一种核桃多肽的制备方法

技术领域

本发明属于食品工业技术领域，具体地说，涉及一种核桃多肽的制备方法。

背景技术

核桃作为重要的木本粮油经济树种在我国种植面积大，产量可观。核桃仁不仅营养丰富且味道鲜美，也是多种食品的辅料。核桃仁通常用于制备核桃油，而其含有大量的蛋白质往往被忽略掉。目前关于核桃仁的深加工产品并不多，尤其是对核桃仁中的活性肽的有效利用。

例如中国发明专利，申请号：CN201410495148.7，公开号：CN104293870B，公开了一种抗氧化核桃多肽保健品的制备方法，其技术方案如下：“核桃多肽的生产工艺包括如下步骤：

(1)原料的选择：挑选无虫害、优质的核桃，经脱皮、CO

(2)核桃粕的均质：将过筛后的核桃粕和水以1：10混合，在45MPa下均质三遍；

(3)核桃蛋白的提取：先将上述核桃混悬液稀释5倍，在85℃下变性15min，再用1mol/L的NaOH溶液将其pH值调整为9，在55℃条件下碱溶2h，经离心取上清液，用0.5mol/L的HCl溶液将上清液的pH值调至6，经离心，将收集的沉淀用NaHCO

(4)酶解前处理：将提取的核桃蛋白与水以1：8的比例制备成混悬液，在95℃之间保温10min，从而破坏蛋白质的结构利于其水解；

(5)酶解反应：将上述核桃蛋白混悬液冷却至45℃，先将pH值调节至10，加入4000u/g的碱性蛋白酶，酶解30min，然后将pH值调至8加入6000u/g木瓜蛋白酶，继续酶解30min，再将pH值调至7加入7000u/g中性蛋白酶，继续酶解30min，最后将pH值调至6加入3000u/g菠萝蛋白酶进行酶解，3h后酶解反应的水解度基本不变时，迅速将核桃蛋白混悬液的温度调至90℃，恒温15min后，停止酶解反应；

(6)分离：将步骤(5)得到的酶解液pH值调至5经离心取上清液，再将上清液过分子量5000的超滤膜超滤，得到含小分子多肽的核桃多肽溶液；

(7)脱盐：用强酸性阳离子树脂和强碱性阴离子树脂分别处理核桃多肽溶液，得到脱盐的核桃多肽溶液；

(8)浓缩与干燥：用旋转蒸发仪在-0.07MPa，60℃的条件下浓缩至原溶液的1/4后，用喷雾干燥器在进口温度70℃，出口温度180℃，流量1200ml/h的条件下进行喷雾干燥，得到核桃多肽粉”。但该专利存在以下问题：二氧化碳超临界萃取后核桃粕中活性肽的含量较少，而且活性肽易被破坏，多肽提取过程中温度较高。

发明内容

1、要解决的问题

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种核桃多肽的制备方法，工艺简单、易于制作，具体来说，核桃多肽具有较好的降血压作用，其IC50值的范围在0.020mg/mL-0.028mg/mL，说明其ACE抑制活性高，同时，核桃多肽具有较好的抗氧化活性，其对DPPH自由基的清除率的范围在89.4％-92.8％。

2、技术方案

为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。

一种核桃多肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)预处理：筛选与去皮，得到核桃仁；

(2)粗破碎处理：将步骤(1)中预处理后的核桃仁，先转移到烘箱中进行烘制，烘制后转移到破碎机中进行破碎处理；

(3)精破碎处理：将步骤(2)中粗破碎处理后的核桃仁，转移到碾磨机进行碾磨处理；

(4)加酶液处理：将步骤(3)中精破碎处理后的核桃仁，加入酶液进行酶解处理；

(5)离心处理：将步骤(4)中加酶液处理后的溶液进行离心处理，取清液；

(6)超滤处理：将步骤(5)中离心处理后的清液过超滤膜，取滤过液；

(7)丙酮沉淀纯化：将步骤(6)中超滤处理后的滤过液，加丙酮进行搅拌，静置后取清液；

(8)树脂吸附纯化：将步骤(7)中丙酮沉淀纯化后的清液采用树脂进行吸附，回收洗脱液，并真空冷冻干燥。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(1)中筛选的工艺如下：

挑选无机械破损、无发霉的核桃仁；

步骤(1)中去皮的工艺如下：

采用人工的方式去掉核桃仁的表皮。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(2)中烘制的温度为50℃；

步骤(2)中烘制的时间为2h；

步骤(2)中烘制后的核桃仁的平均含水量低于5％；

步骤(2)中破碎处理的温度为8℃；

步骤(2)中破碎处理后的核桃仁的平均粒径为3mm。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(3)中碾磨处理的温度为4℃；

步骤(3)中碾磨处理后的核桃仁的平均粒度为600目。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(4)中酶解的温度为40℃；

步骤(4)中酶解的时间为1h；

步骤(4)中核桃仁与酶解液之间的质量比为1：25。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(4)中酶解液，包括以下组分：

核桃仁：1g-3g，

柠檬酸钙：0.1g-0.2g，

风味蛋白酶：0.01g-0.05g，

碱性蛋白酶：0.04g-0.08g，

甘露醇：3mL-5mL，

无菌水：30mL-50mL；

pH：6.0-6.5。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(4)中酶解液，包括以下组分：

核桃仁：1g-3g，

柠檬酸钙：0.1g-0.2g，

风味蛋白酶：0.02g-0.04g，

碱性蛋白酶：0.05g-0.08g，

甘露醇：3mL-5mL，

无菌水：35mL-45mL；

pH：6.0-6.5。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(4)中酶解液，包括以下组分：

核桃仁：2g，

柠檬酸钙：0.1g，

风味蛋白酶：0.03g，

碱性蛋白酶：0.07g，

甘露醇：4mL，

无菌水：40mL；

pH：6.0-6.5。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(5)中离心处理的温度为4℃；

步骤(5)中离心处理的离心力为15000g；

步骤(6)中超滤膜的截留分子量为2kDa；

步骤(7)中丙酮与滤过液之间的体积比为2：1；

步骤(8)中树脂为二乙烯苯、丙烯酸酯的混合物，其中两者之间的质量比为5：7。

3、有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明制备的核桃多肽，工艺简单、易于制作，具体来说，核桃多肽具有较好的降血压作用，其IC50值的范围在0.020mg/mL-0.028mg/mL，说明其ACE抑制活性高，同时，核桃多肽具有较好的抗氧化活性，其对DPPH自由基的清除率的范围在89.4％-92.8％。本发明在现有技术的基础上，引入柠檬酸钙、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、甘露醇及特定的吸附树脂组分，同时还自创了丙酮纯化工艺步骤，总的来说，对核桃多肽的提取及纯化带来的有效的提升。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

实施例1

本实施例的核桃多肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)预处理：筛选与去皮，得到核桃仁；

(2)粗破碎处理：将步骤(1)中预处理后的核桃仁，先转移到烘箱中进行烘制，烘制后转移到破碎机中进行破碎处理；

(3)精破碎处理：将步骤(2)中粗破碎处理后的核桃仁，转移到碾磨机进行碾磨处理；

(4)加酶液处理：将步骤(3)中精破碎处理后的核桃仁，加入酶液进行酶解处理；

(5)离心处理：将步骤(4)中加酶液处理后的溶液进行离心处理，取清液；

(6)超滤处理：将步骤(5)中离心处理后的清液过超滤膜，取滤过液；

(7)丙酮沉淀纯化：将步骤(6)中超滤处理后的滤过液，加丙酮进行搅拌，静置后取清液；

(8)树脂吸附纯化：将步骤(7)中丙酮沉淀纯化后的清液采用树脂进行吸附，回收洗脱液，并真空冷冻干燥。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(1)中筛选的工艺如下：

挑选无机械破损、无发霉的核桃仁；

步骤(1)中去皮的工艺如下：

采用人工的方式去掉核桃仁的表皮。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(2)中烘制的温度为50℃；

步骤(2)中烘制的时间为2h；

步骤(2)中烘制后的核桃仁的平均含水量低于5％；

步骤(2)中破碎处理的温度为8℃；

步骤(2)中破碎处理后的核桃仁的平均粒径为3mm。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(3)中碾磨处理的温度为4℃；

步骤(3)中碾磨处理后的核桃仁的平均粒度为600目。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(4)中酶解的温度为40℃；

步骤(4)中酶解的时间为1h；

步骤(4)中核桃仁与酶解液之间的质量比为1：25。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(4)中酶解液，包括以下组分：

核桃仁：1g，

柠檬酸钙：0.2g，

风味蛋白酶：0.01g，

碱性蛋白酶：0.08g，

甘露醇：3mL，

无菌水：50mL；

pH：6.0。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(5)中离心处理的温度为4℃；

步骤(5)中离心处理的离心力为15000g；

步骤(6)中超滤膜的截留分子量为2kDa；

步骤(7)中丙酮与滤过液之间的体积比为2：1；

步骤(8)中树脂为二乙烯苯、丙烯酸酯的混合物，其中两者之间的质量比为5：7。

实施例2

本实施例的核桃多肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)预处理：筛选与去皮，得到核桃仁；

(2)粗破碎处理：将步骤(1)中预处理后的核桃仁，先转移到烘箱中进行烘制，烘制后转移到破碎机中进行破碎处理；

(3)精破碎处理：将步骤(2)中粗破碎处理后的核桃仁，转移到碾磨机进行碾磨处理；

(4)加酶液处理：将步骤(3)中精破碎处理后的核桃仁，加入酶液进行酶解处理；

(5)离心处理：将步骤(4)中加酶液处理后的溶液进行离心处理，取清液；

(6)超滤处理：将步骤(5)中离心处理后的清液过超滤膜，取滤过液；

(7)丙酮沉淀纯化：将步骤(6)中超滤处理后的滤过液，加丙酮进行搅拌，静置后取清液；

(8)树脂吸附纯化：将步骤(7)中丙酮沉淀纯化后的清液采用树脂进行吸附，回收洗脱液，并真空冷冻干燥。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(1)中筛选的工艺如下：

挑选无机械破损、无发霉的核桃仁；

步骤(1)中去皮的工艺如下：

采用人工的方式去掉核桃仁的表皮。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(2)中烘制的温度为50℃；

步骤(2)中烘制的时间为2h；

步骤(2)中烘制后的核桃仁的平均含水量低于5％；

步骤(2)中破碎处理的温度为8℃；

步骤(2)中破碎处理后的核桃仁的平均粒径为3mm。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(3)中碾磨处理的温度为4℃；

步骤(3)中碾磨处理后的核桃仁的平均粒度为600目。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(4)中酶解的温度为40℃；

步骤(4)中酶解的时间为1h；

步骤(4)中核桃仁与酶解液之间的质量比为1：25。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(4)中酶解液，包括以下组分：

核桃仁：3g，

柠檬酸钙：0.1g，

风味蛋白酶：0.05g，

碱性蛋白酶：0.04g，

甘露醇：5mL，

无菌水：30mL；

pH：6.5。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(5)中离心处理的温度为4℃；

步骤(5)中离心处理的离心力为15000g；

步骤(6)中超滤膜的截留分子量为2kDa；

步骤(7)中丙酮与滤过液之间的体积比为2：1；

步骤(8)中树脂为二乙烯苯、丙烯酸酯的混合物，其中两者之间的质量比为5：7。

实施例3

本实施例的核桃多肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)预处理：筛选与去皮，得到核桃仁；

(2)粗破碎处理：将步骤(1)中预处理后的核桃仁，先转移到烘箱中进行烘制，烘制后转移到破碎机中进行破碎处理；

(3)精破碎处理：将步骤(2)中粗破碎处理后的核桃仁，转移到碾磨机进行碾磨处理；

(4)加酶液处理：将步骤(3)中精破碎处理后的核桃仁，加入酶液进行酶解处理；

(5)离心处理：将步骤(4)中加酶液处理后的溶液进行离心处理，取清液；

(6)超滤处理：将步骤(5)中离心处理后的清液过超滤膜，取滤过液；

(7)丙酮沉淀纯化：将步骤(6)中超滤处理后的滤过液，加丙酮进行搅拌，静置后取清液；

(8)树脂吸附纯化：将步骤(7)中丙酮沉淀纯化后的清液采用树脂进行吸附，回收洗脱液，并真空冷冻干燥。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(1)中筛选的工艺如下：

挑选无机械破损、无发霉的核桃仁；

步骤(1)中去皮的工艺如下：

采用人工的方式去掉核桃仁的表皮。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(2)中烘制的温度为50℃；

步骤(2)中烘制的时间为2h；

步骤(2)中烘制后的核桃仁的平均含水量低于5％；

步骤(2)中破碎处理的温度为8℃；

步骤(2)中破碎处理后的核桃仁的平均粒径为3mm。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(3)中碾磨处理的温度为4℃；

步骤(3)中碾磨处理后的核桃仁的平均粒度为600目。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(4)中酶解的温度为40℃；

步骤(4)中酶解的时间为1h；

步骤(4)中核桃仁与酶解液之间的质量比为1：25。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(4)中酶解液，包括以下组分：

核桃仁：1g，

柠檬酸钙：0.2g，

风味蛋白酶：0.02g，

碱性蛋白酶：0.08g，

甘露醇：3mL，

无菌水：45mL；

pH：6.0。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(5)中离心处理的温度为4℃；

步骤(5)中离心处理的离心力为15000g；

步骤(6)中超滤膜的截留分子量为2kDa；

步骤(7)中丙酮与滤过液之间的体积比为2：1；

步骤(8)中树脂为二乙烯苯、丙烯酸酯的混合物，其中两者之间的质量比为5：7。

实施例4

本实施例的核桃多肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)预处理：筛选与去皮，得到核桃仁；

(2)粗破碎处理：将步骤(1)中预处理后的核桃仁，先转移到烘箱中进行烘制，烘制后转移到破碎机中进行破碎处理；

(3)精破碎处理：将步骤(2)中粗破碎处理后的核桃仁，转移到碾磨机进行碾磨处理；

(4)加酶液处理：将步骤(3)中精破碎处理后的核桃仁，加入酶液进行酶解处理；

(5)离心处理：将步骤(4)中加酶液处理后的溶液进行离心处理，取清液；

(6)超滤处理：将步骤(5)中离心处理后的清液过超滤膜，取滤过液；

(7)丙酮沉淀纯化：将步骤(6)中超滤处理后的滤过液，加丙酮进行搅拌，静置后取清液；

(8)树脂吸附纯化：将步骤(7)中丙酮沉淀纯化后的清液采用树脂进行吸附，回收洗脱液，并真空冷冻干燥。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(1)中筛选的工艺如下：

挑选无机械破损、无发霉的核桃仁；

步骤(1)中去皮的工艺如下：

采用人工的方式去掉核桃仁的表皮。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(2)中烘制的温度为50℃；

步骤(2)中烘制的时间为2h；

步骤(2)中烘制后的核桃仁的平均含水量低于5％；

步骤(2)中破碎处理的温度为8℃；

步骤(2)中破碎处理后的核桃仁的平均粒径为3mm。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(3)中碾磨处理的温度为4℃；

步骤(3)中碾磨处理后的核桃仁的平均粒度为600目。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(4)中酶解的温度为40℃；

步骤(4)中酶解的时间为1h；

步骤(4)中核桃仁与酶解液之间的质量比为1：25。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(4)中酶解液，包括以下组分：

核桃仁：3g，

柠檬酸钙：0.1g，

风味蛋白酶：0.04g，

碱性蛋白酶：0.05g，

甘露醇：5mL，

无菌水：35mL；

pH：6.5。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(5)中离心处理的温度为4℃；

步骤(5)中离心处理的离心力为15000g；

步骤(6)中超滤膜的截留分子量为2kDa；

步骤(7)中丙酮与滤过液之间的体积比为2：1；

步骤(8)中树脂为二乙烯苯、丙烯酸酯的混合物，其中两者之间的质量比为5：7。

实施例5

本实施例的核桃多肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)预处理：筛选与去皮，得到核桃仁；

(2)粗破碎处理：将步骤(1)中预处理后的核桃仁，先转移到烘箱中进行烘制，烘制后转移到破碎机中进行破碎处理；

(3)精破碎处理：将步骤(2)中粗破碎处理后的核桃仁，转移到碾磨机进行碾磨处理；

(4)加酶液处理：将步骤(3)中精破碎处理后的核桃仁，加入酶液进行酶解处理；

(5)离心处理：将步骤(4)中加酶液处理后的溶液进行离心处理，取清液；

(6)超滤处理：将步骤(5)中离心处理后的清液过超滤膜，取滤过液；

(7)丙酮沉淀纯化：将步骤(6)中超滤处理后的滤过液，加丙酮进行搅拌，静置后取清液；

(8)树脂吸附纯化：将步骤(7)中丙酮沉淀纯化后的清液采用树脂进行吸附，回收洗脱液，并真空冷冻干燥。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(1)中筛选的工艺如下：

挑选无机械破损、无发霉的核桃仁；

步骤(1)中去皮的工艺如下：

采用人工的方式去掉核桃仁的表皮。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(2)中烘制的温度为50℃；

步骤(2)中烘制的时间为2h；

步骤(2)中烘制后的核桃仁的平均含水量低于5％；

步骤(2)中破碎处理的温度为8℃；

步骤(2)中破碎处理后的核桃仁的平均粒径为3mm。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(3)中碾磨处理的温度为4℃；

步骤(3)中碾磨处理后的核桃仁的平均粒度为600目。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(4)中酶解的温度为40℃；

步骤(4)中酶解的时间为1h；

步骤(4)中核桃仁与酶解液之间的质量比为1：25。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(4)中酶解液，包括以下组分：

核桃仁：2g，

柠檬酸钙：0.1g，

风味蛋白酶：0.03g，

碱性蛋白酶：0.07g，

甘露醇：4mL，

无菌水：40mL；

pH：6.5。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(5)中离心处理的温度为4℃；

步骤(5)中离心处理的离心力为15000g；

步骤(6)中超滤膜的截留分子量为2kDa；

步骤(7)中丙酮与滤过液之间的体积比为2：1；

步骤(8)中树脂为二乙烯苯、丙烯酸酯的混合物，其中两者之间的质量比为5：7。

对比例1

本实施例的核桃多肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)预处理：筛选与去皮，得到核桃仁；

(2)粗破碎处理：将步骤(1)中预处理后的核桃仁，先转移到烘箱中进行烘制，烘制后转移到破碎机中进行破碎处理；

(3)精破碎处理：将步骤(2)中粗破碎处理后的核桃仁，转移到碾磨机进行碾磨处理；

(4)加酶液处理：将步骤(3)中精破碎处理后的核桃仁，加入酶液进行酶解处理；

(5)离心处理：将步骤(4)中加酶液处理后的溶液进行离心处理，取清液；

(6)超滤处理：将步骤(5)中离心处理后的清液过超滤膜，取滤过液；

(7)丙酮沉淀纯化：将步骤(6)中超滤处理后的滤过液，加丙酮进行搅拌，静置后取清液；

(8)树脂吸附纯化：将步骤(7)中丙酮沉淀纯化后的清液采用树脂进行吸附，回收洗脱液，并真空冷冻干燥。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(1)中筛选的工艺如下：

挑选无机械破损、无发霉的核桃仁；

步骤(1)中去皮的工艺如下：

采用人工的方式去掉核桃仁的表皮。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(2)中烘制的温度为50℃；

步骤(2)中烘制的时间为2h；

步骤(2)中烘制后的核桃仁的平均含水量低于5％；

步骤(2)中破碎处理的温度为8℃；

步骤(2)中破碎处理后的核桃仁的平均粒径为3mm。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(3)中碾磨处理的温度为4℃；

步骤(3)中碾磨处理后的核桃仁的平均粒度为600目。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(4)中酶解的温度为40℃；

步骤(4)中酶解的时间为1h；

步骤(4)中核桃仁与酶解液之间的质量比为1：25。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(4)中酶解液，包括以下组分：

核桃仁：2g，

风味蛋白酶：0.03g，

碱性蛋白酶：0.07g，

甘露醇：4mL，

无菌水：40mL；

pH：6.5。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(5)中离心处理的温度为4℃；

步骤(5)中离心处理的离心力为15000g；

步骤(6)中超滤膜的截留分子量为2kDa；

步骤(7)中丙酮与滤过液之间的体积比为2：1；

步骤(8)中树脂为二乙烯苯、丙烯酸酯的混合物，其中两者之间的质量比为5：7。

对比例2

本实施例的核桃多肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)预处理：筛选与去皮，得到核桃仁；

(2)粗破碎处理：将步骤(1)中预处理后的核桃仁，先转移到烘箱中进行烘制，烘制后转移到破碎机中进行破碎处理；

(3)精破碎处理：将步骤(2)中粗破碎处理后的核桃仁，转移到碾磨机进行碾磨处理；

(4)加酶液处理：将步骤(3)中精破碎处理后的核桃仁，加入酶液进行酶解处理；

(5)离心处理：将步骤(4)中加酶液处理后的溶液进行离心处理，取清液；

(6)超滤处理：将步骤(5)中离心处理后的清液过超滤膜，取滤过液；

(7)丙酮沉淀纯化：将步骤(6)中超滤处理后的滤过液，加丙酮进行搅拌，静置后取清液；

(8)树脂吸附纯化：将步骤(7)中丙酮沉淀纯化后的清液采用树脂进行吸附，回收洗脱液，并真空冷冻干燥。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(1)中筛选的工艺如下：

挑选无机械破损、无发霉的核桃仁；

步骤(1)中去皮的工艺如下：

采用人工的方式去掉核桃仁的表皮。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(2)中烘制的温度为50℃；

步骤(2)中烘制的时间为2h；

步骤(2)中烘制后的核桃仁的平均含水量低于5％；

步骤(2)中破碎处理的温度为8℃；

步骤(2)中破碎处理后的核桃仁的平均粒径为3mm。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(3)中碾磨处理的温度为4℃；

步骤(3)中碾磨处理后的核桃仁的平均粒度为600目。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(4)中酶解的温度为40℃；

步骤(4)中酶解的时间为1h；

步骤(4)中核桃仁与酶解液之间的质量比为1：25。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(4)中酶解液，包括以下组分：

核桃仁：2g，

碱性蛋白酶：0.07g，

甘露醇：4mL，

无菌水：40mL；

pH：6.0。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(5)中离心处理的温度为4℃；

步骤(5)中离心处理的离心力为15000g；

步骤(6)中超滤膜的截留分子量为2kDa；

步骤(7)中丙酮与滤过液之间的体积比为2：1；

步骤(8)中树脂为二乙烯苯、丙烯酸酯的混合物，其中两者之间的质量比为5：7。

对比例3

本实施例的核桃多肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)预处理：筛选与去皮，得到核桃仁；

(2)粗破碎处理：将步骤(1)中预处理后的核桃仁，先转移到烘箱中进行烘制，烘制后转移到破碎机中进行破碎处理；

(3)精破碎处理：将步骤(2)中粗破碎处理后的核桃仁，转移到碾磨机进行碾磨处理；

(4)加酶液处理：将步骤(3)中精破碎处理后的核桃仁，加入酶液进行酶解处理；

(5)离心处理：将步骤(4)中加酶液处理后的溶液进行离心处理，取清液；

(6)超滤处理：将步骤(5)中离心处理后的清液过超滤膜，取滤过液；

(7)丙酮沉淀纯化：将步骤(6)中超滤处理后的滤过液，加丙酮进行搅拌，静置后取清液；

(8)树脂吸附纯化：将步骤(7)中丙酮沉淀纯化后的清液采用树脂进行吸附，回收洗脱液，并真空冷冻干燥。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(1)中筛选的工艺如下：

挑选无机械破损、无发霉的核桃仁；

步骤(1)中去皮的工艺如下：

采用人工的方式去掉核桃仁的表皮。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(2)中烘制的温度为50℃；

步骤(2)中烘制的时间为2h；

步骤(2)中烘制后的核桃仁的平均含水量低于5％；

步骤(2)中破碎处理的温度为8℃；

步骤(2)中破碎处理后的核桃仁的平均粒径为3mm。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(3)中碾磨处理的温度为4℃；

步骤(3)中碾磨处理后的核桃仁的平均粒度为600目。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(4)中酶解的温度为40℃；

步骤(4)中酶解的时间为1h；

步骤(4)中核桃仁与酶解液之间的质量比为1：25。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(4)中酶解液，包括以下组分：

核桃仁：2g，

柠檬酸钙：0.1g，

风味蛋白酶：0.03g，

碱性蛋白酶：0.07g，

无菌水：40mL；

pH：6.5。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(5)中离心处理的温度为4℃；

步骤(5)中离心处理的离心力为15000g；

步骤(6)中超滤膜的截留分子量为2kDa；

步骤(7)中丙酮与滤过液之间的体积比为2：1；

步骤(8)中树脂为二乙烯苯。

对比例4

本实施例的核桃多肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)预处理：筛选与去皮，得到核桃仁；

(2)粗破碎处理：将步骤(1)中预处理后的核桃仁，先转移到烘箱中进行烘制，烘制后转移到破碎机中进行破碎处理；

(3)精破碎处理：将步骤(2)中粗破碎处理后的核桃仁，转移到碾磨机进行碾磨处理；

(4)加酶液处理：将步骤(3)中精破碎处理后的核桃仁，加入酶液进行酶解处理；

(5)离心处理：将步骤(4)中加酶液处理后的溶液进行离心处理，取清液；

(6)超滤处理：将步骤(5)中离心处理后的清液过超滤膜，取滤过液；

(7)丙酮沉淀纯化：将步骤(6)中超滤处理后的滤过液，加丙酮进行搅拌，静置后取清液；

(8)树脂吸附纯化：将步骤(7)中丙酮沉淀纯化后的清液采用树脂进行吸附，回收洗脱液，并真空冷冻干燥。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(1)中筛选的工艺如下：

挑选无机械破损、无发霉的核桃仁；

步骤(1)中去皮的工艺如下：

采用人工的方式去掉核桃仁的表皮。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(2)中烘制的温度为50℃；

步骤(2)中烘制的时间为2h；

步骤(2)中烘制后的核桃仁的平均含水量低于5％；

步骤(2)中破碎处理的温度为8℃；

步骤(2)中破碎处理后的核桃仁的平均粒径为3mm。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(3)中碾磨处理的温度为4℃；

步骤(3)中碾磨处理后的核桃仁的平均粒度为600目。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(4)中酶解的温度为40℃；

步骤(4)中酶解的时间为1h；

步骤(4)中核桃仁与酶解液之间的质量比为1：25。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(4)中酶解液，包括以下组分：

核桃仁：2g，

柠檬酸钙：0.1g，

甘露醇：4mL，

无菌水：40mL；

pH：6.0。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(5)中离心处理的温度为4℃；

步骤(5)中离心处理的离心力为15000g；

步骤(6)中超滤膜的截留分子量为2kDa；

步骤(7)中丙酮与滤过液之间的体积比为2：1；

步骤(8)中树脂为二乙烯苯。

对比例5

本实施例的核桃多肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)预处理：筛选与去皮，得到核桃仁；

(2)粗破碎处理：将步骤(1)中预处理后的核桃仁，先转移到烘箱中进行烘制，烘制后转移到破碎机中进行破碎处理；

(3)精破碎处理：将步骤(2)中粗破碎处理后的核桃仁，转移到碾磨机进行碾磨处理；

(4)加酶液处理：将步骤(3)中精破碎处理后的核桃仁，加入酶液进行酶解处理；

(5)离心处理：将步骤(4)中加酶液处理后的溶液进行离心处理，取清液；

(6)超滤处理：将步骤(5)中离心处理后的清液过超滤膜，取滤过液；

(7)树脂吸附纯化：将步骤(6)中超滤处理后的滤过液采用树脂进行吸附，回收洗脱液，并真空冷冻干燥。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(1)中筛选的工艺如下：

挑选无机械破损、无发霉的核桃仁；

步骤(1)中去皮的工艺如下：

采用人工的方式去掉核桃仁的表皮。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(2)中烘制的温度为50℃；

步骤(2)中烘制的时间为2h；

步骤(2)中烘制后的核桃仁的平均含水量低于5％；

步骤(2)中破碎处理的温度为8℃；

步骤(2)中破碎处理后的核桃仁的平均粒径为3mm。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(3)中碾磨处理的温度为4℃；

步骤(3)中碾磨处理后的核桃仁的平均粒度为600目。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(4)中酶解的温度为40℃；

步骤(4)中酶解的时间为1h；

步骤(4)中核桃仁与酶解液之间的质量比为1：25。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(4)中酶解液，包括以下组分：

核桃仁：2g，

柠檬酸钙：0.1g，

风味蛋白酶：0.03g，

碱性蛋白酶：0.07g，

甘露醇：4mL，

无菌水：40mL；

pH：6.5。

上述所述的核桃多肽的制备方法中，步骤(5)中离心处理的温度为4℃；

步骤(5)中离心处理的离心力为15000g；

步骤(6)中超滤膜的截留分子量为2kDa；

步骤(7)中树脂为聚氨酯。

对比例6

中国发明专利，申请号：CN201310075875.3，公开号：CN103125735A，公开一种核桃多肽的制备方法，如其说明书所述：

“一种核桃多肽的制备方法，该方法包括如下步骤：

a、原料的处理：将脱脂核桃饼用粉碎机粉碎并过40目筛后制得核桃饼粉碎料，再将核桃饼粉碎料与水按重量比1：4的比例混合均匀后制得核桃饼混悬液。

b、混悬液的均质：将核桃饼混悬液通过胶体磨磨浆后再通过高压均质机均质处理制得核桃饼混合液，均质压力为30Mpa。

c、保温酶解：向核桃饼混合液中加入AlcaLase酶与木瓜蛋白酶的混合酶液，

混合酶液的AlcaLase酶与木瓜蛋白酶的体积比为AlcaLase酶：木瓜蛋白酶＝1：1.混合酶液的添加量为核桃饼混合液质量的0.05％，酶隋杰条件为温度为60℃、pH值7.0，时间8小时，制得核桃饼酶解液；

d、高温灭菌：将核桃饼酶解液的温度快速升温至95℃，并保温10分钟；

e、液—固分离：将经过高温灭酶的核桃饼酶解液进行液—固分离后除去不溶性固形物，制得核桃多肽液；

f、浓缩：将核桃多肽液采用真空浓缩制得核桃多肽浓缩液，核桃多肽浓缩液的水分含量为70％。浓缩制得核桃多肽浓缩液；

g、干燥：将核桃多肽浓缩液采用喷雾干燥的方式制得核桃核桃多肽粉”。

对比例7

中国发明专利，申请号：CN201810887403.0，公开号：CN109055462A，公开一种核桃多肽的提取和制备工艺，如其说明书所述：

“一种核桃多肽的提取和制备工艺，它包括以下步骤：

步骤A、原料处理：选取干燥、无霉变、无哈败的新鲜、水分含量在8％以下的核桃粕，将核桃粕用粉碎机粉碎，粉碎后粒径小于0.5㎝；

步骤B、磨浆：将粉碎后的核桃粕与纯净水按照1：14的重量配比进行混合磨浆，并混合均匀，得到核桃粕溶液；

步骤C、加热杀菌：将核桃粕溶液在夹层罐加热到97℃，保温300秒，冷却到32℃，然后打入卧室发酵罐，卧式发酵罐内液位不超过50％；

步骤D、接种：将黑曲霉AS3.350和黑曲霉AS3.324活菌冻干粉按照9：2的重量配比进行混合得到黑曲霉组合菌种，而后将黑曲霉组合菌种与卧式发酵罐中的核桃粕溶液按照110g/吨的比例接种到卧式发酵罐内，并搅拌均匀；

步骤E、发酵：卧式发酵罐内的温度保持在30℃，PH值保持在6.1，卧式发酵罐内的水平搅拌器搅拌速度设定为40r/min，发酵时间控制在54h。

步骤F、终止发酵：将卧式发酵罐内的发酵液加热到97℃，保温900秒；

步骤G、超滤：使用超滤机组对上一步骤中产生的发酵液进行两次超滤处理，第一次先采用5kD膜组件以全回流的方式进行超滤，压力控制在0.1MPa以下，收集超滤液，再采用3kD膜组件也进行超滤，收集超滤液，控制核桃多肽平均分子质量为2000D左右；

步骤H、蒸发浓缩：将上一步骤超滤后的澄清液在低温、真空条件下蒸发浓缩至液体提取液；

步骤I、冷冻干燥：将上一步蒸发浓缩得到的液体提取液用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到蜂窝状核桃多肽固体；

步骤J、低温粉碎：将上一步骤产生的可溶性固定物投入装有冰水冷却系统的粉碎机中，在10℃的温度条件下粉碎为100目的粉末，并过筛，筛网的孔径为80目；

步骤K、包装：将上一步骤产生的核桃多肽粉末，在超洁净工作台上分装到复合铝箔袋中，封口、打印日期、装箱后10℃条件下储存。

所述的步骤B中的纯净水的温度为45℃。

所述的步骤C中的卧式发酵罐内的溶液应保证杂菌全部消灭，其液位控制在50％以下，利于搅拌时发酵液有最大氧气接触面，利于发酵过程的进行。

所述的步骤H中的低温、真空条件为温度为25℃，真空度82KPa，所述的液体提取液中的可溶性固形物的含量为40％”。

对比例8

中国发明专利，申请号：CN201811639785.1，公开号：CN109609576A，公开一种山核桃多肽的提取方法，如其说明书所述：

“(1)将山核桃仁榨油饼粕干燥、粉粹，再以每g粉末添加5ml正己烷的量加入正己烷，69℃下回流提取1小时，重复提三次后，真空抽滤，滤饼干燥，过40目筛，获得脱脂山核桃粉(蛋白质的含量48.34％)。

(2)向氧化锆球磨罐中加入脱脂山核桃粉1.2g，NaOH 0.03g，CaCO

(3)称取球磨粉末0.84g，向其中加入40mL pH＝9缓冲溶液，所得混合液用1mol/L的HCl水溶液调节pH至8，加入碱性蛋白酶0.02g，在55℃、170rpm的条件下酶解1h；灭酶，将灭酶后的溶液在7500r/min离心机上离心10min，并收集上清液，用截留分子量为0.3kDa的透析膜在去离子水中透析处理3天，收集透析袋内的液体，冷冻干燥”。

实施例6

选择实施例1制备的产品以及对比例1-8制备的产品，进行如下实验：

借鉴下述实验方法并依托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测试。

降压肽的ACE抑制能力按照如下方法进行测定：

ACE抑制率的方法。用高效液相色谱在228nm下定量检测释放出的Hip量，从而计算出多肽的ACE抑制率。

(1)试剂的配置

pH8.3的磷酸盐缓冲溶液：用超纯水配制，其中含磷酸盐50mmol/L，NaCl 300mmol/L，调整pH到8.3；

ACE酶液：将2mL的磷酸盐缓冲液加入1U的ACE中，使其浓度变为0.5U/mL。

HHL溶液：使用磷酸缓冲液溶解HHL，使其终浓度为5mmol/L。

样品溶液：称取适量样品，用磷酸盐缓冲液所需浓度的溶液。

(2)ACE抑制率测定的色谱条件

检测波长：228nm；流速：1mL/min；流动相A：超纯水(含0.1％三氟乙酸)，流动相B：甲醇(含0.1％三氟乙酸)；进样量：10μL，手动进样。

(3)测定ACE抑制活性的方法

取120μL HHL底物溶液，加入20μL的样品混合均匀，在37℃恒温水浴中保温10min。然后加入10μL ACE酶液在37℃恒温水浴中反应30min，再加入150μL 1mol/L的HCl终止反应，得到反应液。该反应液利用HPLC进行分析，同时设置空白对照组。ACE抑制活性计算公式如下：

ACE抑制活性％＝(M-N)/M×100％

式中，M为对照组中马尿酸的峰面积，N为添加的样品组中马尿酸的峰面积。

(4)半抑制浓度的测定

按照ACE抑制肽体外检测方法测定其抑制活性，以浓度为横坐标，ACE抑制率为纵坐标绘成圆滑的曲线，从曲线中计算出IC50值

上述相关测试如表1所示，

表1

由表1可知，本发明中实施例1-5制备的核桃多肽具有很好的ACE(血管紧张素转化酶)抑制活性，其IC50值小于0.028mg/mL。需要注意的是，ACE浓度越高，导致血管收缩占优势，血压升高。抑制ACE的活性是治疗高血压的重要途径之一。

降压肽的抗氧化能力按照如下方法进行测定：

对DPPH自由基的清除作用

样品溶于双蒸水配制成一系列质量浓度梯度的样品溶液，取2mL各质量浓度的样品，加入到2mL 0.1mmol/L DPPH溶液(溶于无水乙醇)中。混合均匀后，室温下放置30min后在517nm测得各个质量浓度样品吸光度(Ai)。平行测定3次，取平均值。同时以2mL样品溶液加入2mL无水乙醇测得吸光度(Aj)。除此之外，在取2mL无水乙醇代替样品加入2mLDPPH自由基溶液测得空白吸光度(Ao)。按照式(I)计算DPPH自由基清除率。

上述相关测试如表2所示，

表2

由表2可知，本发明制备的核桃多肽具有很好的抗氧化活性，其对DPPH自由基的清除率高达92.8％。

以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。