一种基于LFD-RMA法检测非洲猪瘟病毒ASFV的引物探针组

技术领域

本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于LFD-RMA法检测非洲猪瘟病毒ASFV的引物探针组。

背景技术

非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染家猪和各种野猪（如非洲野猪、欧洲野猪等）而引起的一种急性、出血性、烈性传染病。非洲猪瘟病毒，属于非洲猪瘟病毒科，是一种巨大且复杂的双链DNA病毒。ASFV不感染人，不会对公共卫生造成直接危害，但是严重危害着养猪产业，造成巨大经济损失。由于非洲猪瘟具有高度的传染性，除了伴有发热和出血的临床症状以外，可对不同日龄的猪群造成95%至100%的死亡率，因此世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。目前非洲猪瘟疫苗仍在实验室研究阶段，具有普遍保护性的疫苗还没有上市。因此，通过诊断方法对其进行监控和控制，是目前至关重要的控制方法。

ASFV的实验室诊断有红细胞吸附试验、直接免疫荧光试验、间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、免疫电泳试验、荧光定量PCR等方法。这些方法耗时长，操作复杂，对操作人员的技术要求高，不适用与非洲猪瘟病毒的快速检测。而重组酶介导扩增（RecombinaseMediated Amplification, RMA）技术，是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的等温核酸扩增技术，被认为是可替代PCR的核酸检测技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白（SSB）和链置换DNA聚合酶三种酶。RMA反应可以在37-42℃进行，整个过程在30min内即可达到检测水平，可实现核酸的快速扩增。RMA技术可以与侧流免疫层析技术（LFD）相结合进行扩增产物的检测。在RMA扩增体系中，需要生物素标记的反向引物和荧光基团标记的探针，在距荧光基团约30个碱基处有一个脱碱基位点（dSpacer），该位点可被核酸内切酶IV（nfo酶）识别、切割，产生新的羟基末端，并在DNA聚合酶作用下延伸，形成带有生物素和荧光基团双标记的RMA产物，通过层析膜扩散，被生物素配体和荧光基团标记抗体捕获，形成具有颜色的检测线。

本发明采用LFD-RMA法建立快速检测非洲猪瘟病毒ASFV的方法，为非洲猪瘟病毒的现场检测提供一种快速、简单、可靠的新方法。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于LFD-RMA法检测非洲猪瘟病毒ASFV的引物探针组，本申请是通过下述方案实现的：

一种基于LFD-RMA法检测非洲猪瘟病毒ASFV的引物探针组，包括检测非洲猪瘟病毒的引物对及对应的探针，其中，引物和探针序列为：

ASFV-F（上游引物）：

5’- CCTCCCGTGGCTTCAAAGCAAAGGTAATCATCA -3’;

ASFV-R（下游引物）：

5’- [Biotin]GTGACCCACACCAACAATAACCACCACGATGAA -3’;

ASFV-P（探针）：

5’-[FAM]TCTCTGCGTGGTGAGTGGGCTGCATAATGGCG[dSpacer]TAACAACATGTCCGA[C3-spacer] -3’。

优选的，所述探针的5’端用FAM标记，探针的第33个碱基T替换为THF (dSpacer)，3’末端被阻断基团C3-spacer修饰；所述下游引物的5’端用Biotin标记；扩增产物大小不超过500bp。

一种基于LFD-RMA法检测非洲猪瘟病毒ASFV的试剂盒，该试剂盒中包括有：含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水、侧流层析检测试纸条。

所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态。所述扩增反应试剂包括RMA引物对及检测探针组、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸内切酶IV。

所述缓冲液含有下述组分：Tris、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。

优选的，所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10µM；所述醋酸镁的终浓度为100mM；所述Tris的终浓度为50mM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10%w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/µL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/µL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/µL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/µL；所述核酸内切酶IV的终浓度为80ng/µL。

所述标准阳性质粒为含有ASFV基因片段的重组质粒，用于ASFV核酸检测的阳性对照。

所述无菌双蒸水为阴性对照，与标准阳性质粒一起检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应。

所述试剂盒可以检测的样品为全血或内脏组织。

一种基于LFD-RMA法检测非洲猪瘟病毒ASFV的方法，包括以下步骤：

（1）提取待测样本的DNA；

（2）设计用于ASFV检测的引物对及探针；

（3）以提取的待测样本DNA作为模板，加入上述试剂盒中的扩增反应试剂进行RMA扩增反应。扩增反应在恒温水浴锅中进行，反应条件为：40℃水浴5min后，混匀，再40℃水浴15min；

（4）应用侧流层析试纸条进行扩增产物的检测：当试纸条出现两条条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有ASFV；当试纸条只有质控区出现一条条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有ASFV。

有益效果：本发明将重组酶介导的核酸恒温扩增技术与侧流层析技术相结合，提供一个简单、快速、不须昂贵设备即可现场进行ASFV的筛检方式。无需热循环反应及特殊的仪器，其检测结果可通过目测直接观察，具有高灵敏度、特异性的特点，适用于即时快速诊断，可在非实验室环境下进行筛检，可提供非洲猪瘟病毒的快速检测。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1 LFD-RMA法检测ASFV的灵敏性试验；

图2 LFD-RMA法检测ASFV的特异性试验；

图中序号代表：1：1×10

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施方式作进一步地详细描述。

实施例1

1、阳性标准质粒的制备

提取ASFV的核酸作为模板，对ASFV的特异性基因进行PCR扩增，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收，克隆连接至pMD18-T载体，转化至大肠杆菌感受态细胞，蓝白斑筛选，挑取白色菌落，进行菌落PCR验证。将阳性重组菌送公司测序，将测序正确的重组菌培养过夜，提取质粒DNA，获得阳性质粒。

2、RMA引物与探针的设计

根据ASFV的P72基因设计了特异性RMA引物与探针，具体如表1所示：

表1引物与探针序列

3、RMA反应体系的建立

将42.5μL缓冲液和5μL提取的待测样本核酸加入到含有扩增反应试剂的检测管中，混匀，最后向管中加入2.5μL的280mM醋酸镁溶液并混匀，将上述反应管放置于恒温水浴锅中进行RMA反应，反应条件为：40℃水浴 5min后，混匀，再40℃水浴15min；每次反应均以标准阳性质粒作为阳性对照，以无菌双蒸水为阴性对照。

其中，所述恒温扩增反应试剂单管分装，为干粉形态，包括RMA引物对及检测探针组、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸内切酶IV；

所述缓冲液含有下述组分：Tris、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸；

所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10µM；所述醋酸镁的终浓度为100mM；所述Tris的终浓度为50mM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10%w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/µL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/µL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/µL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/µL；所述核酸内切酶IV的终浓度为80ng/µL。

所述标准阳性质粒为含有ASFV基因片段的重组质粒，用于ASFV核酸检测的阳性对照。

所述无菌双蒸水为阴性对照，与标准阳性质粒一起检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应。

4、侧流层析试纸条检测方法的操作及结果判读

在RMA扩增结束后，将反应管放到含有侧流层析试纸条的一次性核酸检测装置中，5min后，通过试纸条的显色进行判读。若质控线(C)和检测线(T)均显色，则判读结果为阳性；若仅质控线显色，则为阴性；若质控线不显色，表明试纸条失效。

5、LFD-RMA法检测ASFV的灵敏度分析

将标准阳性质粒经PBS进行10倍系列稀释（包括1×10

6、LFD-RMA法检测ASFV的特异性分析

为了检验LFD-RMA检测方法的特异性，选择ASFV、猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒（PCV）、猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒（PRRSV）、伪狂犬病病毒（PRV）等病原体核酸样本，用LFD-RMA方法进行检测，以无菌双蒸水作为阴性对照，每个试验重复检测3次。根据图2可知，只有ASFV阳性模板呈现质控线（C）和检测线（T）两条线，检测结果是阳性，其他病毒均只有质控线（C）一条线，检测结果是阴性。该结果表明所建立的LFD-RMA检测方法具有良好的特异性。

以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

序列表

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<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

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<212> DNA

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