含儿茶酚基团化合物在制备杀灭鱼类寄生原虫药物中的应用

技术领域

本发明属于植物提取物应用技术领域，涉及含儿茶酚基团化合物在制备杀灭鱼类寄生原虫药物中的应用。

背景技术

鱼类病害是实现水产养殖业高产高效的主要障碍之一，其中鱼类寄生虫病是发病率最高，危害最严重的一类鱼类疾病。鱼类寄生原生动物包括肉足鞭毛门（

鱼类寄生原虫病常用的杀虫药主要是硫酸锌、硫酸铜、盐酸氯苯胍、地克珠利等化学药剂为主，这些化学药剂主要通过杀死离体的多子小瓜虫进而达到防治目的，对存在于活体鱼体内或体表的寄生虫的杀灭效果十分有限。这些化学药剂的使用对食品安全、环境污染等均产生了一系列负面影响。因此，开发对环境友好且具有高效抗虫活性的药物成为鱼类寄生虫病防治中要解决的关键问题。

天然产物具有广泛而独特的生物活性，大多数天然产物在自然界中易降解、对非靶标生物毒性低，因此从天然产物中寻找活性成分以创制新药是公认的最佳途径之一。近年来，许多学者从天然产物中发现了例如血根碱、白屈菜红碱、茵芋碱、纤细薯蓣皂苷、五没食子酰葡萄糖、白薇苷C、补骨脂素和厚朴酚等一系列具有优良抗虫效果的天然活性分子。

目前，已发现的一系列天然活性分子虽对多子小瓜虫病有一定的防治效果，但仍存在结构复杂、成药性差、理化性质不佳、价格昂贵和治疗指数不高等缺点。因此，探索出结构简单且具有优良抗虫效果的天然活性分子是水产养殖过程中多子小瓜虫病防治的关键，具有重要应用价值和意义。

发明内容

对于鱼类感染多子小瓜虫病目前尚无高效的治疗药物，为解决这一技术问题，本发明提供了含儿茶酚基团化合物在制备杀灭鱼类寄生原虫药物中的应用。

一方面，本发明涉及含儿茶酚基团化合物在制备杀灭鱼类寄生原虫药物中的应用，所述含儿茶酚基团化合物为：槲皮素、绿原酸、咖啡酸、木犀草素中的至少一种。

具体地，槲皮素具有如式I所示的结构；绿原酸具有如式Ⅱ所示的结构；咖啡酸具有如式Ⅲ所示的结构；木犀草素具有如式Ⅳ所示的结构：

。

进一步地，槲皮素、绿原酸、咖啡酸、木犀草素中的任一种化合物具有杀灭多子小瓜虫的作用。

进一步地，槲皮素、绿原酸、咖啡酸、木犀草素中的任一种化合物对于多子小瓜虫包囊的形成和孵化具有抑制作用。

与现有技术相比，本发明“含儿茶酚基团化合物在制备杀灭鱼类寄生原虫药物中的应用”具有以下有益效果：

本发明提供了一类含儿茶酚基团的活性化合物，包括槲皮素、绿原酸、咖啡酸和木犀草素，这些天然活性分子对水产动物毒性很低，残留少，不易引发耐药性问题，且价格低，有着良好的理化性质。本发明提供的含儿茶酚基团的活性化合物相较于目前已发现的抗多子小瓜虫天然产物分子具有更为优良的成药性，且对多子小瓜虫均显示出良好的杀灭效果，且对于多子小瓜虫包囊的形成和孵化具有显著的抑制作用，具有很高的应用价值。

附图说明

图1为不同浓度咖啡酸对多子小瓜虫滋养体繁殖率的影响箱型图。

图2为不同浓度木犀草素对多子小瓜虫滋养体繁殖率的影响箱型图。

其中，“＊”表示p<0.05，“＊＊”表示p<0.01，“＊＊＊”表示p<0.001。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行说明，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述各实施例中所述实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试验用品和原料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。

本发明所用槲皮素、木犀草素、咖啡酸、绿原酸，纯度均为98.0%，购买自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

实施例1

本实施例提供了槲皮素、木犀草素、咖啡酸、绿原酸对金鱼的急性毒性试验。

实验方法：

实验动物为金鱼，购于陕西省朱雀路花鸟市场，要求体质健壮，规格一致，平均体重6-8g。购回后在实验室水族箱中暂养10d，每天投喂2次，投入的金鱼专用饲料（购于陕西省朱雀路花鸟市场）在20min内吃完为限，待适应实验室环境条件后再进行实验。

分别配制浓度为10.0mg/L、20.0mg/L、30.0mg/L、40.0mg/L、50.0mg/L、60.0mg/L、70.0mg/L共7个浓度梯度的上述4个化合物母液，4℃冰箱保存备用，用于测定不同浓度条件下金鱼的死亡情况。

采用静水式试验法，每盆加充分曝气的自来水10L，pH值7.2，控制水温为23±1℃，先加入待测化合物母液充分混匀形成一定浓度的测试药液后再加入金鱼，每盆放养10尾。整个试验中要求保持水中溶氧在5mg/L以上。

在试验期间如发现鱼死亡，应及时捞出，以免影响水质和试验结果。判断鱼死亡的方法是当鱼停止呼吸后（鳃盖运动停止）用玻璃棒或镊子轻击鱼的尾柄部，如果在3min之内鱼体不产生任何应激反应，即可判断死亡。

统计在12h、24h、48h和96h四个时间段内各药物浓度下金鱼的死亡情况，另外设置空白对照组（不添加任何化合物）。当空白对照组的死亡率小于5％时，各时间段内金鱼的死亡率可不予校正；若大于5％，则应予校正，校正公式采用Abbott公式；如果空白对照组死亡率达20％以上，则在查找原因后，重新进行毒性试验。试验期间应保持安静，尽可能避免对金鱼的任何干扰。

实验结果：

不同浓度的槲皮素在不同时间点的金鱼死亡情况见表1。

表1，不同浓度的槲皮素在不同时间点的金鱼死亡情况

实验中发现，在药物浓度为70.0mg/L的高浓度试验组，试验用鱼中毒反应非常明显，用药后4h左右出现异常表现，金鱼将头浮出水面，继而行动迟缓，出现侧游，不久后开始出现麻痹，失去平衡，腹部朝上而死。在浓度为10.0mg/L的低浓度试验组中，金鱼表现较安静，对外界反应灵敏，活动正常。

不同浓度的木犀草素在不同时间点的金鱼死亡情况见表2。

表2，不同浓度的木犀草素在不同时间点的金鱼死亡情况

实验中发现，在药物浓度为70.0mg/L的高浓度试验组，试验用鱼中毒反应非常明显，用药后6h左右出现异常表现，金鱼将头浮出水面，继而行动迟缓，出现侧游，不久后开始出现麻痹，失去平衡，腹部朝上而死。在浓度为10.0mg/L的低浓度试验组中，金鱼较安静，对外界反应灵敏，活动正常。

不同浓度的咖啡酸在不同时间点的金鱼死亡情况见表3。

表3，不同浓度的咖啡酸在不同时间点的金鱼死亡情况

实验中发现，在药物浓度为70.0mg/L的高浓度试验组，试验用鱼中毒反应较为明显，用药后8h左右出现异常表现，金鱼将头浮出水面，继而行动迟缓，出现侧游，不久后开始出现麻痹，失去平衡，腹部朝上而死。在浓度为20.0mg/L的低浓度试验组中，金鱼较安静，对外界反应灵敏，活动正常。咖啡酸对金鱼的急性毒性低于槲皮素和木犀草素。

不同浓度的绿原酸在不同时间点的金鱼死亡情况见表4。

表4，不同浓度的绿原酸在不同时间点的金鱼死亡情况

实验中发现，在药物浓度为70.0mg/L的高浓度试验组，试验用鱼中毒反应非常明显，用药后8h左右出现异常表现，金鱼将头浮出水面，继而行动迟缓，出现侧游，不久后开始出现麻痹，失去平衡，腹部朝上而死。在浓度为20.0mg/L的低浓度试验组中，金鱼较安静，对外界反应灵敏，活动正常。绿原酸对金鱼的急性毒性略低于槲皮素和木犀草素。

综合实施例1的实验结果，将10.0mg/L的浓度作为上述4个化合物的安全使用浓度。

实施例2

本实施例提供了槲皮素、木犀草素、咖啡酸、绿原酸对多子小瓜虫的幼虫杀灭效果。

实验用金鱼的体重为4.0g，来源于陕西省咸阳市长兴金鱼养殖场；本实施例所用多子小瓜虫是从陕西省朱雀路花鸟市场的患病金鱼分离得到。

将若干患病金鱼置于40L温度为22.0±2.0℃的水箱中，用充氧泵进行增氧和虹吸法吸污，隔天换水1/3。收集多子小瓜虫的方法：首先将若干严重寄生多子小瓜虫的金鱼置于装有300mL过滤水的烧杯30min。由于金鱼不停地游动，成熟的多子小瓜虫从金鱼体表脱落，用吸管收集脱落的多子小瓜虫包囊。然后将收集到的包囊在23.5±0.5℃温度中培养18~20h得到多子小瓜虫幼虫。多子小瓜虫计数方法：用移液器移取1μL的幼虫悬液置载玻片上，并在解剖镜下计数，重复十次取平均值作为多子小瓜虫幼虫悬液浓度，此浓度作为后续多子小瓜虫计数依据。

精确称取1.0g化合物，用DMSO充分溶解，定容于100mL容量瓶中，配成浓度为10mg/mL的化合物母液，4℃冰箱保存备用。

1）对于多子小瓜虫幼虫的杀灭效果

测定受试药物杀灭多子小瓜虫幼虫效果：在96孔板的每一孔中放入约300个幼虫。将待测化合物母液分别稀释至浓度为1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L、6.0mg/L和8.0mg/L，同时设置不加入待测化合物作为空白对照组。在4h时用解剖镜观察并记录死亡的多子小瓜虫幼虫。认为形态不正常或是无法活动的多子小瓜虫幼虫为死亡。整个实验在温度为23.5±0.5℃环境中进行，重复3次，结果取平均值。

2）对于多子小瓜虫包囊的杀灭效果

在24孔板的每一孔中放入30个多子小瓜虫包囊（体积为1mL），再依次放入待测化合物母液使其最终浓度分别达到2.0mg/L、4.0mg/L、6.0mg/L、8.0mg/L和10.0mg/L，同时设置不加入待测化合物作为空白对照组。将24孔板置于培养箱恒温培养（23.5±0.5℃）。18~20h后取出24孔板在解剖镜下记录死亡的多子小瓜虫包囊（无法完成繁殖的多子小瓜虫包囊被认为死亡）并统计多子小瓜虫幼虫的数量，依此计算多子小瓜虫的繁殖率（每孔中幼虫数量/存活的包囊数量），实验重复3次。

实验结果：

1）对于多子小瓜虫幼虫的杀灭效果

不同浓度槲皮素杀灭多子小瓜虫幼虫的效果见表5。

表5，不同浓度槲皮素杀灭多子小瓜虫幼虫的效果

表5显示，当槲皮素浓度达到8.0mg/L时即能导致100%的多子小瓜虫幼虫死亡。经计算，4h时槲皮素杀灭多子小瓜虫幼虫的半数致死浓度为3.096mg/L。实验发现4.0mg/L或更高浓度的槲皮素在4h时能导致大多数多子小瓜虫幼虫发生形变，由鞋底形变成圆形并且伴随着运动能力的丧失。尽管在槲皮素的浓度为3.0mg/L时一些多子小瓜虫幼虫在1h时也形变成了圆形，但是它们还能自由游动，只是与空白对照组的多子小瓜虫幼虫的运动速度相比稍慢些。

不同浓度咖啡酸杀灭多子小瓜虫幼虫的效果见表6。

表6，不同浓度咖啡酸杀灭多子小瓜虫幼虫的效果

表6显示，当咖啡酸浓度达到8.0 mg/L时即能导致90%的多子小瓜虫幼虫死亡。经计算，4 h时咖啡酸杀灭多子小瓜虫幼虫的半数致死浓度为6.324 mg/L，其对多子小瓜虫的杀灭效果低于槲皮素。

不同浓度绿原酸杀灭多子小瓜虫幼虫的效果见表7。

表7，不同浓度绿原酸杀灭多子小瓜虫幼虫的效果

表7显示，当绿原酸浓度达到8.0mg/L时即能导致100%的多子小瓜虫幼虫死亡。经计算，4h时绿原酸杀灭多子小瓜虫幼虫的半数致死浓度为2.839mg/L，其对多子小瓜虫的杀灭效果略高于槲皮素且显著优于咖啡酸。

不同浓度木犀草素杀灭多子小瓜虫幼虫的效果见表8。

表8，不同浓度木犀草素杀灭多子小瓜虫幼虫的效果

表8显示，当木犀草素浓度大于3.0 mg/L时则能导致100%的多子小瓜虫幼虫死亡。经计算，4h时木犀草素杀灭多子小瓜虫幼虫的半数致死浓度为0.806 mg/L，其对多子小瓜虫的杀灭效果远远高于槲皮素、绿原酸及咖啡酸。

2）对于多子小瓜虫包囊的杀灭效果

不同浓度槲皮素对多子小瓜虫包囊的影响见表9。

表9，不同浓度槲皮素对多子小瓜虫包囊的影响

表9显示，大于8.0 mg/L的槲皮素能显著（P<0.05）影响多子小瓜虫包囊的包囊形成率。槲皮素的浓度为10.0 mg/L时即能够导致多子小瓜虫包囊的孵化率降低50%。

不同浓度咖啡酸对多子小瓜虫包囊的影响见表10。

表10，不同浓度咖啡酸对多子小瓜虫包囊的影响

表10显示，大于4.0 mg/L的咖啡酸能显著（P<0.05）影响多子小瓜虫包囊的包囊形成率。咖啡酸的浓度为10.0 mg/L时即能够导致多子小瓜虫包囊的孵化率降低90%。

不同浓度绿原酸对多子小瓜虫包囊的影响见表11。

表11，不同浓度绿原酸对多子小瓜虫包囊的影响

表11显示，大于6.0mg/L的绿原酸能显著（P<0.05）影响多子小瓜虫包囊的包囊形成率。绿原酸的浓度为10.0mg/L时即能够导致多子小瓜虫包囊的孵化率降低40%。

不同浓度木犀草素对多子小瓜虫包囊的影响见表12。

表12，不同浓度木犀草素对多子小瓜虫包囊的影响

表12显示，大于8.0 mg/L的木犀草素能显著（P<0.05）影响多子小瓜虫包囊的包囊形成率。木犀草素的浓度为10.0 mg/L时即能够导致多子小瓜虫包囊的孵化率降低约70%。

实施例3

本实施例提供了木犀草素、咖啡酸对在体多子小瓜虫的杀灭效果。

根据实施例2中的实验结果，选取能够显著降低多子小瓜虫包囊孵化率的木犀草素、咖啡酸以分析其对于在体多子小瓜虫的杀灭效果。

对于在体的多子小瓜虫，将30尾患多子小瓜虫病的金鱼平均分配到浓度为0（阴性对照）、10 mg/L和20 mg/L的受试药物溶液中浸泡。分别在1h、3h和5h后各收集30个多子小瓜虫包囊前体放入24孔板中（每组设置3个孔重复），终体积为1 mL，然后将24孔板置于恒温培养箱（22.5±0.5℃）中孵育22~24 h。取出24孔板在显微镜下记录每孔繁殖出多子小瓜虫掠食体的数量，整个实验重复3次。将多子小瓜虫繁殖出掠食体的平均数量用以表征多子小瓜虫繁殖力。

试验结果：

咖啡酸对在体多子小瓜虫的抑制效果：

不同浓度的咖啡酸在体浸浴处理对多子小瓜虫包囊繁殖力的影响如图1所示。从包囊产生的多子小瓜虫掠食体的总量来看，两种浓度的咖啡酸（10 mg/L和20 mg/L）较对照组均能显著（p<0.05）降低多子小瓜虫掠食体的总量，并且两种浓度之间在处理相同时间下对多子小瓜虫掠食体总量的影响也存在显著（p<0.05）差异；20 mg/L的咖啡酸浸泡5 h后使多子小瓜虫包囊产生的掠食体总数从1.5×10

由以上实施例可知，槲皮素、咖啡酸、绿原酸和木犀草素均能对多子小瓜虫的幼虫产生杀灭效果，还能降低多子小瓜虫包囊的形成和孵化。其中，木犀草素和咖啡酸对于在体多子小瓜虫的杀灭效果显著，进一步验证了本发明提供的4种化合物具有鱼类多子小瓜虫的防治效果。

以上所述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。在依据本发明构思的条件下本领域普通技术人员进行的相关推演和替换，在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。