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调节Septin2巯基亚硝基化修饰水平的制药用途

文献发布时间：2023-06-19 11:49:09

技术领域

本发明属于主动脉瘤和主动脉夹层的分子生物学诊断领域，具体涉及调节Septin2巯基亚硝基化修饰水平的制药用途。

背景技术

主动脉瘤和主动脉夹层(AAD)是一种威胁生命的疾病，在主动脉破裂的情况下死亡率极高。在过去的20年中，AAD的开放式外科手术和动脉瘤腔内修复术取得了重大进展。但是，仍然缺少药物疗法，因此，AAD形成和发展所涉及的分子和细胞机制亟待探索。AAD的主要病理特征为血管平滑肌细胞的丧失以及炎症细胞的积累和活化导致的细胞外基质重塑。炎症反应在AAD中起着至关重要的作用，并且在很大程度上影响着主动脉壁重塑的许多决定因素。巨噬细胞介导的炎症反应在血管重塑及AAD中发挥重要作用。蛋白质巯基亚硝基化修饰过程大致为NO基团与蛋白质半胱氨酸连接的自由巯基-SH反应生成亚硝基-SNO(S-nitrosylation)。蛋白质巯基亚硝基化修饰作为一种新的蛋白质翻译后修饰，可以调节蛋白质的结构和功能，并参与氧化还原信号转导的调控。巨噬细胞产生的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)是蛋白质巯基亚硝基化修饰的主要来源，并可能通过此途径调控巨噬细胞各项功能，包括炎症因子的分泌以及一些重要酶类的活性等。

Septins是一组GTP结合蛋白，在除植物外的所有真核细胞中表达。不同的Septins彼此形成蛋白复合物。这些复合物可以进一步组装成细丝、环状和网纹结构。在酵母细胞中，它们将细胞的某些部分分隔开，在细胞分裂时在隔片处搭建支架，提供结构支撑，它们的名字也由此而来。对人类细胞的研究表明，Septins可在致病细菌周围建立笼状结构，从而固定并阻止入侵其他细胞。在人类中，Septins通过募集其他蛋白质或充当扩散屏障的能力而参与胞质分裂，纤毛形成和神经发生。Septin 2是在许多细胞类型中表达的Septin蛋白家族的成员。Septins组成一个独特的非典型细胞骨架。它们在体内的聚合导致了各种高阶结构的形成，如环和笼状网络，其中Septin2与Septin6和Septin7特异性结合。Septin2还通过被称为多基域的保守的N末端延伸碱性残基与细胞膜中的磷酸肌醇类蛋白(PIPs)结合。由于细胞膜中的Septins可以创建一个扩散屏障，它们可能在内皮细胞中起到类似的作用，以分离蛋白酶传递到内皮下的系统，从而重塑内皮细胞外基质。其主要分布在细胞质和和细胞膜上，和细胞骨架蛋白有共定位，近期研究表明其可以稳定细胞骨架，促进上皮细胞极化，神经细胞有丝分裂，内皮细胞侵袭。但其是否可以发生巯基亚硝基化修饰及在心血管疾病中的作用和机制尚未有任何相关的研究和报道。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种调节Septin2巯基亚硝基化修饰水平的制药用途，通过改变Septin2蛋白Cys111的巯基亚硝基化修饰水平，抑制主动脉瘤和主动脉夹层的发生。

技术方案：降低Septin2巯基亚硝基化修饰水平的慢病毒在制备治疗主动脉瘤和/或主动脉夹层药物中的应用。

上述慢病毒为使Septin2第111位半胱氨酸位点突变的慢病毒。

检测Septin2巯基亚硝基化修饰水平的产品在制备筛选主动脉瘤和/或主动脉夹层治疗药物试剂盒中的应用。

有益效果：利用向巨噬细胞内感染慢病毒，下调Septin2蛋白Cys111位点的巯基亚硝基化修饰，可有效抑制主动脉瘤和主动脉夹层的发生。

附图说明

图1:3周C57BL/6雄性小鼠0.25％b-氨基丙腈(BAPN)饮水4周构建AAD动物模型，提取小鼠病变血管组织，通过Biotin-switch方法联合Western Blot检测小鼠血管中Septin2巯基亚硝基化修饰水平。

图2:小鼠原代腹腔巨噬细胞给以血管紧张素2(AngII，1μM)刺激24小时，Biotin-switch方法检测Septin2巯基亚硝基化修饰水平。

图3:腹腔巨噬细胞给予AngII刺激24h，高分辨飞行时间串联质谱筛选Septin2发生巯基亚硝基化修饰位点。

图4:构建对照空载慢病毒(LV-GFP)、Septin2野生型慢病毒(LV-Septin2 WT)及第111位点突变的慢病毒(LV-Septin2 C111A)，感染小鼠腹腔巨噬细胞后，给以30ng/mL TNF-α刺激24h，通过Biotin-switch法检测了巨噬细胞内Septin2巯基亚硝基化修饰水平。

图5:利用对照空载病毒，Septin2的野生型及Cys111A位点突变病毒感染小鼠腹腔巨噬细胞后，给予LPS/TNF-α刺激，RT-PCR、ELISA检测相关炎症因子(白介素1b、白介素6、TNF-α)、趋化因子(MCP-1、CXCL1)的表达及分泌情况，以及MMP9的表达情况示意图。

图6:给予6周龄Apoe

图7:慢病毒载体图谱。

具体实施方式

下面的实施例可使本专业技术人员可全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

1.Biotin-Switch法检测巯基亚硝基化修饰蛋白(Cayman Chemical公司S-nitrosylation Protein Detection Kit，货号10006518)

(1)细胞经过处理后，去除培养基，用预冷的wash buffer洗3遍，再加500μL washbuffer刮下，并转移至1.5mL离心管里。

(2)500Xg，4℃离心，5min，弃上清。

(3)细胞置于冰上，配置Blocking buffer，具体配制方法：100μL DMF和900μLbuffer A加入新的blocking reagent配成blocking buffer原液，混匀后，加入9mL bufferA中，即为Blocking buffer。

(4)每管加入500μL blocking buffer重悬(2)所得细胞沉淀，4℃旋转30min。

(5)12,000rpm，4℃离心10min，上清转移至15mL离心管。

(6)加入4倍体积预冷的冰丙酮，翻转混匀，-20℃静置1h沉降蛋白。

(7)1h后，3000×g，4℃离心10min，弃上清，加入500μL Reducing&Labelingbuffer，吹散，室温摇床1h。

(8)加入4倍体积-20℃冰丙酮，翻转混匀，-20℃沉降蛋白1h。

(9)3000×g，4℃离心10min，弃上清。

(10)500μL Wash buffer溶解蛋白沉淀。

(11)取约800μg蛋白，加入Biotin亲和素珠子，4℃旋转过夜。

(以上均在避光条件下进行)

(12)0.5rpm，4℃离心5min，弃上清，加入新鲜IP洗液，重复至少5遍。

(13)弃上清，加入等体积的2×SDS loading buffer，混匀，加热，95-100℃，5min。

(14)Western blot检测Septin2巯基亚硝基化修饰水平(Anti-Septin2抗体：Proteintech公司，货号11397-1-AP；Anti-GAPDH抗体：巴傲德公司，货号AP0063)

2.提取原代小鼠腹腔巨噬细胞

(1)颈椎脱臼法处死小鼠，固定小鼠，75％酒精擦拭小鼠腹部；

(2)剪开腹部皮肤，暴露腹膜；

(3)眼科镊提起腹膜剪小口，避让血管，注入含有100μg/mL肝素的PBS1-2mL，用眼科镊轻抚小鼠腹部，避免液体溢出；

(4)滴管吸取细胞悬液于离心管中，重复3-4次，避开肠以及腹膜上皮细胞；

(5)细胞悬液离心，4℃，1200rpm，6min；弃上清，用PBS冲洗，离心；

(6)将细胞沉淀用含10％胎牛血清培养基重悬，种板；

(7)37℃5％二氧化碳，孵育2h后换液，贴壁细胞即为腹腔巨噬细胞。

3.慢病毒感染小鼠腹腔巨噬细胞

(1)提取小鼠原代腹腔巨噬细胞，细胞种板培养于汉10％胎牛血清的DMEM培养液中。

(2)细胞培养过夜后，采用慢病毒法进行感染。给以Septin2野生型及位点突变的过表达慢病毒(MOI＝50)处理48h。

1.Western Blot

(1)SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶)电泳：配制12％的分离胶和3％的浓缩胶。取15μL样品和3μL加样缓冲液，混匀。煮沸5min使蛋白变性后上样，每孔上样量约为30μg。110V恒压电泳约90min，至溴酚蓝消失。

(2)转膜：电泳完毕后，切去浓缩胶，将胶浸于蛋白转移缓冲液(3.6g/L Tris，200mL/L甲醇，17.3g/L甘氨酸)中平衡10-20min。用湿转的方法将蛋白条带转移至PVDF膜上(SDS-凝胶位于负极，PVDF膜位于正极)，0.3A恒流电泳80min。

(3)封闭：转膜结束后，取下PVDF膜，PBS浸泡5min后将膜浸于含5％脱脂奶粉的PBS中室温孵育1h。

(4)一抗孵育：封闭结束后将膜置于杂交袋内，加入抗体，4℃摇床过夜。

(5)二抗结合：PBS-T洗膜10min×3次。加入辣根过氧化物酶标记的抗体，室温孵育1h。PBS-T洗膜10min×3次。

(6)ECL显色：临用前将ECL显色液A与B混合，均匀滴加至膜表面，避光曝片，观察结果。

5.RT-PCR

(1)样本加入1mL Trizol，充分吹打裂解后吸取至去RNA酶(RNAase Free)的离心管中，裂解5min。

(2)每个EP管内加入200μL氯仿，剧烈震荡，置于冰上裂解10min。

(3)离心，4℃，12000rpm，15min，小心吸取上清，转移至新的EP管。

(4)加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，4℃静置10min。

(5)离心，4℃，12000rpm，15min，弃上清，加75％乙醇洗涤。

(6)离心，4℃，12000rpm，5min，弃上清，风干，加入适量的DEPC水，检测RNA浓度。

(7)RNA逆转录反应体系程序如下：

(8)引物设计：使用Primer Premier 5软件辅助设计引物，所有引物均由金唯智生物科技有限公司合成。

引物序列：

6.慢病毒构建方法：

合成mSeptin2C111A基因模版，将其构建至慢病毒载体pLVX-tdTomato-Puro(由武汉维诺赛生物技术有限公司合成)，通过酶切、测序鉴定再转染HEK293细胞中包装慢病毒，将所得慢病毒扩增、纯化并测定滴度。

mSEPT2 WT基因序列如SEQ ID NO.1所示；mSEPT2 C111A基因序列如如SEQ IDNO.2所示。

7.Apoe

(1)取Apoe

(2)小鼠SPF级饲养环境饲养2周，使慢病毒稳定表达于巨噬细胞。

(3)小鼠8周龄时，埋植AngII灌注微渗泵1μg/min/kg，对照组给予生理盐水。

(4)埋植AngII微渗泵4周后提取主动脉血管组织，测量相关病理学指标。

(5)Septin2第111位半胱氨酸位点突变的慢病毒合成于苏州吉脉基因药物生物科技有限公司。

实验结果

1、为了探究Septin2巯基亚硝基化修饰水平在主动脉瘤和主动脉夹层(AAD)中的作用，我们给予3周C57BL/6雄性小鼠0.25％b-氨基丙腈(BAPN)饮水4周构建AAD动物模型，提取小鼠病变血管组织，通过Biotin-switch方法检测小鼠血管中Septin2巯基亚硝基化修饰水平。实验结果显示：与对照组相比，AAD小鼠血管组织中Septin2巯基亚硝基化修饰水平明显增加(图1)。在细胞水平上，我们提取野生型小鼠原代腹腔巨噬细胞，给以血管紧张素2(AngII，1μM)刺激24小时，相比于对照组，AngII刺激能增加Septin2巯基亚硝基化修饰水平(图2)。以上结果提示我们：Septin2的巯基亚硝基化修饰在主动脉瘤和主动脉夹层中发挥了重要作用。

2、经过对Septin2的氨基酸序列进行研究结合高分辨飞行时间串联质谱结果(图3)，Septin2可能在半胱氨酸111位点发生巯基亚硝基化修饰。为了进一步验证发生修饰的位点，我们构建了对照空载慢病毒(LV-GFP)、Septin2野生型慢病毒(LV-Septin2 WT)及第111位点突变的慢病毒(LV-Septin2 C111A)，感染小鼠腹腔巨噬细胞后，给以TNF-α(30ng/mL)刺激24h，通过Biotin-switch法检测了巨噬细胞内Septin2巯基亚硝基化修饰水平。我们发现，在将Septin2蛋白中第111位点的半胱氨酸突变为丙氨酸后，Septin2的巯基亚硝基化修饰水平明显降低(图4)。以上结果说明，在主动脉瘤和主动脉夹层形成中，Septin2的Cys111位点发生了巯基亚硝基化修饰。

3、为了明确Cys111位点的巯基亚硝基化修饰在AAD中的作用，我们分别利用对照空载病毒，Septin2的野生型及Cys111A位点突变病毒感染小鼠腹腔巨噬细胞后，给予LPS/TNF-α刺激，检测相关炎症因子(白介素1b、白介素6、TNF-α)、趋化因子(MCP-1、CXCL1)的表达及分泌情况，以及MMP9的表达情况。RT-PCR和ELISA结果显示：与对照组相比，Cys111位点突变后可明显降低相关炎症因子、趋化因子以及MMP9的表达情况(图5)。以上结果说明：Septin2蛋白Cys111位点的巯基亚硝基化修饰水平降低后，可明显降低巨噬细胞的炎症反应及基质金属蛋白酶的表达。

4、为了进一步验证Septin2的巯基亚硝基化修饰在AAD中的作用，我们分别给予6周龄Apoe

序列表

<110> 南京医科学

<120> 调节Septin2巯基亚硝基化修饰水平的制药用途

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1083

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtctaagc aacagccaac tcagtttata aatccagaaa cacctggcta tgttggattt 60

gcaaacctcc ccaatcaagt tcaccgaaaa tcagtgaaaa aaggttttga gttcacactg 120

atggtggtcg gtgaatcagg tctaggaaaa tcgactctca taaacagcct attcctaact 180

gatctgtacc cagaaagagt catacctgga gcagcagaaa aaattgaaag aactgtccag 240

attgaggctt caactgttga aattgaagag cgaggggtca agctacgcct gacagtggta 300

gatacccctg gctatggtga cgctatcaac tgcagagatt gttttaagac aattatctcc 360

tatattgatg agcaatttga gaggtacctg catgacgaga gcggcttgaa caggcggcac 420

atcattgata atagggtgca ttgttgcttt tactttattt caccttttgg acatggactt 480

aagcccttag atgtggcgtt tatgaaggca atacacaaca aggtgaatat tgtgcctgtc 540

attgcaaaag ctgacactct caccctgaag gaacgggagc ggctgaagaa aaggattctg 600

gatgaaattg aagaacataa catcaaaatc tatcacttac ctgatgcaga atcagatgaa 660

gatgaagatt ttaaagagca gactagactt ctcaaggcta gcatcccatt ctctgtggtt 720

ggatccaatc agttgattga agccaaagga aagaaggtca gaggccgcct ctacccctgg 780

ggtgttgtgg aagtggagaa cccagagcac aatgactttc tgaagctgag aaccatgctc 840

atcacccaca tgcaggatct ccaggaggtg acccaggacc ttcattatga aaacttccgt 900

tctgagagac tcaagagagg cggcaggaaa gtggagaatg aggacatgaa taaagaccag 960

atcttgctgg aaaaagaagc tgagctccgc cgcatgcaag agatgattgc aaggatgcag 1020

gcgcagatgc agatgcagat gcagggcggg gatggcgatg gcggggctct cgggcaccac 1080

gtg 1083

<210> 2