匍伏堇挥发油、其提取纯化方法及所得抑菌剂

技术领域

本发明涉及天然产物有效成分提取技术领域，特别是涉及一种匍伏堇挥发油、其提取纯化方法及所得抑菌剂。

背景技术

匍伏堇(Viola diffusa Ging)，属于堇菜科、堇菜属植物，别名蔓茎堇菜(七星莲)。以全草入药，用于肝炎，百日咳，目赤肿痛；外用治急性乳腺炎，疔疮，痈疖，带状疱疹，毒蛇咬伤，跌打损伤。主要分布在我国浙江省，生于荒坡、耕地、溪边、疏林下及路边半阴湿地。

挥发油又称精油，是一类在常温下能挥发的、可随水蒸汽蒸馏的、与水不相混的油状液体的总称。大多数挥发油具有芳香气味。挥发油是一类重要的活性成分，临床上除直接应用主要含挥发油的生药外，还可应用从中精制的挥发油，如桉叶油、薄荷油等。挥发油具有发散解表、芳香开窍、理气止痛、祛风除湿、活血化瘀、祛寒温里、清热解毒、解暑祛秽、杀虫抗菌等作用，如薄荷油用驱风健胃，当归油镇痛，柴胡油退热，土荆芥油驱肠虫等，此外，挥发油还广泛应用于香料、食品与化妆品等的生产。

目前，对于匍伏堇的研究较少，还未有关于匍伏堇挥发油提取与使用的报道。因此，随着天然产物精细化应用的逐步实施，以及为进一步的拓展匍伏堇的应用领域，有必要对匍伏堇挥发油的提取与使用开展研究。

发明内容

本发明提供一种匍伏堇挥发油、其提取纯化方法及所得抗肿瘤药物，该匍伏堇挥发油首次采用水蒸气蒸馏和有机萃取技术提取纯化得到，该提取纯化方法工艺简单、成本低，所得挥发油含水率低，且所得挥发油对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌和绿脓杆菌具有良好的抑菌活性，且具有良好的抗氧化活性，适合于工业化生产应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种匍伏堇挥发油的提取纯化方法，包括以下步骤：

将匍伏堇粉碎后，加水搅拌，并进行水蒸气蒸馏3-6h，得含挥发油水系；

向含挥发油水系中加入有机溶剂进行萃取，弃去分出的水层，向含挥发油的有机溶剂中加入脱水干燥剂脱水，过滤回收有机溶剂，得到干燥纯净的挥发油。

上述技术方案中，在进行水蒸气蒸馏提取时，适宜的提取时间既能够保证尽可能从匍伏堇中提取出挥发油组分，又可以避免提取时间过长造成的资源浪费。本发明在实验过程中以挥发油提取率为考察指标，对水蒸气蒸馏提取的时间进行了优化，发现提取时间以3-6h为宜，例如可以为3、3.5、4、4.5、5、5.5、6h小时，这样可最大程度的将匍伏堇中的挥发油提取出来，同时避免资源的浪费。

作为优选，所加入的匍伏堇和水的质量比为1：(2～5)，优选为1:3。可以理解的是，优化匍伏堇和水的质量比可确保能够将匍伏堇中的有效成分尽可能地溶于水中，为后续蒸馏提取打好基础。

作为优选，粉碎后的匍伏堇的粒径为50-100目，优选为60目。可以理解的是，匍伏堇粉粹目数的大小会影响挥发油的提取率，粉碎颗粒过大，会使水蒸汽从原料间隙流出，使得提取率降低，且浪费资源；而粉粹的粒径过小，则使得水蒸汽无法均匀透过原料，导致蒸汽从冲开的原料中逸出，同样导致提取率不高。经优选实验发现，匍伏堇粉粹的目数以50-100目为宜，可以保证较高的挥发油提取率。在一优选方案中，匍伏堇粉粹的目数为60目，相对于其他的粉碎目数取得了最优的挥发油提取率。

作为优选，所述有机溶剂为乙酸乙酯、丙烯酸乙酯、正己烷和乙醚中的至少一种；所述脱水干燥剂为无水硫酸钠或无水硫酸钙。可以理解的是，由于关于匍伏堇有效成分的研究很少，对于匍伏堇挥发油的提取更是技术上的空白，因此，如何选择提取方法以及如何选择有机溶剂是匍伏堇挥发油提取的难点所在。本发明在实验过程中对多种不同极性的有机溶剂进行了筛选，结果发现：以乙酸乙酯、丙烯酸乙酯、正己烷、乙醚作为有机溶剂，匍伏堇挥发油的提取率较优。

作为优选，所述有机溶剂为乙醚，所述脱水干燥剂为无水硫酸钠。可以理解的是，经优选实验发现，以乙醚作为有机溶剂，相较于其他的有机溶剂具有更好的挥发油提取率。

本发明还提供了一种根据上述任一项技术方案所述的提取纯化方法制备得到的匍匐茎挥发油，所述匍匐茎挥发油的化学成分主要包括：3-羟基辛烯、芳樟醇、2-十三烷酮、新臭根子草醇、新植二烯、六氢金合欢基丙酮、(E)-11-十六碳烯-1-醇和异植醇。

本发明还提供了一种抑菌剂，以上述技术方案所述的匍匐茎挥发油为主要有效成分。

作为优选，所述菌为金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌和绿脓杆菌中的至少一种；所述匍匐茎挥发油对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.50mg/mL，对枯草杆菌的最低抑菌浓度为0.25mg/mL，对大肠杆菌的最低抑菌浓度大于2.00mg/mL，对绿脓杆菌的最低抑菌浓度为1.00mg/mL。

本发明还提供了一种根据上述任一项技术方案所述的抑菌剂在制备抑菌性食品、药品保健品或化妆品中的应用。

本发明还提供了一种抗氧化剂，以上述技术方案所述的匍匐茎挥发油为主要有效成分。

本发明还提供了一种根据上述任一项技术方案所述的抗氧化剂在制备抗氧化食品、药品保健品或化妆品中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

本发明首次采用水蒸气蒸馏和有机萃取技术提取纯化得到匍伏堇挥发油，该提取纯化方法工艺简单，成本低，制备工艺中的蒸馏水和有机溶剂能够重复利用，经本发明制备工艺获得的挥发油含水率低，同时经试验验证匍伏堇挥发油对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌和绿脓杆菌具有良好的抑菌活性，且具有良好的抗氧化活性，适合于工业化生产应用。

具体实施方式

下面将对本发明具体实施例中的技术方案进行详细、完整的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明总的技术方案的部分具体实施方式，而非全部的实施方式。基于本发明的总的构思，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都落于本发明保护的范围。

实施例1匍伏堇挥发油的提取纯化方法

S1：取400g新鲜匍伏堇洗净晾干后粉粹至粒径为60目，加入1200g蒸馏水后搅拌进行水蒸汽蒸馏，蒸馏提取时间为4-5h，得含挥发油水系；

S2：向含挥发油水系中加入乙醚进行萃取，弃去分出的水层，向含挥发油的乙醚溶液中加入无水硫酸钠脱水，过滤回收乙醚，即得到干燥纯净的挥发油，提取率为1.42％，挥发油中的含水率为0.42％。

实施例2匍伏堇挥发油的提取纯化方法

S1：取400g新鲜匍伏堇洗净晾干后粉粹至粒径为50目，加入800g蒸馏水后搅拌进行水蒸汽蒸馏，蒸馏提取时间为5-6h，得含挥发油水系；

S2：向含挥发油水系中加入乙醚进行萃取，弃去分出的水层，向含挥发油的乙醚溶液中加入无水硫酸钠脱水，过滤回收乙醚，即得到干燥纯净的挥发油，提取率为1.39％，挥发油中的含水率为0.39％。

实施例3匍伏堇挥发油的提取纯化方法

S1：取400g新鲜匍伏堇洗净晾干后粉粹至粒径为100目，加入1600g蒸馏水后搅拌进行水蒸汽蒸馏，蒸馏提取时间为3-4h，得含挥发油水系；

S2：向含挥发油水系中加入乙醚进行萃取，弃去分出的水层，向含挥发油的乙醚溶液中加入无水硫酸钠脱水，过滤回收乙醚，即得到干燥纯净的挥发油，提取率为1.37％，挥发油中的含水率为0.41％。

实施例4匍伏堇挥发油的提取纯化方法

S1：取400g新鲜匍伏堇洗净晾干后粉粹至粒径为80目，加入2000g蒸馏水后搅拌进行水蒸汽蒸馏，蒸馏提取时间为3-4h，得含挥发油水系；

S2：向含挥发油水系中加入乙醚进行萃取，弃去分出的水层，向含挥发油的乙醚溶液中加入无水硫酸钠脱水，过滤回收乙醚，即得到干燥纯净的挥发油，提取率为1.45％，挥发油中的含水率为0.38％。

实施例5匍伏堇挥发油的检测

采用GC-MS对实施例1得到的匍伏堇挥发油进行检测，具体检测条件如下：HP-5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；载气：氦气；流速：1.2mL/min，溶剂延迟3min；升温程序：初始温度为60℃，保持1min，以8℃/min升温到200℃，保持5min，再以5℃/min升到280℃，保持2min。离子化方式：EI，70eV；离子源温度：250℃；载气：氦气；柱流速：1.2mL/min。共检测出匍伏堇挥发油中化学成分32种，具体化学成分及相对含量见表1。

表1匍伏堇挥发油化学成分

如表1所示，所述匍匐茎挥发油的化学成分主要包括3-羟基辛烯、芳樟醇、2-十三烷酮、新臭根子草醇、新植二烯、六氢金合欢基丙酮、(E)-11-十六碳烯-1-醇和异植醇，上述组分的含量占匍匐茎挥发油总含量的66.3％。

对比例1匍伏堇挥发油的提取纯化

将S1中匍伏堇粉碎的粒径调整为40目，其余操作同实施例1，制备得到挥发油，提取率为1.13％，挥发油中的含水率为0.70％。

对比例2匍伏堇挥发油的提取纯化

将S1中匍伏堇粉碎的粒径调整为120目，其余操作同实施例1，制备得到挥发油，提取率为0.91％，挥发油中的含水率为0.62％。

对比例3匍伏堇挥发油的提取纯化

将S2中“向含挥发油水系中加入乙醚进行萃取”调整为“向含挥发油水系中加入二氯甲烷进行萃取”，其余操作同实施例1，制备得到挥发油，提取率为1.23％，挥发油中的含水率为0.72％。

对比例4匍伏堇挥发油的提取纯化

将S2中“向含挥发油水系中加入乙醚进行萃取”调整为“向含挥发油水系中加入甲苯进行萃取”，其余操作同实施例1，制备得到挥发油，提取率为1.07％，挥发油中的含水率为0.69％。

实施例6抑菌活性测定

1、试验菌种和培养基

试验菌种：选择四种细菌菌株用于抑菌试验，包括革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)和革兰氏阴性菌：大肠杆菌(ATCC 25922)，绿脓杆菌(ATCC 27853)。

试验用培养基：细菌MHB(Mueller Hinton Broth)培养基。

2、试验方法

(1)灭菌：

将实验所需要的培养基、试管、培养皿、滤纸片(6mm)、枪头、蒸馏水等在121℃湿热灭菌20min，灭完菌将其放置超净工作台紫外灭菌30min。

(2)菌悬液的配制：

从经过活化的菌体斜面上挑取一环菌体接种于相应的MHB培养基中，放入恒温摇床中37℃条件下隔夜培养。分别吸取以上培养好的处于对数生长期的供试菌液0.5mL，用MH肉汤稀释成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。再用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后，得到1-2×10

(3)供试药物：

对照药物：氯霉素；样品：实施例1所得匍伏堇挥发油的8mg/mL稀释液。

(4)抑菌活性的测定：

采用滤纸片法测定抑菌活性。无菌条件下，在已灭菌的培养皿中倾入MHA培养基20mL，冷却凝固后制成固体平板。向每个固体平板中加入100μL已稀释好的菌悬液，涂布均匀，放置5min，使培养基充分吸收菌液。用记号笔在有菌琼脂平板上标号。用无菌镊子将灭完菌的干燥的滤纸片夹出，放入写相应对照编号的培养皿中，向灭完菌的干燥的滤纸片滴加配制好的样品溶液或氯霉素溶液10μL，每个样品做三个平行，放入37℃恒温培养箱培养24h。培养时间到后取出培养皿观察透明抑菌圈，采用十字交叉法用测微尺测量每个抑菌圈两个垂直方向的直径大小，取其平均值(mm)为测定结果，每项抑菌实验均平行重复3次。以抑菌圈直径的大小来进行抑菌活性强弱的判定，抑菌圈表现得越大，则表明其抗菌活性也就越强。

(5)MIC的测定：

吸取稀释好的菌液加于96孔细胞培养板中，每孔100μL，并加入已配置好的不同浓度的药物100μL。倒数第二孔不加药物(仅加培养基和细菌)加入稀释菌液100μL，为细菌生长对照孔。最后一列为阳性对照氯霉素。置于振荡器上振荡1min，使孔内溶液充分混匀后，将96孔板振荡摇匀后置于37℃恒温培养箱中培养16-18小时后，向每孔中加入用无菌水配置的1％TTC(2,3,5-三苯基氯化四氮唑)溶液20μL，振荡摇匀于37℃恒温培养箱中培养30到60分钟，观察每孔颜色变化。取未呈现颜色变化的最后一孔所含挥发油浓度为其最低抑菌浓度MIC。

重复所有MIC值的测量一式三份。

3、实验结果

抑菌效果用最小抑菌浓度MIC表示，测量结果见表2。

表2匍伏堇挥发油抑菌活性

由表2可以看出，匍伏堇挥发油对4种供试菌均有一定的抑制作用，其对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.50mg/mL，对枯草杆菌的最低抑菌浓度为0.25mg/mL，对大肠杆菌的最低抑菌浓度为大于2.00mg/mL，对绿脓杆菌的最低抑菌浓度为1.00mg/mL。实验结果表明，匍伏堇挥发油可作为天然抗菌剂用于食品、药品保健品或化妆品行业，代替有毒副作用的合成抗菌剂。

实施例4抗氧化活性测定

1、供试药物

对照药物：BHT、Trolox；样品：实施例1所得匍伏堇挥发油的10mg/mL稀释液。

2、试验方法

2.1 DPPH法抗氧化活性的测定：

配不同浓度的Trolox溶液/BHT溶液/样品溶液，溶剂为丙酮；配制0.05mg/ml的DPPH甲醇溶液。

在96孔板的1-11孔中加入150μL稀释好的DPPH溶液，1-10孔中按浓度从浓至稀加入50μl Trolox溶液/BHT溶液/样品溶液，11孔中加入50μl丙酮作为溶剂对照，12孔中加150μl甲醇和50μl丙酮作为空白对照。盖上封口膜，暗处反应，每隔4～5h，通过酶标仪，于517nm测吸光度。

通过SPSS计算清除自由基50％的有效浓度(IC

2.2 ABTS法抗氧化活性的测定：

配制4.3mM的过硫酸钾水溶液和1.7mM的ABTS水溶液1：1(v/v)混合，黑暗中放置12～16h，使用前用甲醇稀释，至734nm处的吸光度为0.7±0.02。配不同浓度的Trolox溶液/BHT溶液/样品溶液，溶剂为丙酮。

在96孔板的1-11孔中加入150μL稀释好的ABTS溶液，1-10孔中按浓度从浓至稀加入50μl Trolox溶液/BHT溶液/样品溶液，11孔中加入50μl丙酮作为溶剂对照，12孔中加150μl甲醇和50μl丙酮作为空白对照。盖上封口膜，暗处反应，每隔两小时，通过酶标仪，于734nm测吸光度。

通过SPSS计算清除自由基50％的有效浓度(IC

2.3 FRAP法抗氧化活性的测定：

配不同浓度的Trolox溶液/样品溶液，溶剂为甲醇和水的混合溶液，体积比为1：1；新鲜配制的FRAP溶液，由乙酸缓冲液(300mM,pH 3.6)：20mM FeCl

在96孔板的1-11孔中加入160μL稀释好的FRAP溶液，1-10孔中按浓度从浓至稀加入40μl Trolox溶液/样品溶液，11孔中加入40μl甲醇和水混合溶液(1：1)作为溶剂对照，12孔中加160μl乙酸缓冲液及40μl甲醇和水混合溶液(1：1)作为空白对照。盖上封口膜，暗处反应40分钟，通过酶标仪，于593nm测吸光度。

以Trolox溶液的浓度为横坐标，测得的OD值为纵坐标，做标准曲线。样品溶液的浓度与OD值经过换算得Trolox等效抗氧化剂浓度TEAC值，测得抗氧化能力。

重复所有抗氧化活性的测量一式三份。

3、实验结果

DPPH和ABTS法的抗氧化效果用清除自由基50％的有效浓度IC

表3匍伏堇挥发油(DPPH,ABTS和FRAP法测试)抗氧化活性

由表3可以看出，匍伏堇挥发油在ABTS和DPPH法中表现出适中的自由基清除能力，IC

上述实验结果说明匍伏堇挥发油可作为天然抗氧化剂用于食品、药品保健品或化妆品行业，代替有毒副作用的合成抗氧化剂。