治疗糖尿病的mRNA药物制剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及治疗糖尿病的mRNA药物制剂及其制备方法与应用。

背景技术

糖尿病是威胁人类生命健康的三大慢性非传染疾病之一，当胰腺产生不了足够的胰岛素或者人体无法有效地利用所产生的胰岛素时，就会出现糖尿病。根据是否依赖胰岛素，糖尿病又可被分为I型糖尿病和II型糖尿病。在中国，超过90％的糖尿病患者均为II型糖尿病患者。II型糖尿病又被称为非胰岛素依赖型糖尿病，成因是人体不能有效的利用胰岛素，即胰岛素抵抗，或者胰岛素代偿性分泌不足。

GLP-1全称为胰高血糖素样肽-1，是一种由人胰高血糖素基因编码，并由肠道L细胞分泌的肽样激素。GLP-1可以通过葡萄糖依赖的方式作用于胰岛β细胞上的β受体，进而促进胰岛素基因的转录，增加胰岛素的生物与合成和分泌。同时，GLP-1还可以刺激β细胞的增殖和分化，抑制β细胞的凋亡，进而增加胰岛β细胞的数量，抑制胰高血糖素的分泌，抑制食欲和摄食、延缓胃内容物的排空，有利于餐后血糖的降低及血糖水平的稳定。机体内具有生物活性的GLP-1受体激动剂主要为GLP-1，但极易被二肽基肽酶水解，半衰期不到5分钟，因此，半衰期持久的GLP-1受体激动剂是目前糖尿病类药物的研发方向之一。

mRNA又被称为信使RNA，以DNA的一条链为模板转录得到。mRNA携带遗传信息，能够直接指导蛋白质的合成。作为基因疗法的一种，与DNA相比，mRNA具有一系列的优势：首先，当mRNA进入细胞质中，即可启动蛋白质的翻译过程，效率远高于DNA；其次，mRNA不会插入到基因组中，只会瞬时表达所编码的蛋白，安全性较高；最后，mRNA可以通过体外转录过程形成，过程相对廉价，可以被快速应用于各种疗法。同时，理论上，mRNA可以表达任何蛋白，因此几乎可以治疗所有疾病，从制药行业角度讲，mRNA是一种非常具有潜力的候选药物，可以满足基因个体化治疗、肿瘤个体化治疗以及疫苗等相关需求。

mRNA纳米脂质体制剂已成功用于部分疫苗的制备，有的报道公开了改性的多核苷酸用于治疗耳部疾病和病症，所述方法包括给予受试者包含编码至少一种耳部多肽的多核苷酸的药物组合物，并且其中所述多核苷酸被配制在药学上可接受的载体或赋形剂中。虽然构建了mRNA，但其并未证实其制备成mRNA纳米脂质能有效的治疗疾病。还有报道公开了一种编码低密度脂蛋白受体(LDLR)的多核苷酸，其中所述LDLR在选自EGF-A结构域，细胞内结构域以及EGF结构域和细胞内结构域两者的结构域中包含至少一个突变，其中所述多核苷酸包含:(a)连接的核苷的第一区域，所述第一区域编码目的多肽，用于降低患者胆固醇水平。有的研究公开了个性化的用于癌症的疫苗，其包含重组多肽或编码所述多肽的核酸，所述重组多肽包含基于突变的新表位，所述新表位由癌症患者的肿瘤样品中的癌症特异性体细胞突变产生。

但是目前的mRNA制剂仍集中在抗肿瘤研究中，对治疗糖尿病的mRNA制剂少有涉及。由于mRNA制剂仍存在诸多挑战，如性质不稳定，RNA在体外的化学降解主要包括水解和氧化，水解主要是发生在mRNA分子骨架的磷酸二酯键。裸露的mRNA也极易在体内降解失活，难以在体内递送并有效表达治疗量的蛋白，以及可能带来的副作用均是目前严重挑战。因而，提供一种可用于治疗除病毒疫苗以外的mRNA制剂具有积极的临床价值，但仍面临诸多挑战。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供治疗糖尿病的mRNA药物制剂及其制备方法与应用。本发明所述的治疗糖尿病的药物为mRNA类药物，本发明利用递送载体将编码多肽类GLP-1受体激动剂的mRNA递送至体内，利用人体细胞表达GLP-1受体激动剂类多肽后，进一步将其分泌到机体细胞外，激活胰岛β细胞表面的GLP-1受体，分泌胰岛素，达到治疗糖尿病的目的。

本发明提供了一种mRNA药物制剂，其包括mRNA和递送脂质，所述mRNA包括编码GLP-1受体激动剂的核酸和编码IgG抗体Fc区的核酸。

本发明所述的mRNA药物制剂中,所述GLP-1受体激动剂选自如I)～III)中任意一种：

I)、如SEQ ID No.1～13任一项所示氨基酸序列的多肽中至少一种；

II)、与I)所述多肽具有至少60％同一性的多肽；

III)、在I)所述多肽的氨基酸序列中，经取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的多肽；

本发明编码mRNA的核苷酸序列为经人密码子优化后的核苷酸序列。一些实施例中，所述编码GLP-1受体激动剂的核酸序列选自如i)～iii)中任意一种：

i)、如SEQ ID No.14～26任一项所示核酸序列中至少一种；

ii)、与i)所述序列具有至少60％同一性的序列；

iii)、在i)所述序列中经取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的序列；

本发明所述的抗体IgG的Fc序列选自抗体IgG1、IgG2、IgG3与IgG4的重链的Fc段，包括铰链区、CH2区与CH3区。

本发明所述的mRNA药物制剂中，所述IgG抗体Fc区为A)～C)中任意一种：

A)、IgG1抗体的Fc区、IgG2抗体的Fc区、IgG3抗体的Fc区或IgG4抗体的Fc区；

B)、与A)具有至少60％同一性的片段；

C)、在A)所述Fc区中经取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的多肽。

本发明编码mRNA的核苷酸序列为经人密码子优化后的核苷酸序列。一些实施例中，所述编码IgG抗体Fc区的核酸序列选自如a)～c)中任意一种：

a)、如SEQ ID No.27～30任一项所示核酸序列中至少一种；

b)、与a)所述序列具有至少60％同一性的序列；

c)、在a)所述序列中经取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的序列。

本发明提供的药物制剂，其中的mRNA自5’端至3’端依次包括顺序连接的：5’-CAP、5’-UTR、signalpeptide、编码GLP-1受体激动剂的核酸、linker、编码IgG抗体Fc区的核酸、3’-UTR和PolyA。

所述药物制剂中的linker选自如①～③中任意一种：。

①、所述linker的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGSA、GSAGSAAGSGEF、GGGGGGGG、EGKSSGSGSESKST或KESGSVSSEQLAQFRSLD；

②、与①所述linker的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；

③、在①所述氨基酸的序列中，经取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的多肽。

本发明中，具有至少60％同一性的序列是指，与所述序列具有60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性的序列。

所述在序列中经取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的序列编码的蛋白与原序列编码蛋白具有相同或相似的功能。

本发明提供的药物制剂中，所述5’CAP选自Cap0(m7Gppp)、Cap1(m7GpppmN)、Cap2(m7GpppmNmN)或抗逆转帽类似物ARCA(3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G)。

本发明提供的药物制剂中，所述Poly A尾巴长度为20-200个胸腺嘧啶核苷酸，优选100、120、150、160个。

一些具体实施例中，本发明所述的药物制剂中所述mRNA中信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.31所示。

本发明还所述药物制剂中的递送载体可选自非病毒递送载体与病毒递送载体，非病毒递送载体选自可离子化脂质体、阳离子脂质体、阳离子聚合物、脂质纳米颗粒。本发明的活性成分mRNA递送也可以包括采用鱼精蛋白、白蛋白，或者采用病毒递送载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体。本发明实施例中，递送载体为阳离子脂质体或脂质纳米颗粒。

一些实施例中，本发明提供的递送脂质由阳离子脂质、PEG-lipid、两性磷脂和胆固醇组成：

所述阳离子脂质选自：3-(N，N-二油基氨基)-1，2-丙二醇(DOAP)、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺、N，N-二硬脂基-N，N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1-(2，3-二油基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTAP)、2，3-二油基氧基-N-[2(精胺-甲酰氨基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸酯(DOSPA)、1，2-二亚油基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、双十八基氨基甘氨酰基精胺(DOGS)、1，2-二亚麻基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(顺，顺式-9，12-十八二烯氧基)丙烷(CLinDMA)，优选3-(N，N-二油基氨基)-1，2-丙二醇、N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵、1，2-二亚麻基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷中的一种或两种以上的组合。以摩尔比计，其中阳离子脂质占所述递送脂质的45％～55％，优选46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％或54％；

所述PEG-lipid选自：PEG-磷脂、PEG-二月桂基氧基丙基、PEG-二烷氧基丙基、PEG-二酰甘油，优选PEG-二酰甘油、PEG-磷脂中的一种或两种以上的组合。以摩尔比计，其中PEG-脂质占所述递送脂质的1％～2％，优选1.2％、1.5％或1.8％；

所述两性磷脂选自：蛋黄磷脂酰胆碱(EPC)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二反油酰基-磷脂酰乙醇胺(DEPE)。优选二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺中的一种或两种以上的组合。以摩尔比计，其中两性脂质占所述递送脂质的9％～11％，优选9.5％、10％或10.5％。

以摩尔比计，所述递送脂质中胆固醇的含量为33.5％～42％，优选35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％。

一些实施例中，本发明提供的阳离子脂质、PEG-lipid、两性磷脂与胆固醇的摩尔比为(45～55)：(1～2)：(9～11)：(33.5～42)。

本发明所述药物的给药方式可以为经胃肠道给药或非经胃肠道给药，非经胃肠道给药选自舌下给药制剂、肌肉注射给药制剂、静脉给药制剂、直肠给药制剂、粘膜给药制剂以及呼吸道给药制剂，一些实施例中，选择肌肉注射、粘膜给药。

本发明药物制剂的溶剂选自生理盐水、pH7.2～pH 7.4的PBS溶液、含有0.05％～5％的壳聚糖或海藻酸钠的PBS溶液、或5％浓度的葡萄糖溶液。优选的，所述药物剂型为液体注射制剂，溶剂为生理盐水。

本发明所述的mRNA在药物制剂中的浓度为100μg/mL～3000μg/mL，优选的所述药物制剂中，mRNA的浓度为200μg/mL～2000μg/mL。

本发明还提供了药物制剂的制备方法，包括：将mRNA包裹进脂质递送，所述包裹采用薄膜水化法或有机溶剂蒸发法。

所述制备方法中，mRNA的制备包括以下步骤：

S1：合成包括中编码GLP-1多肽类受体激动剂与抗体Fc的融合mRNA的cDNA片段，并将其构建于RNA聚合酶启动子下游，获得重组质粒；

S2：将重组质粒转染进大肠杆菌中，获得表达外源重组质粒的大肠杆菌，大量扩增该大肠杆菌后，提取重组质粒，并以此为模板获得包括T7、T3或SP6启动子在内的线性化mRNA片段模板；

S3：构建mRNA细胞外转录体系反应，获得所述的活性成分mRNA；

优选的，在S3步骤中，反应体系完成后，加入DNase I反应，以去除反应体系中的DNA模板。在S3获得所述的编码GLP-1多肽类受体激动剂与抗体FC的融合mRNA后，还包括:采用磁珠法或亲和柱色谱法纯化所述的mRNA，并于-80℃或者常温或者4℃或者-20℃分装保存。

其中获得线性化mRNA模板的方法包括合成引物直接进行质粒PCR或者用酶切法将环状质粒切成线性化片段。

本发明mRNA细胞外转录体系的加帽方法包括但不限于以下两种：1.)使用帽结构类似物体外共转录加帽；2)在体外转录后，单独使用加帽酶进行加帽。

其中mRNA细胞外转录体系中所用的RNA Polymerase可以为T7、SP6或者T3 RNA聚合酶。

其中mRNA细胞外转录体系中的ATP、GTP、CTP和UTP可以为未修饰的核苷酸，或为经修饰后的核苷酸，包括但不限于m1A、m6A、m6A

本发明优选体外mRNA合成体系采用体外转录一步加帽法，以2000μL为例，反应体系如下所述：

表1一步加帽体外转录反应体系

优选的，所述mRNA的体外反应条件为37℃，24h。

优选的，在步骤3)获得所述的mRNA制剂后，还包括加入10μL DNase I将线性化DNA模板降解。

优选的，基于治疗糖尿病的药物制剂的制备方法，还包括通过薄膜分散法，将mRNA包裹进可离子化或阳离子脂质体制剂中。

本发明提供所述的mRNA、所述的多肽、所述的重组蛋白、所述的重组质粒或所述的药物制剂在制备治疗糖尿病药物中应用。

本发明还提供了一种治疗糖尿病的药物，其包括本发明所述的药物制剂。

本发明还提供了一种治疗糖尿病的方法，其包括给予本发明所述的药物。

本发明提供的基于mRNA的治疗糖尿病的药物，即体外合成的编码多肽类GLP-1受体激动剂与抗体Fc端的融合mRNA递送至体内能有效表达GLP-1受体激动剂，从而有效降低至正常血糖水平。相对于目前的GLP-1多肽药物或其Fc融合多肽，本发明的mRNA制剂生物利用度更高、体内药物反应迅速、作用更稳定、表达量高且表达持续时间长；另一方面，该mRNA制剂免疫原性低，能够快速刺激胰岛素生成，具有可靠的生物安全性，极大的提供了患者的用药舒适度和依从性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图：

图1示构建的mRNA结构示意图；

图2示编码不同Fc段与GLP-1受体激动剂融合的mRNA制剂对ADCC效应的影响；

图3示编码GLP-1、GLP-1-mIgG4 Fc、GLP-1-linker-mIgG4 Fc多肽的mRNA分别活化GLP-1受体能力；

图4示大鼠血清中IL-8和TNF-α表达量(pg/mL)；

图5示注射mRNA脂质体制剂后大鼠血糖浓度变化；

图6示注射mRNA的脂质体制剂的大鼠血液中多肽类GLP-1受体激动剂的含量。

具体实施方式

本发明提供了治疗糖尿病的mRNA药物制剂及其制备方法与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

表2发明中涉及的氨基酸序列和核酸序列

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1重组质粒的构建及扩增

1、合成SEQ ID No.10的多肽类GLP-1受体激动剂与部分位点突变后的抗体IgG4的Fc融合mRNA的cDNA序列。GLP-1受体激动剂与抗体Fc的多肽序列之间通过GGGGSGGGGSGGGGSA的柔性蛋白linker相连，GLP-1前端连有如SEQ ID No.31所述信号肽序列。目标mRNA所编码的融合多肽序列为记做GLP-1-linker-mIgG4 Fc。

2、通过SfiI酶切连接，将编码GLP-1受体激动剂多肽和抗体Fc段融合mRNA的DNA序列连接到PRSF载体质粒上。首先，进行载体与片段的酶切。载体与片段酶切反应体系为(50μL):DNA载体/片段：5μL；10x NEB Buffer：5μL；ddH

表3：酶切连接反应体系

3、将连接后的质粒转化进大肠杆菌中，并在固体培养基上继续培养过夜。首先，将商业化感觉态DH5α从-80℃冰箱中取出，并置于冰上融化；然后，取5μL连接后反应液，加入到100μL商业化感受态中，轻轻摇晃，使连接后反应液在感受态中均匀分布。将加入连接反应液后的感受态置于冰上30min后，42℃下热激90s，马上放回冰上2min；随后，向其中加入800μL的无抗性的LB培养基，置于摇床上，37℃下摇50min；最后，将重摇扩增后的感受态，于4000rpm转速下，轻转30s，倒掉上清，取EP管底部的沉淀均匀涂抹于LB上，倒置于培养箱中，过夜培养。

4、进行菌落PCR，选取条带大小正确的大肠杆菌菌落进行测序。首先，常温下随机挑选LB培养板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取单个菌落，标记好挑取的菌落。然后，将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的装有PCR管中或者96孔的PCR反应板中，菌落PCR反应液如下表4所示(反应体系25μL)。最后，将混有菌体的PCR混合物置于PCR仪中扩增。

表4菌落PCR反应体系

表5菌落PCR反应条件

5、对测序正确的大肠杆菌进行扩增，并大量提取质粒。首先，对测序后序列正确的菌落，向其中加入500μL的LB培养液，与37℃摇床中摇1h扩增；随后，将扩增后菌液加入到100mL的含卡那抗性的LB培养基中，37℃下过夜摇菌；最后，根据TIANGEN试剂盒说明书所述，提取无内毒素的质粒，将提取的质粒用NanoDrop测定浓度后发现，提取的质粒浓度为809ng/μL，并置于-20℃冰箱中进一步保存。

实施例2目标mRNA片段的体外转录(IVT)

1、目标片段PCR：在大量获得纯化质粒后，用高保真Taq酶将包括T7序列在内的编码目标mRNA的DNA序列扩增。PCR扩增体系见表6(反应体系50μL)。将扩增后的反应液加入1％的琼脂糖凝胶中，恒定100V电压下，电泳20min。

表6PCR反应体系

表7目标片段PCR反应条件

2、目标PCR片段纯化：首先，对在紫外灯下观察到的大小正确的片段切下，加入700μL GSB溶液在60℃水浴下溶胶10min；然后，溶解后的连同目标片段在内的胶溶液降温至室温后，倒入胶回收柱中；随后，12000rpm转速下，常温离心30s，采用Wash Buffer漂洗两次后，晾干胶回收柱；随后，向其中加入30μL的温度为60℃的ddH

3、采用一步法加帽技术体外合成需要的目标mRNA：首先，将上述PCR产物以及mRNA的商业化Cap1帽类似物CleanCap AG以及T7 RNA聚合酶一起加入到100μL的RNase-Free的EP管中，具体反应体系见表8(10μL)；随后，将上述反应体系置于37℃下，反应3h。

表8一步法体外加帽转录体系

4、mRNA的纯化：对所合成的mRNA采用寡聚(dT)-纤维素柱层析法进行纯化处理，处理过程如下：首先，预处理寡聚(dT)-纤维素柱：(1)、用0.1mol/L NaOH悬浮0.5g～1.0goligo(dT)纤维素。(2)、将悬浮液装入填有经DEPC水处理，高压灭菌后的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床约0.5mL～1.0mL，用3倍柱床体积的无RNase的灭菌双蒸水冲洗oligo(dT)纤维素。(3)、随后，用3～5倍柱床洗涤缓冲液I冲洗oligo(dT)纤维素，直到流出液的pH值小于8.0。(4)、将处理好的oligo(dT)纤维素从巴斯德吸管倒出，用适当的柱床洗涤缓冲液I悬浮，浓度约为0.1g/mL，保存在4℃待用；其次，把总RNA液转到适合的无RNase离心管中，测定总RNA的浓度，用RNase-Free的双蒸水稀释至0.55mg/mL。(5)、把RNA溶液置于65℃水浴加热5min，然后迅速插在冰上冷却。(6)、加入一定体积5mol/L NaCl使RNA溶液中盐的浓度调至0.5mol/L；最后，纯化反应液中的mRNA：(7)、用移液器重新悬浮oligo(dT)-纤维素，取适量的oligo(dT)-纤维素到RNA样品中，盖上盖子，颠倒数次将oligo(dT)-纤维素与体外转录反应液混匀，于37℃水浴保温并温和摇荡15min。oligo(dT)-纤维素与体外转录反应液的体积/质量比为1:1，即，总量约0.1mg的mRNA需要1mL的oligo(dT)-纤维素。(8)、取1个5ml注射器，用经过高温灭菌的玻璃棉塞紧注射器前端，注射器固定在无RNase的支架上，把oligo(dT)-纤维素/RNA悬浮液加入注射器中，把塞子推到底部，收集流出的液体，即把含有未结合上的RNA液体收集到无RNase的离心管中。(9)、用注射器慢慢吸收洗涤缓冲液，温和振荡，充分悬浮mRNA-oligo(dT)-纤维素，推动塞子，用RNase-Free的离心管收集洗出液。测定每一管的OD

经纯化制备得到目标mRNA，该目标mRNA的5’端依次连接信号肽、5’-UTR以及5’-CAP，3’端依次连接3’-UTR以及长度为150bp的poly A，mRNA的ORF区序列如表2。该目标mRNA编码的多肽序列为GLP-1-linker-mIgG4 Fc。

实施例3多肽类GLP-1受体激动剂与抗体Fc段融合mRNA的脂质体制剂的制备

1、将阳离子脂材、PEG-lipid、两性磷脂与胆固醇按表8处方配比的脂材分别溶于圆底烧瓶的氯仿中，在水浴温度为50℃～70℃条件下，旋转蒸发，使上述脂材在圆底烧瓶底部均匀成膜；

2、向成膜后的圆底烧瓶中加入上述实施例2制备的mRNA以及pH为5.5的柠檬酸溶液，将薄膜经震荡分散在mRNA溶液中，得到多室脂质体；

3、将上述得到的多层脂质体溶液进行探头超声处理5min～20min，超声工作时间为1s～5s，间歇2s～6s，工作功率为220W，得到粒径相对均一的单层脂质体；

4、将上述得到的单层脂质体过100nm的滤膜，在50℃～70℃进行挤压处理，得到粒径均一的装载有编码多肽类GLP-1受体激动剂与抗体Fc融合mRNA的脂质体制剂；

5、对上述得到的装载有目标mRNA的脂质体制剂置于微型凝胶离心柱中，常温下，以2000rpm/min的速度离心5min，浓缩纯化制备得到的脂质体制剂，并用0.9％的生理盐水进行稀释，使制剂中活性mRNA最终浓度为2mg/mL～5mg/mL。分别制得处方1～4的脂质体制剂。

表9脂质材料处方配比

实施例4多肽类GLP-1受体激动剂的自扩增mRNA的脂质体制剂的表征

1、制备得到的脂质体的粒径电位的测定。取实施例3处方1中制备的脂质体，用1x的PBS百倍稀释后。先用Mastersizer 3000测定PBS测定样品背景，背景测定后，加入分散好的样品当分散体系的浓度稳定后开始测定制备得到装载有目标mRNA的脂质体的电位和粒径。最终测定得到的阳离子脂质体粒径分布在100nm～120nm之间，Zeta电位值约为(+10mV)～(+14mV)左右；

2、制备得到的脂质体对mRNA的包封率测定。将实施例3制备得到的脂质体制剂(处方1～4)中加入等量的甲醇-氯仿(体积比1:2)混匀，进行破乳，同时，采用RiboGreen测定脂质体对目标mRNA的包封率。具体测定步骤如下：(1)、准备好破乳后脂质体，并置于冰槽里。随后，设定好荧光分光光度仪的激发波长485nm，发射波长530nm；(2)、将-20℃的冰箱试剂盒中的ReagentA染色液室温下融化，并向500μL的ReagentB稀释液中加入2.5μL的ReagentA，混匀后，用锡纸包裹，置于暗室中备用；(3)、将5个1.5mL的EP管分别标注1/2/3/4/5号管，并分别加入100μL的ReagentB。随后，取100μL的ReagentC到一号管中，混匀，并依次梯度稀释，最终使得1/2/3/4/5号管中RNA总量分别变为1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL、0μg/mL的浓度。并移动100μL上述配好的Reagent A与Reagent B混合液到比色皿中，室温下，孵育5分钟，避免光照，并将其放于荧光分光光度仪中测读，获得RFU值。将不同梯度浓度的RNA标准品分别与对应的RFU做标准曲线；(4)、重新取100μL配置好的ReagentA和ReagentB的染色工作液到新的比色皿中，并向其中加入破乳后的脂质体溶液，后续步骤与步骤3相同，最终获得破乳后脂质体的RFU值，并根据制备的标准曲线。当加入2mg/mL的mRNA后，制备得到的脂质体的mRNA包封浓度是1.88mg/mL，最终计算得到脂质体对GLP-1受体激动剂-抗体Fc融合mRNA的包封率，结果见表10。

表10包封率测定结果

实施例5基于多肽类GLP-1受体激动剂-抗体Fc段的融合mRNA的脂质体制剂的细胞蛋白表达水平鉴定

1、将HEK-293T细胞提前一天接种于6孔板中，采用含有10％FBS的高糖DMEM过夜培养，使其第二天贴壁并长至70％汇合度；

2、将上述制备得到的装载有多肽类GLP-1受体激动剂-抗体Fc融合mRNA的脂质体制剂(实施例3处方1)转染上述贴壁细胞中，并于37℃培养箱中静置6h后更换新鲜培养液；

3、取上述细胞培养液上清，采用抗体Fc段的Elisa试剂盒，根据Elisa试剂盒说明书进行操作，测定细胞所分泌的目标GLP-1受体激动剂类多肽的含量，最终测得6孔板中GLP-1受体激动剂类多肽含量为300pg/mL。

实施例6基于多肽类GLP-1受体激动剂-抗体Fc段的融合mRNA的脂质体制剂的ADCC效果体外测定

1、按照实施例1～2所述方法，分别制备编码下列融合多肽的目标mRNA：SEQ IDNo.10的多肽类GLP-1受体激动剂与IgG1的Fc段、IgG4的Fc段以及突变后的抗IgG4的Fc段，通过的柔性蛋白linker(GGGGSGGGGSGGGGSA)相连上述融合多肽。上述融合多肽分别标记为GLP-1-linker-IgG1 Fc、GLP-1-linker-IgG4 Fc、GLP-1-linker-mIgG4 Fc，其氨基酸序列分别见表2。

其中编码GLP-1-linker-mIgG4 Fc的融合多肽的目标mRNA参见实施例2，编码GLP-1-linker-IgG1 Fc融合多肽或编码GLP-1-linker-IgG4 Fc融合多肽的目标mRNA的ORF区序列如表2所示，上述目标mRNA除ORF区序列不同，其余信号肽、5’-UTR、5’-Cap，3’-UTR以及Poly A序列均与实施例2目标mRNA相应部分相同。

然后将上述3种目标mRNA参照实施3处方1的配方及制备方法制备纳米脂质体。

2、按照实施例5所述方法，分别将上述制备得到的多肽类GLP-1受体激动剂-抗体Fc融合mRNA的脂质体制剂分别转染进细胞，并分别收集连续培养一周含有GLP-1-linker-IgG1 Fc、GLP-1-linker-IgG4 Fc、GLP-1-linker-mIgG4 Fc融合多肽的细胞上清液，使用ProteinA亲和层析柱进行亲和层析,由于亲和层析后的蛋白仍然含有降解产物和多聚体,因此进一步进行疏水层析。经两步纯化获得的融合蛋白,经HPLC分析和SDS-PAGE分析,显示蛋白纯度高于90％。分别以抗GLP-1抗体和抗IgG Fc抗体为检测抗体,对纯化获得的GLP-1-Fc融合多肽进行Western-blotting检测后发现细胞分泌的融合蛋白具有较好的完整性。用pH7.4的PBS调整纯化后的GLP-1-Fc融合多肽浓度为1mg/mL，并分别将上述三种植被得到的GLP-1-linker-Fc融合多肽用PBS稀释至250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.3μg/mL、15μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL备用；

3、构建慢病毒pWSLV07-EF-1α-GLP-1receptor-T2A-CMV-luciferase载体，并将其连同包装质粒共转进293T细胞中进行病毒包装；72h后收集上清培养液，并向其中加入1/5体积的PEG

4、步骤3获得的高表达GLP-1receptor与luciferase的HeLa细胞系与从人血细胞中分离得到的人外周血单核细胞共培养，并分别向其中加入实施例6中2)步骤得到的三组融合多肽的稀释液。在此共培养体系中，高表达GLP-1receptor与luciferase的HeLa细胞系作为ADCC的靶细胞，同时人血细胞中分离得到的人外周血单核细胞作为ADCC的效应细胞。分别向共培养体系中加入不同组别与不同浓度的GLP-1-Fc融合多肽一定时间后，加入细胞裂解液后裂解细胞后，向其中加入底物D-Luciferin，并通过微孔板发光检测仪检测靶细胞OD值，即高表达GLP-1receptor与luciferase的HeLa细胞，裂解所产生的luciferase与加入D-Luciferin反应释放的化学发光强度，luciferase的发光强度值即反应了采用不同Fc段的GLP-1linker-Fc融合多肽的ADCC效应。

具体结果见附图2，结果显示，编码GLP-1-linker--IgG1 Fc融合多肽的mRNA所产生的ACDD效应强于编码GLP-1-linker--IgG4 Fc或GLP-1-linker--mIgG4 Fc融合多肽的mRNA。经目标mRNA在体内表达后，部分位点突变后IgG4 Fc片段融合多肽的低ADCC效应代表Fc与位于效应细胞表面的Fc受体之间的亲和力较低，这也就意味着剂量依赖的细胞毒性的降低，编码GLP-1-linker--IgG4 Fc或GLP-1-linker-mIgG4 Fc融合多肽的mRNA在体内用药时会具有更低的副作用。

实施例7GLP-1受体激动剂与IgG Fc段中间linker对GLP-1受体激动剂功能的影响

1、按照实施例6中(1)所述方法分别制备并纯化编码下述多肽的目标mRNA：GLP-1多肽、未经linker连接的GLP-1-mIgG4 Fc多肽以及经linker序列(GGGGSGGGGSGGGGSA)连接后的GLP-1-Linker-mIgG4 Fc多肽序列，分别标记为GLP-1、GLP-1-mIgG4 Fc、GLP-1-linker-mIgG4 Fc。

其中编码GLP-1-linker-mIgG4 Fc的融合多肽的目标mRNA参见实施例2，编码GLP-1多肽或未经linker连接的GLP-1-mIgG4 Fc多肽的目标mRNA的ORF区序列分别如表2，上述目标mRNA除ORF区序列不同，其余信号肽、5’UTR、5’Cap，3’UTR以及Poly A序列均与实施例2目标mRNA相同。然后将上述3种目标mRNA参照实施3处方1的配方及制备方法制备纳米脂质体。按照实施例6步骤(2)的方法分别将上述制备得到的mRNA的脂质体制剂分别转染进细胞。

2、按照实施例6中(3)所述方法，制备基于lacZ高表达cAMP应答的CRE-BLAM报告系统且高表达GLP-1receptor的稳转293T细胞系；

3、将上述步骤(2)的稳转报告293T细胞系接种于24孔板中，27℃下培养过夜。待细胞贴壁后，分别向其中加入用无血清DMEM稀释的10nM的GLP-1、GLP-1-mIgG4 Fc、GLP-1-linker-mIgG4 Fc。5h后，向其中加入20μL的底物内酰胺酶，并在加入底物1h后，测定所发出的荧光，用来表示被激活的aAMP的量，同时即可反映GLP-1受体激动剂与GLP-1受体作用所产生的信号强度。

结果如附图3所示。实验结果表明，当不通过合适的linker，编码GLP-1与IgG Fc段直接相连的融合多肽的mRNA时，该mRNA在体内GLP-1激活GLP-1受体的能力反而是下降的；当编码GLP-1与IgG Fc段通过合适linker相连的融合多肽的mRNA时，该mRNA在体内GLP-1激活GLP-1受体的能力是单独编码GLP-1的mRNA的4倍。

实施例8基于多肽类GLP-1受体激动剂-抗体Fc融合mRNA的脂质体药物制剂的体内免疫原性评价

1、在SPF条件线下的SD大鼠在12h光照，12h黑暗循环条件下的通气笼子中进行饲养；

2、对不同大鼠在相同部位肌肉注射多肽类GLP-1受体激动剂的mRNA脂质体(实施例2处方1)的生理盐水注射剂，对照组注射同等剂量的生理盐水、以及市售司美格鲁肽注射液；

3、24h后，对不同组别的大鼠进行眼眶取血，并分离血清后采用Elisa试剂盒分别测定血清中IL-8和TNF-α的浓度。

测定结果如附图4所示，从结果可以看出，制备得到的编码多肽类GLP-1受体激动剂-抗体Fc的融合mRNA的脂质体药物制剂与市售司美格鲁肽的免疫原性相差不大，无统计学意义的差异。

实施例9基于编码多肽类GLP-1受体激动剂-抗体Fc融合的mRNA的脂质体药物制剂的体内效价评价

1、将4W～6W的SPF级别的重量为160g～200g的雄性大鼠于12h光照、12h黑暗循环条件下通气笼中培养；

2、对上述大鼠进行腹腔注射链脲佐霉素7天，并辅佐以高糖饮食，7天后测定其体重与血糖浓度，确认大鼠已患有糖尿病，建立大鼠的II型糖尿病疾病模型；

3、向模型大鼠体内肌肉注射实施例2处方1的mRNA脂质体药物制剂，使每次每只大鼠最终注射活性成分mRNA终浓度为200μg/只；

4、注射制剂后，每天对大鼠进行眼眶取血，3000rpm/min下离心10min，分离血清，备用。在测定大鼠血清中的血糖蛋白时，首先，配置邻苯甲胺、55.56mmol/L的标准葡萄糖储存液与5.56mmol/L的标准葡萄糖应用液；随后，取10mL的3支试管，在均加入5mL邻甲苯胺试剂后，分别向三支试管加入0.1mL的蒸馏水、标准葡萄糖应用液以及血清样本，并置于电热恒温箱中煮沸20min，取出后冷却；最后，采用721型分光光度计，在630nm波长下，使用光径为1cm的比色杯，空白管调零，分别读取样品管和标准管的吸光度值A。最终，样本的血糖浓度(mmol/L)＝(A样本/A标准品)*5.56mmol/L。

结果如附图5所示，结果表明注射编码多肽类GLP-1受体激动剂-抗体Fc融合mRNA的脂质体药物制剂的大鼠血糖浓度逐渐下降，最后逐渐恢复正常稳态水平。

实施例10基于编码多肽类GLP-1受体激动剂-抗体Fc融合的mRNA的脂质体制剂的体内半衰期及生物利用度

1、在SPF条件线下的SD大鼠在12h光照，12h黑暗循环条件下的通气笼子中进行饲养；

2、对不同的大鼠在相同部位肌肉注射浓度为200μg/mL的编码多肽类GLP-1受体激动剂-抗体Fc融合mRNA的脂质体(实施例2处方1)的生理盐水注射剂，对照组注射同等剂量的市售司美格鲁肽注射液；

3、每天对大鼠进行眼眶取血，分离血清，通过Elisa试剂盒，按照Elisa试剂盒说明书，测定血清中GLP-1的含量。

结果如附图6所示，注射蛋白类药物的大鼠血清中的相应GLP-1蛋白水平急速下降，14天时下降至初始时的1/3以下，注射编码多肽类GLP-1受体激动剂-抗体Fc融合的mRNA的制剂能在14天内能维持较高水平GLP-1受体激动剂的表达，不会出现明显的下降。因此，本发明的mRNA脂质体制剂能够在较长的时间内持续表达GLP-1蛋白，发挥长效作用。

由上述实施例可知，本发明提供的基于多肽类GLP-1受体激动剂-抗体Fc融合mRNA的药物作用持续时间长、起效时间短、副作用低，能够显著降低II型糖尿病患者血糖水平。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 北京医院

<120> 治疗糖尿病的mRNA药物制剂及其制备方法与应用

<130> MP21038377

<160> 31

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly

20 25 30

<210> 2

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Thr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly

20 25 30

<210> 3

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Tyr Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys

1 5 10 15

Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Lys

20 25 30

Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Leu Thr Gln

35 40

<210> 4

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Tyr Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys

1 5 10 15

Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys

20 25 30

<210> 5

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys

35 40

<210> 6

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly

20 25 30

<210> 7

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35

<210> 8

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly

20 25 30

<210> 9

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30

<210> 10

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly

20 25 30

<210> 11

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn

1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp

<210> 12

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

His Gly Glu Gly Ser Phe Ser Ser Glu Leu Ser Thr Ile Leu Asp Ala

1 5 10 15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr

20 25 30

Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys

35

<210> 13

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly

20 25 30

<210> 14

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

catggcgaag gcacctttac cagcgatgtg agcagctatc tggaaggcca ggcggcgaaa 60

gaatttattg cgtggctggt gcgcggccgc ggc 93

<210> 15

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

catgcggaag gcacctttac cagcgatgtg agcagcaccc tggaaggcca ggcggcgaaa 60

gaatttattg cgtggctggt gcgcggccgc ggc 93

<210> 16

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tatgcggaag gcacctttat tagcgattat agcattgcga tggataaaat tcatcagcag 60

gattttgtga actggctgct ggcgcagaaa ggcaaaaaaa acgattggaa acataacctg 120

acccag 126

<210> 17

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tatgcggaag gcacctttat tagcgattat agcattgcga tggataaaat tcatcagcag 60

gattttgtga actggctgct ggcgcagaaa 90

<210> 18

<211> 132

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

catggcgaag gcacctttac cagcgatctg agcaaacaga tggaagaaga agcggtgcgc 60

ctgtttattg aatggctgaa aaacggcggc ccgagcagcg gcgcgccgcc gagcaagaag 120

aagaagaaga ag 132

<210> 19

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

catgcggaag gcacctttac cagcgatgtg agcagctatc tggaaggcca ggcggcgaaa 60

gaatttattg cgtggctggt gcgcggccgc ggc 93

<210> 20

<211> 117

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

catggcgaag gcacctttac cagcgatctg agcaaacaga tggaagaaga agcggtgcgc 60

ctgtttattg aatggctgaa aaacggcggc ccgagcagcg gcgcgccgcc gccgagc 117

<210> 21

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

catggcgaag gcacctttac cagcgatgtg agcagctatc tggaaggcca ggcggcgaaa 60

gaatttattg cgtggctggt gcgcggccgc ggc 93

<210> 22

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

catggcgaag gcacctttac cagcgatgtg agcagctatc tggaaggcca ggcggcgaaa 60

gaatttattg cgtggctggt gaaaggccgc 90

<210> 23

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

catggcgaag gcacctttac cagcgatgtg agcagctatc tggaagaaca ggcggcgaaa 60

gaatttattg cgtggctggt gaaaggcggc ggc 93

<210> 24

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

catggcgatg gcagctttag cgatgaaatg aacaccattc tggataacct ggcggcgcgc 60

gattttatta actggctgat tcagaccaaa attaccgat 99

<210> 25

<211> 117

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

catggcgaag gcagctttag cagcgaactg agcaccattc tggatgcgct ggcggcgcgc 60

gattttattg cgtggctgat tgcgaccaaa attaccgata agaagaagaa gaagaag 117

<210> 26

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

catgcggaag gcacctttac cagcgatgtg agcagctatc tggaaggcca ggcggcgaaa 60

gaatttattg cgtggctggt gaaaggccgc ggc 93

<210> 27

<211> 696

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gaaccgaaaa gctgcgataa aacccatacc tgcccgccgt gcccggcgcc ggaactgctg 60

ggcggcccga gcgtgtttct gtttccgccg aaaccgaaag ataccctgat gattagccgc 120

accccggaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgagccatg aagatccgga agtgaaattt 180

aactggtatg tggatggcgt ggaagtgcat aacgcgaaaa ccaaaccgcg cgaagaacag 240

tataacagca cctatcgcgt ggtgagcgtg ctgaccgtgc tgcatcagga ttggctgaac 300

ggcaaagaat ataaatgcaa agtgagcaac aaagcgctgc cggcgccgat tgaaaaaacc 360

attagcaaag cgaaaggcca gccgcgcgaa ccgcaggtgt ataccctgcc gccgagccgc 420

gatgaactga ccaaaaacca ggtgagcctg acctgcctgg tgaaaggctt ttatccgagc 480

gatattgcgg tggaatggga aagcaacggc cagccggaaa acaactataa aaccaccccg 540

ccggtgctgg atagcgatgg cagctttttt ctgtatagca aactgaccgt ggataaaagc 600

cgctggcagc agggcaacgt gtttagctgc agcgtgatgc atgaagcgct gcataaccat 660

tatacccaga aaagcctgag cctgagcccg ggcaaa 696

<210> 28

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gaacgcaaat gctgcgtgga atgcccgccg tgcccggcgc cgccggtggc gggcccgagc 60

gtgtttctgt ttccgccgaa accgaaagat accctgatga ttagccgcac cccggaagtg 120

acctgcgtgg tggtggatgt gagccatgaa gatccggaag tgcagtttaa ctggtatgtg 180

gatggcgtgg aagtgcataa cgcgaaaacc aaaccgcgcg aagaacagtt taacagcacc 240

tttcgcgtgg tgagcgtgct gaccgtggtg catcaggatt ggctgaacgg caaagaatat 300

aaatgcaaag tgagcaacaa aggcctgccg gcgccgattg aaaaaaccat tagcaaaacc 360

aaaggccagc cgcgcgaacc gcaggtgtat accctgccgc cgagccgcga agaaatgacc 420

aaaaaccagg tgagcctgac ctgcctggtg aaaggctttt atccgagcga tattagcgtg 480

gaatgggaaa gcaacggcca gccggaaaac aactataaaa ccaccccgcc gatgctggat 540

agcgatggca gcttttttct gtatagcaaa ctgaccgtgg ataaaagccg ctggcagcag 600

ggcaacgtgt ttagctgcag cgtgatgcat gaagcgctgc ataaccatta tacccagaaa 660

agcctgagcc tgagcccggg caaa 684

<210> 29

<211> 837

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gaactgaaaa ccccgctggg cgataccacc catacctgcc cgcgctgccc ggaaccgaaa 60

agctgcgata ccccgccgcc gtgcccgcgc tgcccggaac cgaaaagctg cgataccccg 120

ccgccgtgcc cgcgctgccc ggaaccgaaa agctgcgata ccccgccgcc gtgcccgcgc 180

tgcccggcgc cggaactgct gggcggcccg agcgtgtttc tgtttccgcc gaaaccgaaa 240

gataccctga tgattagccg caccccggaa gtgacctgcg tggtggtgga tgtgagccat 300

gaagatccgg aagtgcagtt taaatggtat gtggatggcg tggaagtgca taacgcgaaa 360

accaaaccgc gcgaagaaca gtataacagc acctttcgcg tggtgagcgt gctgaccgtg 420

ctgcatcagg attggctgaa cggcaaagaa tataaatgca aagtgagcaa caaagcgctg 480

ccggcgccga ttgaaaaaac cattagcaaa accaaaggcc agccgcgcga accgcaggtg 540

tataccctgc cgccgagccg cgaagaaatg accaaaaacc aggtgagcct gacctgcctg 600

gtgaaaggct tttatccgag cgatattgcg gtggaatggg aaagcagcgg ccagccggaa 660

aacaactata acaccacccc gccgatgctg gatagcgatg gcagcttttt tctgtatagc 720

aaactgaccg tggataaaag ccgctggcag cagggcaaca tttttagctg cagcgtgatg 780

catgaagcgc tgcataaccg ctttacccag aaaagcctga gcctgagccc gggcaaa 837

<210> 30

<211> 687

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gaaagcaaat atggcccgcc gtgcccgagc tgcccggcgc cggaatttct gggcggcccg 60

agcgtgtttc tgtttccgcc gaaaccgaaa gataccctga tgattagccg caccccggaa 120

gtgacctgcg tggtggtgga tgtgagccag gaagatccgg aagtgcagtt taactggtat 180

gtggatggcg tggaagtgca taacgcgaaa accaaaccgc gcgaagaaca gtttaacagc 240

acctatcgcg tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcatcagg attggctgaa cggcaaagaa 300

tataaatgca aagtgagcaa caaaggcctg ccgagcagca ttgaaaaaac cattagcaaa 360

gcgaaaggcc agccgcgcga accgcaggtg tataccctgc cgccgagcca ggaagaaatg 420

accaaaaacc aggtgagcct gacctgcctg gtgaaaggct tttatccgag cgatattgcg 480

gtggaatggg aaagcaacgg ccagccggaa aacaactata aaaccacccc gccggtgctg 540

gatagcgatg gcagcttttt tctgtatagc cgcctgaccg tggataaaag ccgctggcag 600

gaaggcaacg tgtttagctg cagcgtgatg catgaagcgc tgcataacca ttatacccag 660

aaaagcctga gcctgagcct gggcaaa 687

<210> 31

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp

20