一种B3型柯萨奇病毒纳米颗粒多肽疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及柯萨奇病毒纳米颗粒多肽疫苗领域，更具体地，涉及一种B3型柯萨奇病毒纳米颗粒多肽疫苗及其制备方法。

背景技术

病毒性心肌炎是指病毒感染引起的心肌局限性或弥漫性的急性或慢性炎症病变，属于感染性心肌疾病。病毒性心肌炎主要由B3型柯萨奇病毒(CVB3)感染所致，青壮年发病较高，是一种常见、多发的心血管系统疾病，目前尚无有效的预防或治疗疫苗。目前已开展多项针对预防CVB3诱导的病毒性心肌炎的疫苗研究，都没有取得理想效果，例如：灭活疫苗可诱生中和抗体但不能诱生足够的T细胞应答；减毒活疫苗具有毒力恢复的危险；基因工程病毒颗粒疫苗能够模拟自然感染过程并激活机体的固有免疫和适应性免疫应答，但由于病毒或细菌载体本身即具有很强的免疫原性，往往导致机体产生针对载体蛋白而非靶抗原的免疫应答，同时其潜在的安全隐患也制约了该类疫苗的应用。

VP1是CVB3的主要结构蛋白，含有多个T、B细胞表位，是主要的中和抗原，可诱导机体产生保护性免疫应答。多肽疫苗具有良好的生物安全性，但由于其在体内易降解和不可复制性，诱导的免疫应答强度较弱，往往需要加入佐剂或采用合适的递送系统。基于纳米颗粒的递送系统可以集抗原递送与免疫佐剂功能于一体，形成一个多功能的抗原复合物，成为疫苗递送系统研究的新热点。

公开号为CN1772306A的发明专利，公开了一种柯萨奇病毒B组3型基因疫苗，该疫苗直接用抗原的VP1基因和作为真核表达载体的质粒pCEP4组成的pCEP4－CVB1VP1质粒，该疫苗的特异性体液免疫应答低，且质粒抗原易免受酶降解，抗原利用率低，导致抗原免疫原性差。因此，需要开发一种针对CVB3的新型疫苗，来提高特异性体液免疫应答以及提高抗原利用率，提高抗原的免疫原性。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种B3型柯萨奇病毒纳米颗粒多肽疫苗，该疫苗可以提高特异性体液免疫应答；且可以提高抗原利用率，进而提高抗原的免疫原性。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

一种B3型柯萨奇病毒纳米颗粒多肽疫苗，以蛛丝蛋白纳米颗粒为递送系统，所述B3型柯萨奇病毒纳米颗粒多肽疫苗中多肽序列来自于B3型柯萨奇病毒VP1蛋白的B细胞表位和T细胞表位。

本发明B3型柯萨奇病毒纳米颗粒多肽疫苗为以蛛丝蛋白纳米颗粒为递送系统，多肽序列来自于B3型柯萨奇病毒VP1蛋白的B细胞表位和T细胞表位，该疫苗可显著增强机体针对B3型柯萨奇病毒的特异性体液免疫应答。

本发明提供了一种B3型柯萨奇病毒纳米颗粒多肽疫苗，为以融合蛛丝蛋白诱导形成的含有抗原表位的纳米颗粒，所述融合蛛丝蛋白通过B3型柯萨奇病毒VP1蛋白中的B细胞表位和T细胞表位分别与蛛丝蛋白融合表达得到。

进一步地，所述融合蛛丝蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

进一步地，所述蛛丝蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述B细胞表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述T细胞表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明提供了上述B3型柯萨奇病毒纳米颗粒多肽疫苗的制备方法，所述方法为将B3型柯萨奇病毒VP1蛋白中的B细胞表位序列和T细胞表位序列分别与蛛丝蛋白融合表达得到融合蛛丝蛋白；以融合蛛丝蛋白分别制备含有抗原表位的纳米颗粒，即为B3型柯萨奇病毒纳米颗粒多肽疫苗。

进一步地，上述方法包括如下步骤：

S1.通过基因合成含有B细胞表位的蛛丝蛋白融合基因片段nps-b，所述基因片段nps-b的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；将基因片段nps-b通过酶切插入载体，构建得到表达融合蛋白的重组载体；

S2.通过基因合成含有T细胞表位的蛛丝蛋白基因片段nps-t，所述基因片段nps-t的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；将基因片段nps-t通过酶切插入载体，构建得到表达融合蛋白的重组载体；

S3.将步骤S1和S2中所述重组载体转化至受体细胞，诱导含有重组载体的受体细胞的基因片段nps-b和nps-t的表达，得到分别含有B细胞表位和T细胞表位的融合蛛丝蛋白；

S4.将步骤S3中所述融合蛋白分别加到磷酸钾溶液中诱导形成融合蛋白纳米颗粒NPs-B和融合蛋白纳米颗粒NPs-T，即为B3型柯萨奇病毒纳米颗粒多肽疫苗。

进一步地，步骤S4所述诱导形成纳米颗粒，为将融合蛋白制成2-3mg/mL的蛋白溶液，以1:10的体积比加入至浓度为2M，pH值为8.0的磷酸钾溶液中1-3h。

进一步地，步骤S1中所述基因合成含有B细胞表位的蛛丝蛋白纳米颗粒的融合基因片段nps-b，步骤S2中所述通过基因合成含有T细胞表位的蛛丝蛋白纳米颗粒的基因片段nps-t，均以大肠杆菌为宿主合成。

本发明提供了蛛丝蛋白在制备B3型柯萨奇病毒多肽疫苗中的应用，所述应用为将蛛丝蛋白与B3型柯萨奇病毒VP1蛋白的B细胞表位和T细胞表位序列融合表达，以融合表达得到的融合蛛丝蛋白制备纳米颗粒多肽疫苗，所述蛛丝蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述融合蛛丝蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示。

优选地，步骤S1所述B细胞表位其基因融合于蛛丝蛋白的C末端。

优选地，步骤S2所述T细胞表位基因融合于蛛丝蛋白的N末端。

优选地，步骤S1或S2中所述通过酶切插入载体，所述载体为PET-32a。

优选地，步骤S1或S2中所述酶切使用限制性内切酶NdeI和XhoI。

优选地，步骤S3所述受体细胞为E.coli BL21(DE3)。

优选地，步骤S4所述将重组载体转化至受体细胞后，还需将受体细胞接种于含有氨苄抗性的LB培养基中，验证基因片段nps-b和nps-t是否表达。

进一步地，步骤S4中所述B3型柯萨奇病毒纳米颗粒多肽疫苗中融合蛋白纳米颗粒NPs-B和融合蛋白纳米颗粒NPs-T等质量混合。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本疫苗为以蛛丝蛋白纳米颗粒为递送系统的纳米颗粒，且含有B细胞表位和T细胞表位，不仅可保护抗原免受蛋白酶降解，且其直径约为300nm，可显著增加淋巴细胞对抗原的摄取，增加抗原在注射部位的存留时间，提高抗原的生物利用度，可显著增强抗原免疫原性，免疫动物可诱导产生更高效价的特异性抗体，相比仅利用VP1蛋白来制备的多肽疫苗，可显著提高特异性体液免疫应答，产生更高水平的IgG，提升至3-4倍。

(2)本B3型柯萨奇病毒纳米颗粒多肽疫苗主要成分都是蛋白质，具有生物安全性和相容性，更为安全；且稳定性好，易储存、易运输。

(3)本B3型柯萨奇病毒纳米颗粒多肽疫苗可有效预防或治疗由B3型柯萨奇病毒引起的病毒性心肌炎。

附图说明

图1是本发明B3型柯萨奇病毒纳米颗粒多肽疫苗的质粒构建示意图；

图1中A表示PET-32a-nps-b；B表示PET-32a-nps-t。

图2是本发明B3型柯萨奇病毒纳米颗粒多肽疫苗蛋白表达纯化的SDS-PAGE胶；

图2中A表示B表位融合蛋白SDS-PAGE胶；B表示T表位融合蛋白SDS-PAGE胶。

图3是本发明B3型柯萨奇病毒纳米颗粒多肽疫苗的纳米颗粒扫描电镜(SEM)图；

图3中A表示纳米颗粒NPs-T；B表示纳米颗粒NPs-B；C表示对比例1制备得到的颗粒。

图4是DLS分析本发明B3型柯萨奇病毒纳米颗粒多肽疫苗的平均粒径和平均zeta电位柱状图；

图4中A表示平均粒径柱状图；B表示平均Zeta电位柱状图。

图5是本发明疫苗免疫小鼠后的CVB3特异性血清IgG水平。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning:a laboratory manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1B3型柯萨奇病毒纳米颗粒多肽疫苗及其制备

一种B3型柯萨奇病毒纳米颗粒多肽疫苗，以蛛丝蛋白纳米颗粒为递送系统，所述B3型柯萨奇病毒纳米颗粒多肽疫苗中多肽序列来自于B3型柯萨奇病毒VP1蛋白的B细胞表位和T细胞表位。其中所述蛛丝蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述B3型柯萨奇病毒VP1蛋白的B细胞表位氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述所述B3型柯萨奇病毒VP1蛋白的T细胞表位氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

上述疫苗的制备方法如下：

S1.以大肠杆菌为宿主，通过基因合成含有B细胞表位的蛛丝蛋白融合基因片段nps-b，所述基因片段nps-b的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；将基因片段nps-b通过限制性内切酶NdeI和XhoI酶酶切插入载体，载体为质粒PET-32a，构建得到表达融合蛋白的重组载体；

S2.以大肠杆菌为宿主，通过基因合成含有T细胞表位的蛛丝蛋白基因片段nps-t，所述基因片段nps-t的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；将基因片段nps-t通过限制性内切酶NdeI和XhoI酶切插入载体，载体为PET-32a，构建得到表达融合蛋白的重组载体；

S3.将步骤S1和S2中所述重组载体转化至受体细胞E.coli BL21(DE3)，诱导含有重组载体的受体细胞的基因片段nps-b和nps-t的表达，将受体细胞接种于含有氨苄抗性的LB培养基中，验证基因片段nps-b和nps-t是否表达，得到分别含有B细胞表位和T细胞表位的融合蛛丝蛋白；

S4.将步骤S3中所述融合蛋白制成2-3mg/mL的蛋白溶液，以1:10的体积比加入至浓度为2M，pH值为8.0的磷酸钾溶液中2h，诱导形成融合蛋白纳米颗粒NPs-B和融合蛋白纳米颗粒NPs-T，即为B3型柯萨奇病毒纳米颗粒多肽疫苗。

具体步骤如下：

1.融合蛋白表达载体的构建

如图1所示，本发明融合蛋白表达载体构建过程如下：以大肠杆菌为宿主，基因合成含有B细胞表位的融合基因序列nps-b，B细胞表位序列融合于蛛丝蛋白的C末端，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，通过NdeI和XhoI酶切位点，以载体PET-32a为表达载体，构建克隆PET-32a-nps-b(图1A)；

基因合成含有T细胞表位的融合基因序列nps-t，T细胞表位序列融合于蛛丝蛋白的N末端，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，通过NdeI和XhoI酶切位点，以载体PET-32a为表达载体，构建克隆PET-32a-nps-t(图1B)。

2.融合蛋白的表达

构建正确的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株，挑取单克隆接种到含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃培养过夜，按1:100的体积比将培养物接种于含氨苄抗性的新鲜LB培养基中，37℃振荡培养至OD

3.融合蛋白纳米颗粒的制备

将蛋白溶液透析到10mM pH值为8.0的Tris缓冲溶液中，并调整浓度为2.5mg/mL，取100μL加入到1mL浓度为2M，pH值为8.0的K

实施例2

制备方法参照实施例1，区别为在进行融合蛋白构建时，T细胞表位其基因融合于蛛丝蛋白的N末端，其他步骤保持不变。

对比例1

制备方法参照实施例1，区别为在进行融合蛋白构建时，T细胞表位基因序列融合于蛛丝蛋白的C末端，其他步骤保持不变。

实施例3融合蛋白纳米颗粒表征

1.实验方法

使用肉眼观察蛋白溶液在磷酸钾溶液中的物理变化方法初步判断检测实施例1-2和对比例1得到的蛋白溶液是否为纳米颗粒，如果能形成纳米颗粒，蛋白溶液加入磷酸钾溶液中混合后溶液会变由透明变乳白色状，在12000rpm高转离心30min可得到白色沉淀，且白色沉淀可轻易在缓冲溶液中被吹散重悬。如果无法形成纳米颗粒通常蛋白溶液加入磷酸钾会出现聚团现象，聚团块无法吹散重悬。进一步对白色沉淀样品进行扫描电镜SEM检测及进行动态光散射(DLS)检测分析。

2.实验结果

结果显示，在进行融合蛋白构建时B细胞表位基因融合于蛛丝蛋白的C末端可以形成纳米颗粒，T细胞表位基因融合于蛛丝蛋白的N末端可以形成纳米颗粒(图3A和图3B)；T细胞表位基因融合与蛛丝蛋白的C末端表达得到的蛋白无法诱导形成纳米颗粒)(图3C)，原因可能是T细胞表位序列较长位于C末端干扰了蛛丝蛋白组装形成纳米颗粒。因此本结果，我们通过优化确定了B细胞表位位于蛛丝蛋白C末端的纳米颗粒NPs-B和T细胞表位位于蛛丝蛋白N末端的纳米颗粒NPs-T。

扫描电镜显示实施例1中NPs-B和NPs-T纳米颗粒均能形成形态均一的球状颗粒，且表面相对光滑粒径大约为300nm(图3A和B)。DLS分析显示NPs-B及NPs-T纳米颗粒分别在295nm和321nm左右(图4A)，与扫描电镜显示粒径相当，DLS分析显示两种纳米颗粒平均zeta电位均负电位，由于电位绝对值均超过20mVZeta电位的绝对值(正或负)越高，体系越稳定，即溶解或分散可以抵抗聚集。反之，Zeta电位(正或负)越低，越倾向于凝结或凝聚，即吸引力超过了排斥力，分散被破坏而发生聚集，如图4可知，本纳米颗粒溶液的体系平均zeta电位绝对值均超过20，因此本纳米颗粒溶液的体系较为稳定。

实施例4多肽疫苗诱导的CVB3特异性体液免疫应答

1.实验方法

将实施例1-2所得B3型柯萨奇病毒纳米颗粒多肽疫苗通过皮下注射的方式免疫小鼠，检测该疫苗诱导的特异性体液免疫应答水平，并与传统VP1蛋白(GenBank:ACT98478.1)相比较。具体方法如下：

(1)小鼠免疫及血清收集

将实施例1-2所得B3型柯萨奇病毒纳米颗粒多肽疫苗通过皮下注射方式免疫小鼠，其中，融合蛋白纳米颗粒NPs-B和融合蛋白纳米颗粒NPs-T混合。具体方法为：将6-8周BALB/c雄性小鼠分为VP1蛋白组，纳米颗粒组(NPs-B和NPs-T等量混合)和PBS组共3组，每组6只小鼠。VP1蛋白免疫组每只免疫25μg的蛋白，纳米颗粒组免疫250μg的蛋白(抗原量相当于25μg VP1蛋白)分别于第1、3、5周免疫，共免疫3次，免疫方法是将蛋白疫苗缓慢注射到小鼠背部皮下，多点分布免疫。

末次免疫后两周收集小鼠血清，方法是以毛细管经小鼠眼眶后眦静脉采血，37℃静置30min，5000rpm离心10min，吸取上清分装冻存于-80℃。

(2)CVB3特异性血清IgG的ELISA检测

将采集的血样以10μg/mL VP1蛋白包板，4℃过夜后，用PBST洗3遍；以1*DiluentBuffer封闭，37℃封闭1h后，用PBST洗3遍；加入100μL 1:40稀释血清原液，37℃孵育2h后，用PBST洗3遍；加入100μL HRP-羊抗小鼠IgG，37℃孵育1h后，用PBST洗6遍；加入100μL TMB底物，室温避光显色，最后加入50μL 2MH

2.实验结果

实验结果如图5所示，ELIAS结果显示，三次免疫后纳米颗粒免疫组可以诱导高水平的特异性IgG抗体，相较于VP1蛋白组具有显著的统计学差异，而高水平的特异性抗体可以提高免疫小鼠抵御病毒感染的能力，以上实施例表明，以B3型柯萨奇病毒纳米颗粒多肽疫苗皮下注射免疫小鼠，可有效增强B3型柯萨奇病毒特异性血清抗体应答，具备作为新型疫苗的应用价值和潜力。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。