用于温和检测5-羟甲基胞嘧啶的试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于温和检测5-羟甲基胞嘧啶的试剂盒及其检测方法。

背景技术

DNA甲基化作为研究最广泛的表观遗传修饰，具有多种生理和病理功能,对哺乳动物的发育极其重要。随着5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）和TET酶的发现，去甲基化已成为科学研究的焦点。TET家族蛋白可以将5-甲基胞嘧啶（5mC）甲基上的氢氧化为羟基从而形成5hmC，5hmC可以被进一步氧化为5-醛基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC）,在TDG和碱基修复的作用下去除表观修饰。5hmC不仅是主动去甲基化过程的中间体，而且具有自身的特点和功能。大多数5hmC是稳定的DNA修饰，存在高度的组织特异性，在胚胎干细胞和脑组织中富集。值得注意的是，与正常组织相比，在人类癌症中5hmC的水平显著减少，被认为是诊断癌症的一种表观遗传标记物。此外，5hmC不仅在神经发育和疾病中发挥重要作用，而且参与染色质结构的调节和基因表达。在神经退行性疾病中5hmC的含量与健康对照相比有显著差异。但由于方法限制5hmC在癌症和神经退行性疾病中的作用机制和生物功能仍不清楚。鉴于5hmC在表观遗传调控机制和包括癌症在内的多种疾病中早期诊断中的重要意义，急需发展简单、快速、温和地检测方法应用于疾病的早期诊断和深入的机制研究。

高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)法被广泛用于测定胞嘧啶残基中5hmC的全基因组百分比含量。但是这些方法只能检测全基因组DNA中5hmC的总含量，不能提供任何5hmC的序列信息和位点分布。亲和富集或化学标记辅助测序策略可以对基因组DNA中的5hmC进行近似定位，然而，这些富集片段通常包含几百到上千个碱基，不能给出5hmC在DNA片段中的准确位置。由于5mC和5hmC都抗亚硫酸氢盐的脱氨反应，因此经典亚硫酸氢盐的方法无法将两者进行区分。因此在此基础上发展了氧化亚硫酸氢盐测序(oxBS-seq)和tet辅助的亚硫酸氢盐测序(TAB-seq)可以确定每个5hmC位点的位置和相对丰度。然而这些方法中的亚硫酸氢盐处理需要高热和高碱的条件，会造成DNA序列断裂，不适用于少量样品的检测。最近发展了需化学预处理及选择性标记就可以直接区分5hmC、C和5mC的纳米孔技术，无需对目标序列进行扩增就可以实现单分子检测，蛋白质纳米孔测序也被发展为第三代测序技术。但该方法定量分析仍是一个巨大的挑战。这些方法可以在单碱基分辨率下精确定位5hmC的位点，但对于少数有重要生理和病理功能的已知位点的5hmC检测，测序需要极高的深度，测序技术对仪器和数据分析要求高不适合应用于普通实验室和临床研究。因此，简便、快速无亚硫酸氢盐处理地定量分析基因组DNA中已知特定位点的5hmC，对进一步揭示其生物学功能和疾病诊断具有重要意义。

近年来，应用硼酸修饰辅助的PCR法，葡萄糖修饰辅助的连接滚环法和氧化亚硫酸氢盐辅助的连接滚环法都无法实现简单、快速地检测特定位点5hmC。我们也报道了HpaII辅助连接-聚合酶链反应(PCR)，它具有高的灵敏度和特异性，仍需要氧化亚硫酸氢盐处理，且操作复杂，耗时长。在大量C和5mC的背景干扰下如何简单，快速、低损地对特定位点5hmC进行精确定量仍一个巨大的挑战。

鉴于此，申请此专利。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于温和检测5-羟甲基胞嘧啶的试剂盒及其检测方法，本发明的检测方法温和高效，能检测低至200aM的5hmC，特异性达到1%。

本发明的目的是提供一种用于温和检测5hmC的试剂盒。

本发明的另一目的是提供上述试剂盒用于无亚硫酸氢盐处理的5hmC检测方法。

根据本发明的具体实施方式的用于温和检测5hmC的试剂盒，所述试剂盒包括：封闭反应液、APOBEC脱氨基转化液、吡啶硼烷转化液、连接反应液和扩增反应液；所述连接反应液包括探针A和探针B；所述探针A的序列如SEQ ID NO:1所示；所述探针B的序列如SEQ IDNO:2所示。

进一步的，所述封闭反应液包括cutsmart缓冲液、UDP-Glu，以及T4-βGT，去离子水；优选的，所述封闭反应液包括 10× cutsmart 缓冲液1μL、50×UDP-Glu 1μL，以及10UT4-βGT 1μL，去离子水2μL，总体积5μL；所述1×cutsmart 缓冲液包括5 mM醋酸钾，2 mMtris-醋酸，1 mM醋酸镁和10 μg/ml BSA, pH为7.9。

进一步的，所述APOBEC脱氨基转化液包括APOBEC脱氨基缓冲液，牛血清白蛋白；优选的，所述APOBEC脱氨基转化液包括APOBEC脱氨酶0.2μL、10×APOBEC脱氨基缓冲液1μL，牛血清白蛋白0.1μL，总体积1.3μL。

进一步的，所述吡啶硼烷转化液包括醋酸钠溶液和吡啶硼烷；优选的，所述吡啶硼烷转化液包括600mM的pH=4.3的醋酸钠溶液1μL和1M吡啶硼烷0.1μL,总体积1.1μL。

进一步的，所述连接反应液包括探针A、探针B、Amp连接酶、Amp连接酶缓冲溶液和去离子水；优选的，所述连接反应液包括20nM的探针A 1μL，20nM的探针B 1μL，5U的Amp连接酶0.2μL，10×Amp连接酶缓冲溶液1μL和去离子水5.8μL，所述的，10×Amp连接酶缓冲溶液包括200 mM Tris-HCl,250 mM KCl, 100 mM MgCl

进一步的，所述LAMP反应混液包括上游引物FIP、下游引物BIP、dNTP、Bst DNA聚合酶、ThermoPol反应缓冲溶液、甜菜碱、SYBR Green I和去离子水；优选的，所述LAMP反应混液包括10mM上游引物FIP 0.5μL，10mM 下游引物BIP 0.5μL，2.5mM的dNTP 0.8μL，8U的BstDNA聚合酶(大片段)0.5μL，10×ThermoPol反应缓冲溶液1μL，5M的甜菜碱2μL，50×SYBRGreen I 0.2μL和去离子水2.5μL，总体积8μL。

根据本发明的具体实施方式的定量检测基因组中5hmC的方法，包括如下步骤：

（1）封闭5hmC：准备封闭反应溶液和DNA模板，将封闭反应溶液放入待测样品中，进行封闭反应；

（2）脱氨转化：步骤（1）封闭反应结束后，将反应快速转移到 PCR 管架上冷却；将APOBEC脱氨基转化液加入到封闭反应体系，进行脱氨反应；

（3）吡啶硼烷转化：将吡啶硼烷转化液加入到步骤（2）脱氨转化后的反应溶液中，放入恒温混匀仪中进行反应，反应结束后应用UNlQ-10柱式通用DNA纯化试剂盒对DNA纯化；

（4）连接反应：将步骤（3）纯化后的DNA样品加入到连接反应混液中，加入目标序列后混匀，加热使dsDNA变性，在合适的温度下以目标序列为模板在连接酶的催化下连接探针A和探针B；

（5）LMAP扩增反应：取步骤（4）的连接产物加到LAMP反应混液中，LAMP反应的混液混匀后立即转到StepOne Real-Time PCR系统进行恒温反应，实时荧光强度间隔1分钟检测一次。

进一步的，步骤（1）中，将5μL封闭反应溶液放入2μL待测样品中，进行封闭反应；反应条件是在 37℃下孵育 2 小时；步骤（2）中，加入1.3μL的脱氨溶液进行脱氨反应，反应条件为：在2小时内将温度从4℃梯度升温到50℃进行孵育，50℃持续10分钟；步骤（3）中，加入1.1μL的吡啶转化液，反应条件为：恒温混匀仪设置转速850 rpm，37℃孵育16 小时；步骤（4）中，将取1μL反应结束后的产物加入9μL连接反应中，进行连接反应，连接条件为：在90℃加热3分钟，使dsDNA高温变性，之后在45℃反应15分钟。步骤（5）中，取2μL连接产物加到8μL LAMP反应混液中，扩增反应条件为：58℃反应100分钟。

本发明我们首先将5hmC应用葡糖转移酶将UDP-Glu修饰在5hmC的羟基上形成5gmc，封闭5hmC从而不被后续反应影响，之后应用APOBEC脱氨酶对C和5mC进行脱氨基转化为尿嘧啶（U），再通过吡啶硼烷将5fC和5caC转化为二氢尿嘧啶（DHU），U与DHU与A碱基互补配对，而5gmc依然与G配对，从而5hmC与其他碱基形成单碱基差异。全程无需亚硫酸氢盐处理，降低了DNA在处理过程中的损失。以低密度脂蛋白受体相关蛋白基因35096044位点为目标序列，合成五条双链DNA模板序列，在该位点分别合成为C、5mC、5hmC、5fC和5caC碱基，并分别命名为C序列、5mC序列、5hmC序列、5fC序列和5caC序列。设计两条特异性检测目标序列的颈环结构探针，分别命名为探针A和探针B。如图6所示，探针A和探针B的一部分序列可以形成颈环结构，其中包含可以与上游内引物FIP和下游引物BIP互补杂交。探针A的5’端有19个碱基与目标序列互补，在5’端修饰一个磷酸基团。探针B在3’端16个碱基与目标序列互补，端头设计一个G碱基，与转化后的5gmc互补配对，而与C及其他修饰形成错配。由于连接酶有很高的特异性，在错配碱基处没有连接活性，因此只有5gmc序列能将探针A和探针B通过连接酶的作用连接成一条序列，通过高效的环介导恒温指数扩增高灵敏检测5hmC。本文采用无亚硫酸氢盐的处理对目标序列中的修饰碱基进行单碱基区分，采用基于连接的LAMP实现高灵敏度检测，适用于少量样品的5hmC检测。

进一步的，定量检测基因组中5hmC的方法包括如下步骤：

（1）封闭5hmC：准备封闭反应溶液和 DNA模板，将5μL封闭反应溶液放入2μL待测样品中，反应条件是在 37℃下孵育 2 小时；

（2）脱氨转化：步骤（1）封闭反应结束后，在反应体系中加入脱氨反应液，使待测样品在95℃下变性5分钟，然后转移到在-20℃预孵育的 PCR 管架上冷却10分钟；配制APOBEC脱氨基转化液，将APOBEC脱氨基转化液加入到封闭反应体系，脱氨反应条件为：在2小时内将温度从4℃梯度升温到50℃进行孵育，50℃持续10分钟；

（3）吡啶硼烷转化：配制吡啶硼烷转化液，加入到步骤（2）脱氨转化后的反应溶液中，放入恒温混匀仪中，设置转速850 rpm，反应条件为： 37℃孵育16 小时，反应结束后应用UNlQ-10 柱式通用 DNA 纯化试剂盒对DNA纯化；

（4）连接反应：配制连接反应混液，将步骤（3）的纯化产物加到连接反应混液中，加入目标序列后混匀，在90 ℃加热3分钟，使dsDNA高温变性，之后在45℃反应15分钟以目标序列为模板在连接酶的催化下连接探针A和探针B；

（5）LAMP扩增反应：配制LAMP扩增反应混液，取步骤（4）的连接产物2 μL加到8 μLLAMP反应混液中；LAMP反应的混液混匀后立即转到StepOne Real-Time PCR系统进行恒温反应，LAMP反应温度设为58℃，实时荧光强度间隔1分钟检测一次，时间为100分钟。

本发明中用到的核酸序列如下表1所示：

表1 本发明中的核酸序列

本发明与现有技术相比，有益效果为：

（1）首先将5hmC应用葡糖转移酶将UDP-Glu修饰在5hmC的羟基上形成5gmc，保护5hmC不被后续反应影响，之后应用APOBEC对C和5mC进行脱氨基转化为尿嘧啶（U），再通过吡啶硼烷将5fC和5caC转化为二氢尿嘧啶（DHU），U与DHU与A碱基互补配对，而5gmc依然与G配对，从而5hmC与其他碱基形成单碱基差异。

（2）由于连接酶有很高的特异性，只有5gmc序列能将探针A和探针B通过连接酶的作用连接成一条序列，引发LAMP指数扩增。通过连接LAMP法高灵敏度检测特定位点的5hmC。本发明的检测方法温和高效，能检测低至200aM的5hmC，特异性达到1%。

（3）本发明的试剂盒由于无亚硫酸钠处理，避免了DNA降解，适用于含量少的DNA样品。由于方法对5hmC有高的特异性，在样品中可以避免含量较高的目标C或目标5mC的干扰，由于方法在检测5hmC时有高的灵敏度，也可以排除含量较低的5fC和5caC的干扰，最终实现简单、快速、温和地检测少量样品中的5hmC。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1显示探针A的结构；

图2显示探针B的结构；

图3为混合样品采用实施例2中的方法进行检测的结果；不同浓度的目标序列5hmC产生的实时荧光曲线，从右至左，目标序列5hmC的浓度依次为空白，2 fM，20 fM，200 fM，2pM，20 pM；

图4为目标序列5hmC浓度的对数与POI的线性关系；

图5为200 fM的序列C、 5mC、5hmC、5fC和5caC的实时荧光曲线；

图6显示本发明的实施流程和原理。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

在一些较为具体的实施例中，用于检测5hmC的试剂盒包括：封闭反应液、APOBEC脱氨基转化液、吡啶硼烷转化液、连接反应液和LAMP反应混液；所述连接反应液包括探针A和探针B；所述探针A的序列如SEQ ID NO:1所示；所述探针B的序列如SEQ ID NO:2所示。

SEQ ID NO:1：

5'-phosphate-AATAATAAATCTATAAAACTTTTGTCTGGCAGTGTGTTTCTATATCGGTCCTCTCTCCTCCTTTCACACTGCCAGAC-3'；

SEQ ID NO:2：

5'-GCCTACTACTTCGTTTCTTGCCTTTGCTCTCTACTGACTTTTCGAAGTAGTAGGCTTTTAATTTAAAAAACCCCG-3'。

所述试剂盒中封闭反应液包括10×cutsmart 缓冲液1μL，50×UDP-Glu 1μL，以及10U T4-βGT 1μL，去离子水2μL，总体积5μL。

所述APOBEC脱氨基转化液包括APOBEC脱氨酶0.2μL，10×APOBEC脱氨基缓冲液1μL，牛血清白蛋白0.1μL，总体积1.3μL。

所述吡啶硼烷转化液包括600mM的pH=4.3的醋酸钠溶液1μL和1M吡啶硼烷0.1μL，总体积1.1μL。

所述连接反应液包括20nM的探针A 1μL，20nM的探针B 1μL，5U的Amp连接酶0.2μL，10×Amp连接酶缓冲溶液1μL和去离子水5.8μL，总体积9μL。

所述试剂盒还包括LAMP反应混液，所述LAMP反应混液包括10mM上游引物0.5μL，10mM 下游引物0.5μL，2.5mM的dNTP 0.8μL，8U的Bst DNA聚合酶0.5μL，10×ThermoPol反应缓冲溶液1μL，5M的甜菜碱2μL，50×SYBR Green I 0.2μL和去离子水2.5μL，总体积8μL。

FIP的序列如SEQ ID NO:3所示：

5'-GTCTGGCAGTGTGAAAGGAGGAGAGAGGACCGATATAG-3'；

BIP的序列如SEQ ID NO:4所示：

5'-GCCTACTACTTCGTTTCTTGCCTTTGCTCTCTACTGAC-3'；

定量检测基因组中5hmC的方法，包括如下步骤：

（1）封闭5hmC：准备封闭反应溶液和 DNA模板，将封闭反应溶液放入待测样品中，进行封闭反应；

（2）脱氨转化：步骤（1）封闭反应结束后，将反应快速转移到 PCR 管架上冷却；将APOBEC脱氨基转化液加入到封闭反应体系，进行脱氨反应；

（3）吡啶硼烷转化：将吡啶硼烷转化液加入到步骤（2）脱氨转化后的反应溶液中，放入恒温混匀仪中进行反应，反应结束后应用UNlQ-10柱式通用DNA纯化试剂盒对DNA纯化；

（4）连接反应：将步骤（3）反应后的纯化产物加到连接反应混液中，混匀后加热使dsDNA变性，之后进行连接反应液，以目标序列为模板在连接酶的催化下连接探针A和探针B；

（5）LAMP反应：取步骤（4）反应后的连接产物加到LAMP反应混液中；LAMP反应的混液混匀后立即转到StepOne Real-Time PCR系统进行恒温反应，实时荧光强度间隔1分钟检测一次。

进一步的，采用所述的试剂盒定量检测基因组中5hmC的方法，包括如下步骤：

（1）封闭5hmC：准备封闭反应溶液和待测DNA样品，将5μL封闭反应溶液与2μL待测DNA样品在200μL PCR管中混合，进行封闭反应；

（2）脱氨转化：步骤（1）封闭反应结束后，将PCR管快速转移到 PCR 管架上冷却；将1.3μL的APOBEC脱氨基转化液加入到7μL封闭反应体系，进行脱氨反应；

（3）吡啶硼烷转化：将1.1μL的吡啶硼烷转化液加入到步骤（2）脱氨转化后的反应溶液中，放入恒温混匀仪中进行反应，反应结束后应用UNlQ-10柱式通用DNA纯化试剂盒对DNA纯化；

（4）连接反应：将步骤（3）纯化后的1μLDNA样品加入到9μL连接反应混液中，加热使dsDNA变性，在合适的温度下以目标序列为模板在连接酶的催化下连接探针A和探针B；

（5）LAMP扩增反应：将步骤（4）的连接产物取2μL加到8μL LAMP反应混液中；LAMP反应的混液混匀后立即转到StepOne Real-Time PCR系统进行恒温反应，实时荧光强度间隔1分钟检测一次。

进一步的，步骤（1）中，封闭反应条件为： 37℃下孵育 2 小时；步骤（2）中，脱氨条件为：在2小时内将温度从4℃梯度升温到50℃进行孵育，50℃持续10分钟；步骤（3）中，反应条件为：恒温混匀仪设置转速850 rpm，37℃孵育16 小时；步骤（4）中，连接条件为：在90 ℃加热3分钟，使dsDNA高温变性，之后在45℃反应15分钟。步骤（5）中，LAMP扩增反应条件为：58℃反应100分钟。

本发明首先将5hmC应用葡糖转移酶将UDP-Glu修饰在5hmC的羟基上形成5gmc，保护5hmC不被后续反应影响，之后应用APOBEC对C和5mC进行脱氨基转化为尿嘧啶（U），再通过吡啶硼烷将5fC和5caC转化为二氢尿嘧啶（DHU），U与DHU与A碱基互补配对，而5gmc依然与G配对，从而5hmC与其他碱基形成单碱基差异。

ODN-C的序列如SEQ ID NO:5所示：

5'-CCAGGTCCCACAGATCTATCACCCGGGGCTCTTCAAACTCTGCAGG-3'

ODN-5mC 的序列如SEQ ID NO:6所示：

5'-CCAGGTCCCACAGATCTATCACC

ODN-5hmC 的序列如SEQ ID NO:7所示：

5'-CCAGGTCCCACAGATCTATCACC

ODN-5fC的序列如SEQ ID NO:8所示：

5'- CCAGGTCCCACAGATCTATCACC

ODN-5caC的序列如SEQ ID NO:9所示：

5'-CCAGGTCCCACAGATCTATCACC

以下为更具体的实施例：

实施例1

本实施例提供了一种用于检测5hmC的试剂盒，所述试剂盒包括：封闭反应液、APOBEC脱氨基转化液、吡啶硼烷转化液、连接反应液和LAMP反应混液；所述连接反应液包括探针A和探针B；所述探针A的序列如SEQ ID NO:1所示；所述探针B的序列如SEQ ID NO:2所示；封闭反应液包括10×cutsmart 缓冲液1μL、50×UDP-Glu 1μL，以及10U T4-βGT 1μL，去离子水2μL；所述cutsmart 缓冲液包括5 mM醋酸钾，2 mM tris-醋酸，1 mM醋酸镁和10 μg/ml BSA, 调节pH为7.9；APOBEC脱氨基转化液包括APOBEC脱氨酶0.2μL、10×APOBEC脱氨基缓冲液1μL，牛血清白蛋白0.1μL。吡啶硼烷转化液包括600mM的pH=4.3的醋酸钠溶液1μL和1M吡啶硼烷0.1μL；连接反应液包括20nM的探针A 1μL，20nM的探针B 1μL，5U的Amp连接酶0.2μL，10×Amp连接酶缓冲溶液1μL，和去离子水5.8μL。LAMP反应混液包括10mM上游引物FIP 0.5μL，10mM 下游引物BIP 0.5μL，2.5mM的dNTP 0.8μL，8U的Bst DNA聚合酶(大片段)0.5μL，10×ThermoPol反应缓冲溶液1μL，5M的甜菜碱2μL和50×SYBR Green I 0.2μL，去离子水2.5μL。

实施例2

定量检测基因组中5hmC的方法，包括如下步骤：

（1）封闭5hmC：配制5μL封闭反应溶液。反应溶液包含10×cutsmart缓冲液0.5μL(5mM醋酸钾，2mMtris-醋酸，1mM醋酸镁，10μg/ml BSA,pH7.9)1μL、50×UDP-Glu（NEB）1μL，10U T4-βGT(NEB)1μL,去离子水2μL，DNA模板2μL。反应条件是在37℃下孵育2小时。

（2）APOBEC脱氨基：封闭反应结束后，样品在95℃下变性5分钟，然后将反应快速转移到在-20℃预孵育的PCR管架上冷却。配制1.3μL脱氨基反应溶液。反应溶液包含10XAPOBEC反应缓冲溶液1μL，牛血清白蛋白（BSA）0.1μL，APOBEC 0.2μL。将脱氨基溶液全部加入到封闭反应体系，终体积为8.3μL。脱氨反应条件为：在2小时内将温度条件从4℃梯度升温到50℃孵育,50℃持续10分钟。

（3）吡啶硼烷转化：将600mM NaAc(pH=4.3)1μL和1M吡啶硼烷（阿拉丁）0.1μL加入到上述反应溶液中，终体积为9.4μL。放入恒温混匀仪(Eppendorf)中，设置转速850r.p.m。反应条件为：37℃孵育16小时。反应结束后应用UNlQ-10柱式通用DNA纯化试剂盒对DNA纯化。

（4）连接反应：将1μL上述反应后的产物加到9μL连接反应的混液中。混液包含2nM的探针A，2 nM的探针B，0.02U的Amp连接酶，1× Amp连接酶缓冲溶液。加入目标序列后混匀，在90℃加热3分钟使dsDNA高温变性，之后在45℃反应15分钟以目标序列为模板在连接酶的催化下连接探针A（如图1）和探针B（如图2）。Amp连接酶是耐热连接酶，它的活性不会受到反应温度的影响。

（5）LMAP反应：取上述反应后的连接产物2μL加到8μL LAMP反应混液中。LAMP混液包含0.4μM的FIP，0.4μM的BIP，200μM的dNTP，4U的Bst DNA聚合酶，1×ThermoPol反应缓冲溶液，1M的甜菜碱和0.4×SYBR GreenI。LAMP反应的混液混匀后立即转到StepOneReal-TimePCR系统进行恒温反应。LAMP反应温度设为58℃，实时荧光强度间隔1分钟检测一次，反应时间100分钟。

图3为混合样品采用实施例2中的方法进行检测的结果；不同浓度的目标序列5hmC产生的实时荧光曲线，从右至左，目标序列5hmC的浓度依次为空白，2 fM，20 fM，200 fM，2pM，20 pM；如图3所示，随着5hmC浓度从2 fM增长到20 pM，实时荧光曲线对应的实时荧光曲线POI值逐渐减小。连接LAMP方法可以检测低至2 fM的目标序列5hmC。在恒温条件下，检测浓度的范围跨度可以达到5个数量级。当POI值与5hmC浓度对数作图时，在2 fM至20 pM的浓度范围内都可以获得良好的线性关系。

图4是5hmC浓度对数与POI的线性关系。线性回归方程为POI = 6.19 lgC5hmC +22.03，相关系数R为0.996。对于结构高度相似，且可能出现在同一位点的5hmC及其他修饰，方法的特异性极其重要。为了评价方法的特异性，在相同的条件下，对200 fM的序列C、5mC、5hmC、5fC和5caC进行检测。结果如图5为200 fM的序列C、5mC、5hmC、5fC和5caC的实时荧光曲线；从图5中可以看出目标序列5hmC的实时荧光曲线可以与其他碱基序列明显区分开，将POI值代入线性方程，可以得出200fM干扰序列的浓度，将5hmC的信号定为100%，其他干扰序列检测小于1%，其检测5hmC的特异性为1%。因此，这些结果清楚地表明该方法有高的特异性。

定量检测基因组中5hmC的方法中应用温和转化辅助的连接LAMP反应。图6显示本发明的实施流程和原理。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。