一种泪沟眼周塌陷自体修复复配液制备方法

技术领域

本发明涉及医疗美容技术领域，具体而言，涉及一种泪沟眼周塌陷自体修复复配液制备方法。

背景技术

胶原蛋白是一类生物高分子，动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％～30％，某些生物体甚至高达80％以上。随着年龄的不断增加，人体的胶原蛋白会不断流失，胶原蛋白新合成的速度低于胶原蛋白流失或分解的速度，使得人们的皮肤出现各种问题，如皮肤松弛、粗糙、干燥、无光泽并且逐渐出现皱纹。因此，绝大部分人都在追求皮肤的年轻化，使自己看上去更加年轻。

目前，市面上有很多延缓衰老，对抗皮肤老化的产品，但一般效果甚微。补充胶原蛋白是目前较为时尚的对抗皮肤衰老、胶原蛋白流失的方法，但如何补充却成了较大的问题，同时由于市面上各类产品纷繁复杂，人们也难以寻到一种可靠的、吸收效率高、没有毒副作用的胶原蛋白补充方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种泪沟眼周塌陷自体修复复配液制备方法，此制备方法将自体成纤维细胞分类处理后，得到的自体胶原蛋白吸收率高，可用于医疗美容领域。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本申请实施例提供一种泪沟眼周塌陷自体修复复配液制备方法，包括如下步骤：(1)收集成纤维细胞，低速离心后分离上清一和沉淀一；(2)向沉淀一中加入细胞裂解液，充分裂解后低温离心，收集上清二和沉淀二，将沉淀二利用蛋白酶酶解，终止酶解后高速离心取上清，得到上清三；(3)合并上清一、上清二和上清三，得到上清液，将上清液经超高速离心后收集沉淀三；(4)将沉淀二、透明质酸溶液将沉淀二和沉淀三制成冻干粉，按照重量比8～10:1混合，即得到所述自体胶原蛋白。

综上，相对于现有技术，本发明的实施例至少具有如下优点或有益效果：

本发明提供的泪沟眼周塌陷自体修复复配液制备方法，通过将自体成纤维细胞分类处理，并经酶解、离心等方法充分提取其中的胶原蛋白和各类有益因子，使最终制得的自体胶原蛋白吸收率高，能改善皮肤老化问题，以便在医疗美容领域使用。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本申请实施例提供一种泪沟眼周塌陷自体修复复配液制备方法，包括如下步骤：(1)收集成纤维细胞，低速离心后分离上清一和沉淀一；(2)向沉淀一中加入细胞裂解液，充分裂解后低温离心，收集上清二和沉淀二，将沉淀二利用蛋白酶酶解，终止酶解后高速离心取上清，得到上清三；(3)合并上清一、上清二和上清三，得到上清液，将上清液经超高速离心后收集沉淀三；(4)将沉淀二、透明质酸溶液将沉淀二和沉淀三制成冻干粉，按照重量比8～10:1混合，即得到所述自体胶原蛋白。

在本发明的一些实施例中，上述制备方法，所述成纤维细胞通过如下方式制备而成：收集皮肤标本，洗净后剪碎，得到组织块；将组织块置于双抗培养基中，培养至组织块周围爬出原代纤维细胞，待原代纤维细胞汇合度达到85％以上；取出组织块，将原代纤维细胞按1:3传代，即得到所述成纤维细胞。

在本发明的一些实施例中，上述制备方法，所述低温离心的温度为4℃以下，所述低温离心力为1500～2000g，所述低温离心的时间为8～10min。

在本发明的一些实施例中，上述制备方法，所述低温离心力为2000g，所述低温离心的时间为8min。

在本发明的一些实施例中，上述制备方法，所述高速离心的离心力为15000g及以上，离心时间为20～40min。

在本发明的一些实施例中，上述制备方法，所述高速离心的离心力为15000g，离心时间为20min。

在本发明的一些实施例中，上述制备方法，所述酶解时所用的蛋白酶包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，所述胰蛋白酶的质量百分数为1.2～1.6％，所述胰凝乳蛋白酶的质量百分数为0.2～0.8％；所述酶解的时间为2～3h，所述酶解的温度为45～50℃。

在本发明的一些实施例中，上述制备方法，所述超高速离心的离心力为140000g及以上，离心时间为2h～3h。

在本发明的一些实施例中，上述制备方法，所述超高速离心的离心力为150000g以上，离心时间为2h。

在本发明的一些实施例中，上述制备方法，所述沉淀二和沉淀三的重量比为9:1。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例的目的在于提供一种泪沟眼周塌陷自体修复复配液制备方法，包括如下步骤：

(1)签署同意书后收集自体皮肤标本，皮肤标本厚2～3mm，直径4～5mm，洗净后剪碎，得到组织块；

(2)将组织块置于双抗培养基中，培养至组织块周围爬出原代纤维细胞；

(3)待原代纤维细胞汇合度达到85％以上，取出组织块，将原代纤维细胞按1:3传代，即得到所述成纤维细胞；

(4)将步骤(3)中得到的成纤维细胞传代培养至所需要的量，将培养基上清收集起来，得到上清一，将成纤维细胞沉淀用0.025％的胰蛋白酶消化后置于无菌离心管中，于4℃下，1000g离心5min，分离得到细胞沉淀，即为沉淀一；

(5)将步骤(4)中得到的沉淀一利用细胞裂解液重悬裂解，充分裂解后低速离心，即温度在4℃以下为优，得到上清二和沉淀二，低温离心力为1500g，低温离心的时间为8min；

(6)将沉淀二利用蛋白酶酶解，酶解液为胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混合酶解液，其中胰蛋白酶的质量百分数为1.2％，胰凝乳蛋白酶的质量百分数为0.6％，于47℃酶解2.5h后终止酶解，将酶解液经高速离心去除未酶解的部分，高速离心的离心力为15000g，离心时间为20min，离心完成后收集得到上清液并过20kDa，收集滤液即上清三；

(7)合并上清一、上清二和上清三，得到上清液，将上清液经超高速离心后收集沉淀三，超高速离心的离心力为140000g，离心时间为2h；

(8)将沉淀二和沉淀三按重量比8:1混合，即得到所述自体胶原蛋白。

实施例2

本实施例的目的在于提供一种泪沟眼周塌陷自体修复复配液制备方法，包括如下步骤：

(1)签署同意书后收集自体皮肤标本，皮肤标本厚2～3mm，直径4～5mm，洗净后剪碎，得到组织块；

(2)将组织块置于双抗培养基中，培养至组织块周围爬出原代纤维细胞；

(3)待原代纤维细胞汇合度达到85％以上，取出组织块，将原代纤维细胞按1:3传代，即得到所述成纤维细胞；

(4)将步骤(3)中得到的成纤维细胞传代培养至所需要的量，将培养基上清收集起来，得到上清一，将成纤维细胞沉淀用0.025％的胰蛋白酶消化后置于无菌离心管中，于4℃下，1000g离心5min，分离得到细胞沉淀，即为沉淀一；

(5)将步骤(4)中得到的沉淀一利用细胞裂解液重悬裂解，充分裂解后低速离心，即温度在4℃以下为优，得到上清二和沉淀二，低温离心力为1600g，低温离心的时间为8min；

(6)将沉淀二利用蛋白酶酶解，酶解液为胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混合酶解液，其中胰蛋白酶的质量百分数为1.3％，胰凝乳蛋白酶的质量百分数为0.5％，于48℃酶解2.5h后终止酶解，将酶解液经高速离心去除未酶解的部分，高速离心的离心力为15000g，离心时间为30min，离心完成后收集得到上清液并过20kDa，收集滤液即上清三；

(7)合并上清一、上清二和上清三，得到上清液，将上清液经超高速离心后收集沉淀三，超高速离心的离心力为150000g，离心时间为2h；

(8)将沉淀二和沉淀三按重量比9:1混合，即得到所述自体胶原蛋白。

实施例3

本实施例的目的在于提供一种泪沟眼周塌陷自体修复复配液制备方法，包括如下步骤：

(1)签署同意书后收集自体皮肤标本，皮肤标本厚2～3mm，直径4～5mm，洗净后剪碎，得到组织块；

(2)将组织块置于双抗培养基中，培养至组织块周围爬出原代纤维细胞；

(3)待原代纤维细胞汇合度达到85％以上，取出组织块，将原代纤维细胞按1:3传代，即得到所述成纤维细胞；

(4)将步骤(3)中得到的成纤维细胞传代培养至所需要的量，将培养基上清收集起来，得到上清一，将成纤维细胞沉淀用0.025％的胰蛋白酶消化后置于无菌离心管中，于4℃下，1000g离心5min，分离得到细胞沉淀，即为沉淀一；

(5)将步骤(4)中得到的沉淀一利用细胞裂解液重悬裂解，充分裂解后低速离心，即温度在4℃以下为优，得到上清二和沉淀二，低温离心力为1800g，低温离心的时间为9min；

(6)将沉淀二利用蛋白酶酶解，酶解液为胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混合酶解液，其中胰蛋白酶的质量百分数为1.4％，胰凝乳蛋白酶的质量百分数为0.4％，于45℃酶解2.5h后终止酶解，将酶解液经高速离心去除未酶解的部分，高速离心的离心力为15000g，离心时间为40min，离心完成后收集得到上清液并过20kDa，收集滤液即上清三；

(7)合并上清一、上清二和上清三，得到上清液，将上清液经超高速离心后收集沉淀三，超高速离心的离心力为160000g，离心时间为2h；

(8)将沉淀二和沉淀三按重量比10:1混合，即得到所述自体胶原蛋白。

实施例4

本实施例的目的在于提供一种泪沟眼周塌陷自体修复复配液制备方法，包括如下步骤：

(1)签署同意书后收集自体皮肤标本，皮肤标本厚2～3mm，直径4～5mm，洗净后剪碎，得到组织块；

(2)将组织块置于双抗培养基中，培养至组织块周围爬出原代纤维细胞；

(3)待原代纤维细胞汇合度达到85％以上，取出组织块，将原代纤维细胞按1:3传代，即得到所述成纤维细胞；

(4)将步骤(3)中得到的成纤维细胞传代培养至所需要的量，将培养基上清收集起来，得到上清一，将成纤维细胞沉淀用0.025％的胰蛋白酶消化后置于无菌离心管中，于4℃下，1000g离心5min，分离得到细胞沉淀，即为沉淀一；

(5)将步骤(4)中得到的沉淀一利用细胞裂解液重悬裂解，充分裂解后低速离心，即温度在4℃以下为优，得到上清二和沉淀二，低温离心力为2000g，低温离心的时间为8min；

(6)将沉淀二利用蛋白酶酶解，酶解液为胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混合酶解液，其中胰蛋白酶的质量百分数为1.5％，胰凝乳蛋白酶的质量百分数为0.3％，于47℃酶解2.5h后终止酶解，将酶解液经高速离心去除未酶解的部分，高速离心的离心力为16000g，离心时间为20min，离心完成后收集得到上清液并过20kDa，收集滤液即上清三；

(7)合并上清一、上清二和上清三，得到上清液，将上清液经超高速离心后收集沉淀三，超高速离心的离心力为145000g，离心时间为2.5h；

(8)将沉淀二和沉淀三按重量比8:1混合，即得到所述自体胶原蛋白。

实施例5

本实施例的目的在于提供一种泪沟眼周塌陷自体修复复配液制备方法，包括如下步骤：

(1)签署同意书后收集自体皮肤标本，皮肤标本厚2～3mm，直径4～5mm，洗净后剪碎，得到组织块；

(2)将组织块置于双抗培养基中，培养至组织块周围爬出原代纤维细胞；

(3)待原代纤维细胞汇合度达到85％以上，取出组织块，将原代纤维细胞按1:3传代，即得到所述成纤维细胞；

(4)将步骤(3)中得到的成纤维细胞传代培养至所需要的量，将培养基上清收集起来，得到上清一，将成纤维细胞沉淀用0.025％的胰蛋白酶消化后置于无菌离心管中，于4℃下，1000g离心5min，分离得到细胞沉淀，即为沉淀一；

(5)将步骤(4)中得到的沉淀一利用细胞裂解液重悬裂解，充分裂解后低速离心，即温度在4℃以下为优，得到上清二和沉淀二，低温离心力为1500g，低温离心的时间为10min；

(6)将沉淀二利用蛋白酶酶解，酶解液为胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混合酶解液，其中胰蛋白酶的质量百分数为1.6％，胰凝乳蛋白酶的质量百分数为0.2％，于46℃酶解2.5h后终止酶解，将酶解液经高速离心去除未酶解的部分，高速离心的离心力为16000g，离心时间为20min，离心完成后收集得到上清液并过20kDa，收集滤液即上清三；

(7)合并上清一、上清二和上清三，得到上清液，将上清液经超高速离心后收集沉淀三，超高速离心的离心力为150000g，离心时间为3h；

(8)将沉淀二和沉淀三按重量比9:1混合，即得到所述自体胶原蛋白。

实施例6

本实施例的目的在于提供一种泪沟眼周塌陷自体修复复配液制备方法，包括如下步骤：

(1)签署同意书后收集自体皮肤标本，皮肤标本厚2～3mm，直径4～5mm，洗净后剪碎，得到组织块；

(2)将组织块置于双抗培养基中，培养至组织块周围爬出原代纤维细胞；

(3)待原代纤维细胞汇合度达到85％以上，取出组织块，将原代纤维细胞按1:3传代，即得到所述成纤维细胞；

(4)将步骤(3)中得到的成纤维细胞传代培养至所需要的量，将培养基上清收集起来，得到上清一，将成纤维细胞沉淀用0.025％的胰蛋白酶消化后置于无菌离心管中，于4℃下，1000g离心5min，分离得到细胞沉淀，即为沉淀一；

(5)将步骤(4)中得到的沉淀一利用细胞裂解液重悬裂解，充分裂解后低速离心，即温度在4℃以下为优，得到上清二和沉淀二，低温离心力为1600g，低温离心的时间为10min；

(6)将沉淀二利用蛋白酶酶解，酶解液为胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混合酶解液，其中胰蛋白酶的质量百分数为1.2％，胰凝乳蛋白酶的质量百分数为0.7％，于50℃酶解3h后终止酶解，将酶解液经高速离心去除未酶解的部分，高速离心的离心力为16000g，离心时间为20min，离心完成后收集得到上清液并过20kDa，收集滤液即上清三；

(7)合并上清一、上清二和上清三，得到上清液，将上清液经超高速离心后收集沉淀三，超高速离心的离心力为140000g，离心时间为3h；

(8)将沉淀二和沉淀三按重量比9:1混合，即得到所述自体胶原蛋白。

实施例7

本实施例的目的在于提供一种泪沟眼周塌陷自体修复复配液制备方法，包括如下步骤：

(1)签署同意书后收集自体皮肤标本，皮肤标本厚2～3mm，直径4～5mm，洗净后剪碎，得到组织块；

(2)将组织块置于双抗培养基中，培养至组织块周围爬出原代纤维细胞；

(3)待原代纤维细胞汇合度达到85％以上，取出组织块，将原代纤维细胞按1:3传代，即得到所述成纤维细胞；

(4)将步骤(3)中得到的成纤维细胞传代培养至所需要的量，将培养基上清收集起来，得到上清一，将成纤维细胞沉淀用0.025％的胰蛋白酶消化后置于无菌离心管中，于4℃下，1000g离心5min，分离得到细胞沉淀，即为沉淀一；

(5)将步骤(4)中得到的沉淀一利用细胞裂解液重悬裂解，充分裂解后低速离心，即温度在4℃以下为优，得到上清二和沉淀二，低温离心力为1500g，低温离心的时间为10min；

(6)将沉淀二利用蛋白酶酶解，酶解液为胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混合酶解液，其中胰蛋白酶的质量百分数为1.2％，胰凝乳蛋白酶的质量百分数为0.8％，于48℃酶解2h后终止酶解，将酶解液经高速离心去除未酶解的部分，高速离心的离心力为16000g，离心时间为30min，离心完成后收集得到上清液并过20kDa，收集滤液即上清三；

(7)合并上清一、上清二和上清三，得到上清液，将上清液经超高速离心后收集沉淀三，超高速离心的离心力为140000g，离心时间为2.5h；

(8)将沉淀二和沉淀三按重量比9:1混合，即得到所述自体胶原蛋白。

实施例8

本实施例的目的在于提供一种泪沟眼周塌陷自体修复复配液制备方法，包括如下步骤：

(1)签署同意书后收集自体皮肤标本，皮肤标本厚2～3mm，直径4～5mm，洗净后剪碎，得到组织块；

(2)将组织块置于双抗培养基中，培养至组织块周围爬出原代纤维细胞；

(3)待原代纤维细胞汇合度达到85％以上，取出组织块，将原代纤维细胞按1:3传代，即得到所述成纤维细胞；

(4)将步骤(3)中得到的成纤维细胞传代培养至所需要的量，将培养基上清收集起来，得到上清一，将成纤维细胞沉淀用0.025％的胰蛋白酶消化后置于无菌离心管中，于4℃下，1000g离心5min，分离得到细胞沉淀，即为沉淀一；

(5)将步骤(4)中得到的沉淀一利用细胞裂解液重悬裂解，充分裂解后低速离心，即温度在4℃以下为优，得到上清二和沉淀二，低温离心力为1500g，低温离心的时间为8min；

(6)将沉淀二利用蛋白酶酶解，酶解液为胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混合酶解液，其中胰蛋白酶的质量百分数为1.2％，胰凝乳蛋白酶的质量百分数为0.4％，于45℃酶解2h后终止酶解，将酶解液经高速离心去除未酶解的部分，高速离心的离心力为15000g，离心时间为20min，离心完成后收集得到上清液并过20kDa，收集滤液即上清三；

(7)合并上清一、上清二和上清三，得到上清液，将上清液经超高速离心后收集沉淀三，超高速离心的离心力为140000g，离心时间为2.5h；

(8)将沉淀二和沉淀三按重量比9:1混合，即得到所述自体胶原蛋白。

整体而言，本发明实施例以实施例2和5中提供的泪沟眼周塌陷自体修复复配液制备方法制得的自体胶原蛋白的吸收率最高，且无排斥反应，其他实施例中的自体胶原蛋白的吸收率次之，但排斥反应率低于千分之二。

效果例

本效果例的目的在于验证实施例1～8制备的泪沟眼周塌陷自体修复复配液的性能。

以实施例1～8提供的制备的泪沟眼周塌陷自体修复复配液配合相应的辅料制备护肤组合物，总计8组，测定前述护肤组合物经皮的渗透量，相对渗透量为渗透量与涂抹量的比值。实验结果如表1所示。

由表1可知，实施例2和5中特定参数制备的泪沟眼周塌陷自体修复复配液的渗透性优于其他实施例。

综上所述，本发明实施例的提供的泪沟眼周塌陷自体修复复配液制备方法，通过将自体成纤维细胞分类处理，分别收集了细胞培养过程中的培养基、细胞裂解后的裂解蛋白、以及裂解后的经酶解、离心等得到的有益成分，再将前述成分通过有效的分离方法除去杂质，充分提取其中的胶原蛋白和各类有益因子，使最终制得的自体胶原蛋白吸收率高，能改善皮肤老化问题，以便在医疗美容领域使用。本发明实施例的提供的泪沟眼周塌陷自体修复复配液制备方法制备的泪沟眼周塌陷自体修复复配液，既可以搭配微针用于注射，也可以配以常用的化妆品或护肤品辅料用于外用。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。