有独特的优势，关于多聚糖的研究逐渐增多，然而关于羊栖菜多糖的研究却鲜有报道。

发明内容

本发明的目的是，针对以上问题提供一种羊栖菜多糖及寡糖的制备方法，制备效率高。

为达到上述目的，本发明公开了一种羊栖菜多糖的制备方法，包括以下步骤：

A1、备料，准备以下重量份组分：干燥羊栖菜100份、纤维素酶1-3份、果胶酶1-3份、蛋白酶1-3份、褐藻酸裂解酶1-3份。

其中，在步骤A1中，所述干燥羊栖菜由羊栖菜烘干制成，干燥至含水量≤15%、磨碎，过60目筛。使羊栖菜呈粉末状，加大与酶的接触面积，有利于酶解。

羊栖菜，褐藻门，圆子纲，墨角藻目，马尾藻科，马尾藻属，羊栖菜。因其由于处于海洋中特有的生态环境，产生了许多与陆地生物完全不同的结构新颖的生物活性物质，如糖类化合物。

纤维素酶，是酶的一种，在分解纤维素时起生物催化作用，是可以将纤维素分解成多糖的蛋白质。

果胶酶，使细胞间的果胶酶质降解,把细胞从组织内分离出来。

蛋白酶，细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。

褐藻酸裂解酶，将多糖分解成寡糖。

A2、酶解，在干燥羊栖菜中加入纤维素酶、果胶酶、蛋白酶及水，干燥羊栖菜、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶与水之间的料液比为1：30-50，于50-60℃、PH 6.0-8.0下酶解60-180min；

在酶解过程中，果胶酶与蛋白酶相配合，将羊栖菜的细胞分离，然后在纤维素酶的作用下，羊栖菜细胞中的纤维素被分解成多糖。

A21、为了验证纤维素酶、果胶酶及蛋白酶对酶解产物多糖提取率的影响，通过单因素试验测定，在不同纤维素酶、果胶酶及蛋白酶添加量下酶解产物的多糖提取率。

具体的，将1克干燥羊栖菜加入50 mL的离心管中进行试验，在其中两种酶添加量、温度、PH值及酶解时间保持一致的情况下，第三种酶采用不同的添加量。

测定纤维素酶影响时，添加纤维素酶1份、2份或3份，果胶酶2份，蛋白酶2份，于55℃、PH 6.0下酶解120 min。

测定果胶酶影响时，添加纤维素酶2份，果胶酶1份、2份或3份，蛋白酶2份，于55℃、PH 6.0下酶解120 min。

测定蛋白酶影响时，添加纤维素酶2份，果胶酶2份，蛋白酶1份、2份或3份，于55℃、PH 6.0下酶解120 min。

酶解完成后，在3000-5000转速下离心4-6 min，提取上清液测定多糖含量，计算提取率，提取率的公式为多糖质量/干燥羊栖菜质量。优选的，转速可以选择3000转/min、4000转/min或5000转/min；离心时间选择4 min、5 min或6 min。

A22、为了验证酶添加比、温度、PH值及酶解时间对酶解产物多糖提取率的影响，通过单因素试验测定，在不同酶添加比、温度、PH值及酶解时间下酶解产物的多糖提取率。

具体的，将1克干燥羊栖菜加入50 mL的离心管中，在酶添加比、温度、PH值及酶解时间其中三种因素保持一致的情况下，第四种因素采用不同的值。

测定酶添加比影响时，添加纤维素酶2份、果胶酶3份、蛋白酶1份，或纤维素酶1份、果胶酶2份、蛋白酶3份，或纤维素酶3份、果胶酶1份、蛋白酶2份，于55℃、PH 6.0下酶解120min。

测定温度影响时，添加纤维素酶2份、果胶酶3份、蛋白酶1份，于50或55或60℃、PH6.0下酶解120 min。

测定PH值影响时，添加纤维素酶2份、果胶酶3份、蛋白酶1份，于55℃、PH 6.0或6.0或6.0下酶解120 min。

测定酶解时间影响时，添加纤维素酶2份、果胶酶3份、蛋白酶1份，于55℃、PH 6.0下酶解60或120或180 min。

酶解完成后，在3000-5000转速下离心4-6 min，提取上清液测定多糖含量，计算提取率，提取率的公式为多糖质量/干燥羊栖菜质量。优选的，转速可以选择3000转/min、4000转/min或5000转/min；离心时间选择4 min、5 min或6 min。

A23、为了验证酶添加比、温度、PH值及酶解时间对酶解产物多糖提取率的影响，通过正交试验测定，在不同酶添加比、温度、PH值及酶解时间下酶解产物的多糖提取率。

其中酶添加比为：纤维素酶2份、果胶酶2份、蛋白酶1份，或纤维素酶1份、果胶酶3份、蛋白酶2份，或纤维素酶3份、果胶酶1份、蛋白酶3份；

其中温度为：50或55或60℃；

其中PH值为：6.0或6.0或6.0；

其中酶解时间为：60或120或180 min。

单因素试验或正交试验各重复至少3次，结果取平均值，保证结果准确。

A3、提取，提取羊栖菜多糖提取液。

具体的，步骤A2的产物在3000-5000转/min转速下离心4-6 min，提取上清液作为羊栖菜多糖提取液。选优的，转速可以选择3000转/min、4000转/min或5000转/min；离心时间选择4 min、5 min或6 min。

一种羊栖菜寡糖的制备方法，包括以下步骤：

B1、二次酶解，在上述制备方法的产物中加入褐藻酸裂解酶，于50-60℃、PH 6.0-8.0下酶解60-180min，获得羊栖菜寡糖降解液。

在二次酶解过程中，在褐藻酸裂解酶的作用下，羊栖菜多糖提取液中的多糖被分解成寡糖。

B2、冻干，将步骤B1的产物加入冻干机，干燥至含水量≤15%。方便保存和运输。

综上所述，本发明的有益效果在于：采用复合酶解的工艺制备羊栖菜多糖，制备效率高，成本低。

附图说明

图1是本发明一种羊栖菜多糖的制备方法步骤A21中单因素试验测定在不同纤维素酶、果胶酶及蛋白酶添加量下酶解产物的多糖提取率（55℃、PH 6.0下，酶解120 min）；

图2是本发明一种羊栖菜多糖的制备方法步骤A21中单因素试验测定在不同纤维素酶、果胶酶及蛋白酶添加量下酶解产物的多糖提取率的柱状图（55℃、PH 6.0下，酶解120min）；

图3是本发明一种羊栖菜多糖的制备方法步骤A22中单因素试验测定在不同酶添加比、温度、PH值及酶解时间下酶解产物的多糖提取率；

图4是本发明一种羊栖菜多糖的制备方法步骤A22中单因素试验测定在不同酶添加比、温度、PH值及酶解时间下酶解产物的多糖提取率的柱状图；

图5是本发明一种羊栖菜多糖的制备方法步骤A23中正交试验测定在不同酶添加比、温度、PH值及酶解时间下酶解产物的多糖提取率。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明：

一种羊栖菜多糖的制备方法，包括以下步骤：

A1、备料，准备以下重量份组分：干燥羊栖菜100份、纤维素酶1-3份、果胶酶1-3份、蛋白酶1-3份、褐藻酸裂解酶1-3份。

其中，在步骤A1中，所述干燥羊栖菜由羊栖菜烘干制成，干燥至含水量≤15%、磨碎，过60目筛。使羊栖菜呈粉末状，加大与酶的接触面积，有利于酶解。

羊栖菜，褐藻门，圆子纲，墨角藻目，马尾藻科，马尾藻属，羊栖菜。因其由于处于海洋中特有的生态环境，产生了许多与陆地生物完全不同的结构新颖的生物活性物质，如糖类化合物。

纤维素酶，是酶的一种，在分解纤维素时起生物催化作用，是可以将纤维素分解成多糖的蛋白质。

果胶酶，使细胞间的果胶酶质降解,把细胞从组织内分离出来。

蛋白酶，细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。

褐藻酸裂解酶，将多糖分解成寡糖。

A2、酶解，在干燥羊栖菜中加入纤维素酶、果胶酶、蛋白酶及水，干燥羊栖菜、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶与水之间的料液比为1：30-50，于50-60℃、PH 6.0-8.0下酶解60-180min；

在酶解过程中，果胶酶与蛋白酶相配合，将羊栖菜的细胞分离，然后在纤维素酶的作用下，羊栖菜细胞中的纤维素被分解成多糖。

A21、为了验证纤维素酶、果胶酶及蛋白酶对酶解产物多糖提取率的影响，通过单因素试验测定，在不同纤维素酶、果胶酶及蛋白酶添加量下酶解产物的多糖提取率。

具体的，将1克干燥羊栖菜加入50 mL的离心管中进行试验，在其中两种酶添加量、温度、PH值及酶解时间保持一致的情况下，第三种酶采用不同的添加量。

测定纤维素酶影响时，添加纤维素酶1份、2份或3份，果胶酶2份，蛋白酶2份，于55℃、PH 6.0下酶解120 min。

测定果胶酶影响时，添加纤维素酶2份，果胶酶1份、2份或3份，蛋白酶2份，于55℃、PH 6.0下酶解120 min。

测定蛋白酶影响时，添加纤维素酶2份，果胶酶2份，蛋白酶1份、2份或3份，于55℃、PH 6.0下酶解120 min。

酶解完成后，在3000-5000转/min转速下离心4-6 min，提取上清液测定多糖含量，计算提取率，提取率的公式为多糖质量/干燥羊栖菜质量。优选的，转速可以选择3000转/min、4000转/min或5000转/min；离心时间选择4 min、5 min或6 min。

A22、为了验证酶添加比、温度、PH值及酶解时间对酶解产物多糖提取率的影响，通过单因素试验测定，在不同酶添加比、温度、PH值及酶解时间下酶解产物的多糖提取率。

具体的，将1克干燥羊栖菜加入50 mL的离心管中，在酶添加比、温度、PH值及酶解时间其中三种因素保持一致的情况下，第四种因素采用不同的值。

测定酶添加比影响时，添加纤维素酶2份、果胶酶3份、蛋白酶1份，或纤维素酶1份、果胶酶2份、蛋白酶3份，或纤维素酶3份、果胶酶1份、蛋白酶2份，于55℃、PH 6.0下酶解120min。

测定温度影响时，添加纤维素酶2份、果胶酶3份、蛋白酶1份，于50或55或60℃、PH6.0下酶解120 min。

测定PH值影响时，添加纤维素酶2份、果胶酶3份、蛋白酶1份，于55℃、PH 6.0或6.0或6.0下酶解120 min。

测定酶解时间影响时，添加纤维素酶2份、果胶酶3份、蛋白酶1份，于55℃、PH 6.0下酶解60或120或180 min。

酶解完成后，在3000-5000转速下离心4-6 min，提取上清液测定多糖含量，计算提取率，提取率的公式为多糖质量/干燥羊栖菜质量。优选的，转速可以选择3000转/min、4000转/min或5000转/min；离心时间选择4 min、5 min或6 min。

A23、为了验证酶添加比、温度、PH值及酶解时间对酶解产物多糖提取率的影响，通过正交试验测定，在不同酶添加比、温度、PH值及酶解时间下酶解产物的多糖提取率。

其中酶添加比为：纤维素酶2份、果胶酶2份、蛋白酶1份，或纤维素酶1份、果胶酶3份、蛋白酶2份，或纤维素酶3份、果胶酶1份、蛋白酶3份；

其中温度为：50或55或60℃；

其中PH值为：6.0或6.0或6.0；

其中酶解时间为：60或120或180 min。

单因素试验或正交试验各重复至少3次，结果取平均值，保证结果准确。

A3、提取，提取羊栖菜多糖提取液。

具体的，步骤A2的产物在3000-5000转速下离心4-6 min，提取上清液作为羊栖菜多糖提取液。选优的，转速可以选择3000转/min、4000转/min或5000转/min；离心时间选择4min、5 min或6 min。

一种羊栖菜寡糖的制备方法，包括以下步骤：

B1、二次酶解，在上述制备方法的产物中加入褐藻酸裂解酶，于50-60℃、PH 6.0-8.0下酶解60-180min，获得羊栖菜寡糖降解液。

在二次酶解过程中，在褐藻酸裂解酶的作用下，羊栖菜多糖提取液中的多糖被分解成寡糖。

B2、冻干，将步骤B1的产物加入冻干机，干燥至含水量≤15%。方便保存和运输。

具体的，实施例1：测定纤维素酶影响时，添加纤维素酶1份，果胶酶2份，蛋白酶2份，于55℃、PH 6.0下酶解120 min。

具体的，实施例2：测定纤维素酶影响时，添加纤维素酶2份，果胶酶2份，蛋白酶2份，于55℃、PH 6.0下酶解120 min。

具体的，实施例3：测定纤维素酶影响时，添加纤维素酶3份，果胶酶2份，蛋白酶2份，于55℃、PH 6.0下酶解120 min。

具体的，实施例4：测定果胶酶影响时，添加纤维素酶2份，果胶酶1份，蛋白酶2份，于55℃、PH 6.0下酶解120 min。

具体的，实施例5：测定果胶酶影响时，添加纤维素酶2份，果胶酶2份，蛋白酶2份，于55℃、PH 6.0下酶解120 min。

具体的，实施例6：测定果胶酶影响时，添加纤维素酶2份，果胶酶3份，蛋白酶2份，于55℃、PH 6.0下酶解120 min。

具体的，实施例7：测定蛋白酶影响时，添加纤维素酶2份，果胶酶2份，蛋白酶1份，于55℃、PH 6.0下酶解120 min。

具体的，实施例8：测定蛋白酶影响时，添加纤维素酶2份，果胶酶2份，蛋白酶2份，于55℃、PH 6.0下酶解120 min。

具体的，实施例9：测定蛋白酶影响时，添加纤维素酶2份，果胶酶2份，蛋白酶3份，于55℃、PH6.0下酶解120 min。

测试结果如图1所示，单因素试验条件下，添加纤维素酶2份时，提取率最高；添加果胶酶3份时，提取率最高；添加蛋白酶1份时，提取率最高。

具体的，实施例10：添加纤维素酶2份、果胶酶3份、蛋白酶1份，于55℃、PH6.0下酶解120 min。

具体的，实施例11：添加纤维素酶1份、果胶酶2份、蛋白酶3份，于55℃、PH6.0下酶解120 min。

具体的，实施例12：添加纤维素酶3份、果胶酶1份、蛋白酶2份，于55℃、PH6.0下酶解120 min。

具体的，实施例13：测定温度影响时，添加纤维素酶2份、果胶酶3份、蛋白酶1份，于50℃、PH6.0下酶解120 min。

具体的，实施例14：测定温度影响时，添加纤维素酶2份、果胶酶3份、蛋白酶1份，于55℃、PH6.0下酶解120 min。

具体的，实施例15：测定温度影响时，添加纤维素酶2份、果胶酶3份、蛋白酶1份，于60℃、PH6.0下酶解120 min。

具体的，实施例16：测定PH值影响时，添加纤维素酶2份、果胶酶3份、蛋白酶1份，于55℃、PH6.0下酶解120 min。

具体的，实施例17：测定PH值影响时，添加纤维素酶2份、果胶酶3份、蛋白酶1份，于55℃、PH 6.0下酶解120 min。

具体的，实施例18：测定PH值影响时，添加纤维素酶2份、果胶酶3份、蛋白酶1份，于55℃、PH 6.0下酶解120 min。

具体的，实施例19：测定酶解时间影响时，添加纤维素酶2份、果胶酶3份、蛋白酶1份，于55℃、PH 6.0下酶解60 min。

具体的，实施例20：测定酶解时间影响时，添加纤维素酶2份、果胶酶3份、蛋白酶1份，于55℃、PH 6.0下酶解120 min。

具体的，实施例21：测定酶解时间影响时，添加纤维素酶2份、果胶酶3份、蛋白酶1份，于55℃、PH 6.0下酶解180 min。

测试结果如图2所示，单因素试验条件下，酶添加比为2:3:1时，提取率最高；温度为55℃时，提取率最高；PH 值为6.0时，提取率最高；酶解时间为120 min时，提取率最高。

就正交试验水平及因素进行说明。

1：酶添加比为2:3:1、50℃、PH 6.0、酶解60 min；

2：酶添加比为1:2:3、55℃、PH 6.0、酶解120 min；

3：酶添加比为3:1:2、60℃、PH 6.0、酶解180 min。

测试结果如图3所示。

由正交试验结果可知，四个因素对羊栖菜多糖提取效率的影响顺序为:提取时间>PH >温度>酶量比。其中，酶量比的三个均值中k3最大，同理得出提取时间k3、温度k1和PHk2的均值最大。所以，羊栖菜多糖的最佳提取工艺为：酶量比为纤维素酶：果胶酶：木瓜蛋白酶2:3:1，提取时间180 min，温度50℃，PH为6.0。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本发明的保护范围。