AGPG作为乳腺癌病人诊断和不良预后的标志物及其应用

技术领域

本发明属于乳腺癌诊断及预后疗效评价研究领域，具体涉及长链非编码RNA(lncRNA)AGPG作为乳腺癌病人诊断和不良预后的标志物及其应用。

背景技术

2020年，全世界有68.5万人死于乳腺癌，乳腺癌是最流行和最致命的女性癌症类型。根据雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人表皮生长因子2(Her2)和Ki-67的表达水平，可将乳腺癌分为4个分子亚型，即luminal A、luminal B、HER2阳性和三阴性乳腺癌(TNBC)。目前临床常用的乳腺癌检测方法有X射线、乳腺超声、钼靶以及病理组织检查等，但以上方法对乳腺癌的筛查效率较低，容易出现漏诊、误诊，无法及时发现微小肿瘤病灶。因此，迫切需要一种新的检测方法和指标，提高乳腺癌的诊断效率和准确性，能帮助医生及早发现和诊断病情，选取更有效的应对措施。

乳腺癌的预后与分期、分子分型、Ki-67、年龄、组织学分级、病理学分型、肿瘤淋巴细胞浸润程度和与预后相关的免疫组化指标相关。近年来，乳腺癌复发转移已经成为乳腺癌患者的一个主要问题。常规的分子分型指标不能满足乳腺癌治疗疗效及预后评估的判断，因此准确判断乳腺癌患者复发转移及预后显得十分重要。我们迫切需要建立一种新的特异性诊断乳腺癌及不良预后的评估指标和方法。

发明内容

本发明针对现有临床治疗上存在的问题，目的是要提供AGPG作为乳腺癌病人诊断和不良预后的标志物，为乳腺癌诊断和指导治疗提供新的途径和产品。

本发明所述的长链非编码RNA(lncRNA)AGPG序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的技术方案之一为AGPG作为乳腺癌病人诊断或辅助诊断标志物中的应用。

本发明的技术方案之二为AGPG作为乳腺癌病人不良预后诊断或辅助诊断标志物中的应用。

本发明的技术方案之三为检测AGPG的试剂在制备乳腺癌病人诊断或辅助诊断试剂盒中的应用。本发明所述AGPG在乳腺癌组织中表达量明显高于乳腺正常组织，在乳腺癌患者组织中明显高于健康人群。

本发明的技术方案之四为检测AGPG的试剂在制备乳腺癌病人不良预后诊断或辅助诊断试剂盒中的应用。发明人发现检测来自患有乳腺癌对象的肿瘤样品中AGPG的表达量，其中出现AGPG表达量增高的现象与所述对象患有乳腺癌或乳腺癌治疗出现不良预后有关。

本发明AGPG的检测可以按照本领域的常规方法，例如采用qPCR、RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片、或高通量测序平台等方法检测AGPG的表达水平，这些检测方法、所需的引物或者检测所用的试剂可以按照本领域的常规进行涉及和使用。

本发明AGPG的检测采用的待测样本为人源样本，具体为癌旁组织和肿瘤组织样品。组织样品的获取和保存均可按照本领域的常规方法。

本发明所述AGPG作为乳腺癌关键药物干预靶点的应用。

本发明所述的乳腺癌包括Luminal A型、Luminal B型、HER-2阳性型和三阴性乳腺癌。

本发明所述的乳腺癌为ER阳性、PR阳性或/和Her2阳性的乳腺癌。

本发明研究发现AGPG作为一个lncRNA，其可作为乳腺癌诊断及不良预后评价的标志物，所述AGPG在乳腺癌组织中表达上调，经过RT-qPCR实验和ROC曲线分析，结果表明其表达较正常组织有所提高，因而可作为诊断乳腺癌的依据；所述AGPG通过Kaplan-Meierplotter网站进行生存分析，结果表明其表达水平与乳腺癌病人总生存期短密切相关，因而可作为判断乳腺癌病人不良预后的指标。AGPG的表达水平在临床上可作为乳腺癌诊断及不良预后评价的依据。

附图说明

图1为AGPG作为乳腺癌病人诊断标志物的结果图。其中图1A为正常细胞与乳腺癌细胞样本的qPCR实验的结果图，结果表明与人乳腺正常上皮细胞相比，AGPG在所有ER阳性乳腺癌细胞中显著高表达，在多数Basal乳腺癌细胞中显著高表达。图1B为12对正常组织与乳腺癌组织样本的qPCR实验的结果图，结果显示与匹配的正常组织相比，AGPG在乳腺癌组织中显著高表达。图1C为3例正常乳腺组织与57例乳腺癌组织中AGPG表达量的BaseScope实验的结果图，结果表明相对于正常组织，AGPG在ER阳性、Her2阳性及TNBC乳腺癌组织中的表达水平下显著升高。

图2A和B为分别对12对和30对正常组织和乳腺癌组织样本AGPG表达量的ROC曲线分析的结果图，结果显示测试集(n＝12)ROC曲线的曲线下面积(AUC)为0.800，即AGPG作为乳腺癌诊断标志物的诊断准确率为80.0％，验证集(n＝30)ROC曲线的曲线下面积(AUC)为0.810，即AGPG作为乳腺癌诊断标志物的诊断准确率为81.0％。

图3为AGPG作为乳腺癌病人不良预后标志物及其应用的结果图。图3为943例乳腺癌病人生存分析的结果图，结果显示相较于AGPG低表达的354例患者，589例AGPG高表达患者的总生存期更短。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明进一步说明，以下实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明所用生物材料、试剂和试剂盒等均可以通过常规商业购买得到，所用实验技术均为本领域内的常规操作或参照相应商品的说明书进行操作。

实施例1：AGPG的差异表达

1.组织及细胞RNA提取：本发明所涉及到的患者病理信息均符合正常人权，并获得患者的知情同意。所有患者在手术前均未接受放化疗。42位患者均为年龄37到85岁的女性，其中ER

2.RT-qPCR实验：用HiScript II第一链cDNA合成试剂盒(+gDNA wiper)(Vazyme，南京，中国)在荧光定量PCR仪按照如下程序进行逆转录：先将4×gDNA wiper Mix与模板RNA混匀，在42℃反应2min，然后向上述反应液中加入5×HiScript II qRT SuperMixⅡ，在50℃反应15min，在85℃反应5sec。得到RNA逆转录产物第一链cDNA。

RT-qPCR反应用ChamQ通用SYBR-qPCR混合试剂(Vazyme)在7500荧光定量PCR系统上进行。RT-qPCR引物序列如下表1所示：

表1

在荧光定量PCR仪按照如下程序反应：预变性，95℃，30sec；变性，95℃，10sec、退火，60℃，30sec。(变性、退火，40个循环)，获得样本ct值并进行分析。

3.BaseScope实验：组织染色用公司设计的AGPG探针(Advanced CellDiagnostics,Newark,CA)和配套的BaseScope试剂盒v2-Red(Advanced CellDiagnostics)对组织芯片(3个正常组织和57个乳腺癌组织)进行染色，并用血红素对细胞核进行染色。实验流程依照试剂盒说明书进行。使用QuPath软件(v.0.3.2)对图像进行采集和分析。3例正常乳腺组织来源于3位年龄34到49岁的未患乳腺癌的女性，57例乳腺癌组织来源于57位年龄31到81岁的乳腺癌女性患者，其中ER

结果如图1所示，AGPG在正常组织中与乳腺癌组织中出现差异表达，表明其可作为检测健康人群与乳腺癌患者差异性的标志物。

实施例2：AGPG作为乳腺癌病人诊断标志物及其应用

1.ROC曲线绘制：将训练集12对和验证集30对患者正常组织与乳腺癌组织样本分别以0和1进行标记并录入GraphPad Prism(7.0)，填写对应的AGPG表达量，选择“分析”选项下的“ROC曲线”，点击“确定”输出结果。

结果如图2所示，训练集的AUC为0.800(图2A)，验证集的AUC为0.810(图2B)，表明AGPG的高表达对乳腺癌具有诊断价值。

实施例3：AGPG表达升高提示病人的不良预后

1.生存分析：Kaplan-Meier plotter(https://kmplot.com/analysis/)对多个肿瘤组织芯片数据进行整合和归一化，能够在线计算病人生存与基因表达水平的关联。点击首页“KM plotter”选项，在“Affy id/Gene symbol”输入AGPG的基因名“LOC148709”，勾选“Auto select best cutoff”选项，分析患者的总生存期，最终可获得943例患者的Kaplan-Meier生存曲线。分析结果显示，相较于354例AGPG低表达患者，589例AGPG高表达患者的总生存期更短。

结果如图3所示，AGPG高表达患者的总生存期更短，这表明AGPG的高表达提示病人的不良预后。