稳定表达人源不同ApoE的CHO细胞系及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种稳定表达人源不同ApoE的CHO细胞 系及其制备方法。

背景技术

载脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)，由299个氨基酸组成，分子量为34道尔顿，基因位于19号染色体上，ApoE主要通过与低密度脂蛋白受体(Low Density LipoproteinReceptor，LDLR)结合，在血浆胆固醇和甘油三脂的代谢中发挥作用。ApoE基因具有 多态性，其基因包含3种常见的等位基因：

ApoE基因多态性的分布具有种族和地域差异。对不同种族和地域的人群进行ApoE基因多态性分布的研究，已经成为近年来ApoE基因研究的热点之一。研究发现，ApoE 基因多态性与阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)、帕金森病、冠心病、高血脂症、 脑梗塞等多种疾病的发生密切相关。研究表明，ApoE基因型在AD发病过程中具有基 因-剂量效应。用敲除ApoE基因的转基因小鼠研究也表明，ApoE决定着AD发作的 年龄风险，ApoE4明显地提前疾病发作年龄。大量人群调查发现，

然而，迄今为止尚没有一个很好的体外细胞模型，可以为研究不同ApoE的生物学功能提供一个很好的工具。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种稳定表达人源不同ApoE的CHO细胞系及其制备方法，利用转染和细胞分选方法制备能够稳定表达人源不同ApoE的CHO细胞 株，该细胞株为研究不同ApoE的生物学功能提供一个很好的工具。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种稳定表达人源不同ApoE的CHO细胞系的制备方法，包括以下步骤：

(1)将CHO细胞在DMEM细胞培养基中进行体外培养；

(2)利用转染试剂将不同的人源ApoE质粒ApoE2-EGFP、ApoE3-EGFP、 ApoE4-EGFP和对照组质粒N1-EGFP转染到CHO细胞中；

(3)4-6小时更换新的培养基，24-48小时后加入阳性筛选试剂G418；

(4)筛选转染阳性的ApoE2-EGFP、ApoE3-EGFP、ApoE4-EGFP和对照N1-EGFP 细胞株；

(5)对筛选出的阳性细胞进行鉴定，获得稳定表达人源ApoE2-EGFP，ApoE3-EGFP和ApoE4-EGFP的CHO细胞株。

在本发明一个较佳实施例中，在步骤(1)中，所述细胞培养基是含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM细胞培养基。

在本发明一个较佳实施例中，在步骤(1)中，体外培养的培养条件为37℃、含5％CO

在本发明一个较佳实施例中，在步骤(2)中，所述转染试剂为Lipofectamine2000。

在本发明一个较佳实施例中，在步骤(3)中，所述阳性筛选试剂G418的浓度为 600μg/ml。

在本发明一个较佳实施例中，在步骤(4)中，筛选细胞的方法是利用分选流式细胞仪，细胞筛选的要求是各组细胞密度达到(3-5)×10

在本发明一个较佳实施例中，在步骤(5)中，对筛选出的阳性细胞进行鉴定的方法包括利用激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、Western Blot检测各组细胞中ApoE的表 达：

(1)利用激光共聚焦显微镜对筛选出的细胞进行ApoE表达的鉴定：将分选后的 各组细胞分别接种到激光共聚焦显微镜专用培养皿中，48小时后利用激光共聚焦显微 镜可以直观地看到转染后带有绿色荧光的不同ApoE阳性细胞；

(2)利用流式细胞仪对筛选出的细胞进行ApoE表达的鉴定：将分选后的各组阳 性细胞(CHO-N1，CHO-ApoE2，CHO-ApoE3，CHO-ApoE4)和未转染的CHO细胞 继续培养，各组细胞数量达到5×10

(3)利用Western Blot检测各组细胞中ApoE的表达：培养分选后的各组阳性细胞(CHO-N1，CHO-ApoE2，CHO-ApoE3，CHO-ApoE4)，待各组细胞数量达到5×10

为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是：提供一种利用上述任一项 所述的稳定表达人源不同ApoE的CHO细胞系的制备方法制备出的稳定表达人源不同ApoE的CHO细胞系。

本发明的有益效果是：

(1)本发明以质粒为载体，利用细胞转染和细胞分选方法制备能够稳定表达人源不同ApoE蛋白的CHO细胞株，所述ApoE蛋白融合表达EGFP标签，方便ApoE蛋 白表达的检测，可以直接在激光共聚焦显微镜下进行活细胞的观察；

(2)与转染后采用细胞无限稀释法得到的单细胞克隆来源的稳转细胞系不同，本发明采用流式细胞分选的方法将所有转染阳性的细胞均分选出来，得到的不同ApoE2，ApoE3和ApoE4的稳转细胞系不是单细胞克隆来源的，而是来源于多个细胞的细胞系； 本发明建立了能够稳定表达人源不同ApoE蛋白的CHO细胞株，该细胞株为进一步深 入研究不同ApoE蛋白的生物学特性及药物研发奠定了坚实的基础；

(3)本发明构建了带有EGFP标签的过表达不同人源ApoE蛋白的细胞株，为研 究不同ApoE蛋白的生物学特性、卵巢功能及相关疾病提供了一个很好的工具。

附图说明

图1是利用激光共聚焦显微镜观察分选出的不同ApoE(ApoE2-EGFP， ApoE3-EGFP，ApoE4-EGFP)和对照(N1-EGFP)转染阳性细胞株。图A是转稳定染 N1-EGFP的CHO细胞(对照组CHO-N1)，图B是稳定转染ApoE2-EGFP的CHO细 胞(CHO-ApoE2)，图C是稳定转染ApoE3-EGFP的CHO细胞(CHO-ApoE3)，图 D是稳定转染ApoE4-EGFP的CHO细胞(CHO-ApoE4)。

图2是利用流式细胞仪检测各组细胞中ApoE的表达。图A是未转染质粒的CHO 细胞群，图B是稳定转染N1-EGFP的CHO细胞群，图C是稳定转染ApoE2-EGFP的 CHO细胞群，图D是稳定转染ApoE3-EGFP的CHO细胞群，图E是稳定转染ApoE4-EGFP的细胞群。

图3是利用Western Blot检测各组细胞中ApoE的表达，图3A是CHO-N1、 CHO-LC3、和MT+CHO-LC3各组细胞中TMRE染色结果图，图3B是各组的TMRE 染色平均荧光强度。图3A是CHO-N1、CHO-ApoE2、CHO-ApoE3、和CHO-ApoE4 各组细胞中ApoE表达的Western Blot结果图，图3B是各组细胞中ApoE表达水平的 相对定量图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更 易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

实施例1：

不同ApoE质粒转染CHO细胞，并用分选流式分选出稳定表达不同ApoE的CHO 细胞株，并利用激光共聚焦显微镜观察分选出的不同ApoE(ApoE2-EGFP， ApoE3-EGFP，ApoE4-EGFP)和对照(N1-EGFP)转染阳性细胞株，如图1所示。

卵巢上皮细胞CHO细胞系购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，胰酶消化CHO细胞，接种于60mm培养皿(5×10

实施例2：利用流式细胞术检测各组细胞中ApoE的表达，如图2所示。

将分选后的CHO-N1、CHO-ApoE2、CHO-ApoE3和CHO-ApoE4各组细胞及未转 染的CHO细胞接种到60mm培养皿中，待细胞密度达到5×10

实施例3：利用Western Blot检测各组细胞中ApoE的表达，如图3所示。

①从CHO-N1、CHO-ApoE2、CHO-ApoE3和CHO-ApoE4各组细胞中抽提蛋白；

从CHO-N1、CHO-ApoE2、CHO-ApoE3和CHO-ApoE4各组细胞培养皿中小心倾 去培养液。用预冷的PBS清洗细胞2次，小心倾去PBS。细胞培养皿中加入预冷的含 抑制剂的蛋白质抽提试剂(含蛋白酶抑制剂，PMSF和磷酸酶抑制剂的混合液)，轻轻 摇动1分钟。用细胞刮将细胞刮下来，转移细胞悬浮液到离心管中，置冰上裂解15分 钟。裂解液于预冷的离心机中12，000rpm离心15分钟。弃去沉淀，CHO-N1、 CHO-ApoE2、CHO-ApoE3和CHO-ApoE4各组细胞上清液(蛋白)立刻转移入新的离心 管中，100℃煮10分钟，-80℃保存待用。

②利用Western Blot检测各组细胞中ApoE的表达，验证分选细胞的纯度。

CHO-N1、CHO-ApoE2、CHO-ApoE3和CHO-ApoE4各组蛋白样品在12％的SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上分离，然后转移到硝酸纤维素膜上，用ApoE的抗体进行检 测。对照组(CHO-N1)ApoE几乎没有表达，CHO-ApoE2、CHO-ApoE3和CHO-ApoE4 表达量基本一致。

应当理解本文所述的例子和实施方式仅为了说明，并不用于限制本发明，本领域技 术人员可根据它做出各种修改或变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、 等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。