TRIM41抑制物、其抗炎作用及应用

技术领域

本申请属于生物技术和医学领域。具体而言，本申请涉及三基序E3泛素连接酶41(TRIM41，tripartite motif-containing E3 ubiquitin ligase 41)及其抑制物(例如小干扰RNA)在炎性疾病和/或症状(例如病毒或细菌感染性疾病)中的效应、作用机制、实施方法和用途。

背景技术

病原体感染(包括病毒感染和细菌感染)是临床常见的疾病，可以导致机体局部和全身的感染性表现，甚至可以最终导致感染性休克、内毒素性休克以及多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)等严重后果。一旦重度感染导致出现休克或者多器官功能衰竭，则引起高死亡率(～50-80％)表现。

常见的临床病毒或细菌感染，如流感病毒、单纯疱疹病毒、李斯特菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌等感染，均可以导致机体局部和全身的炎症反应，引起不同程度的感染性疾病的发生。

对于病毒感染患者，目前的抗病毒药物主要针对病毒复制的多个环节，但对完全清除病毒作用有限，病毒的清除还有赖于机体的免疫系统。当病毒持续存在，可能会诱发机体的细胞因子风暴，导致全身的炎症反应，并出现休克和MODS。

对于细菌感染患者，医生一般采用大剂量抗生素旨在快速、彻底杀灭病原体，但是往往忽略了另一方面，即在病菌死亡后会释放大量毒素，而这些毒素会引起严重的系统性症状。诱发全身性炎症的毒素主要有两类：内毒素(革兰阴性细菌细胞壁的脂多糖成分)和超抗原(包括革兰阳性细菌的肽聚糖/脂磷壁复合物、外毒素等毒素)。

目前病原体感染导致的休克和多器官功能衰竭仍然是临床预防和治疗的重大挑战。

人体可以通过自身天然免疫系统中的模式识别受体(pattern-recognitionreceptors，PRRs)来检测病原体的入侵并启动宿主抗病原微生物反应，例如I型干扰素和促炎症细胞因子的产生。核酸(包括DNA和RNA)是所有生物体(包括病毒，细菌)的重要遗传信息载体，也是天然免疫系统可以识别的主要结构。细胞内识别核酸的PRRs包括Toll样受体(TLR)家族的几个位于内体的成员以及位于细胞质的识别DNA和RNA的受体。

TLR是被研究最多的PRR家族之一【Kawai T.等，Immunity.2011；34:637–50】。TLR是具有胞外结构域的单次跨膜蛋白，其含有富含亮氨酸的重复序列，用于识别大多数病原微生物所共有的组成性表达的分子，即病原体相关分子模式(Pathogen associatedmolecular patterns，PAMPs)。其还含有跨膜结构域和负责将信号转导至下游接头蛋白(包括TRIF和MyD88)的胞质Toll/IL-1受体(TIR)结构域。

在人体中分别鉴定了10种TLR，其中4种参与核酸识别，它们分别是TLR3、TLR7、TLR8和TLR9。TLR3识别病毒分子中双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)【Takeuchi，O.等，Immunity.1999；11:443-451；Ozinsky，A.等，Proc Natl Acad Sci USA.2000；97:13766-13771；Alexopoulou，L.等，Nature.2001；413:732-738】；人类TLR7和TLR8基因定位于染色体Xp22，识别病毒分子中的单链RNA(single-stranded RNA，ssRNAs)【Heil，F.等，Science.2004；303:1526-1529】；人类TLR9定位于染色体3p21.3，识别细菌和病毒DNA中的CpG基序或人工合成的CpG寡核昔酸(CpG oligodeoxynucleotides，CpG ODN)【Hemmi，H.等，Nature.2000；408:740-745】。

这些受体在细胞内体识别病原的核酸，并通过两种信号传导途径起作用：MyD88(myeloid differentiation factor 88)依赖性通路和TRIF(Toll/IL-1receptor(TIR)-domain containing adaptor protein inducing IFN-β)依赖性通路。MyD88既而活化下游的IRAKs、TRAF6、TAK1及IKK和MAPK等信号分子，最终导致NF-κB和AP1的早期活化，介导促炎症细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β和一氧化氮的产生；TRIF的活化能激活TBK1、TRAF3和IRF3，最终导致I型干扰素的产生和干扰素诱导基因的活化，如CXCL10和CCL5等【Akira，S.等，Nat.Rev.Immunol.4，499-511(2004)；Liew，F.Y.等，Nat.Rev.Immunol.5，446-458(2005)】。

当病原微生物侵入细胞质，并且在细胞内复制时，它们的核酸能够被细胞质内的核酸受体识别，并触发下游免疫反应。这其中最主要的两个受体是识别5’端带有三磷酸盐的RNA的RIG-I以及识别双链DNA的cGAS。

RIG-I样受体是细胞质内识别双链RNA并诱导促炎症细胞因子和干扰素产生所需的含有DExD/H-box结构域的蛋白质【Yoneyama M.等，Nat.Immunol.2004；5:730–37】。RIG-I是RIG-I样受体(RLR)家族的重要成员，它可以识别副粘病毒科中的病毒，如仙台病毒和新城疫病毒；黄病毒科中的病毒，如乙型脑炎病毒、登革病毒、西尼罗病毒和丙肝病毒；弹状病毒科中的病毒，如水疱性口炎病毒；呼肠病毒科中的呼肠孤病毒，等【Gitlin L.等，ProcNatl Acad Sci USA.2006；103:8459–64；Kato H.等，Nature.2006；441:101–5；Fredericksen BL.等，J.Virol.2008；82:609–16；Loo Y-M.等，J.Virol.2008；82:335–45】。当RIG-I识别病毒核酸并活化后，它可以招募接头蛋白MAVS(mitochondrial antiviralsignaling)，并通过活化IKK及TBK1，最终导致NF-κB和IRF3的活化，介导促炎症细胞因子如TNF-α，IL-6，IL-1β及干扰素的产生【Seth RB.等，Cell.2005；122:669–82】。

天然免疫核酸受体信号通路作为机体固有免疫的第一道屏障，通过诱导产生促炎症细胞因子和干扰素来清除病原体，维持机体内环境的稳定。然而，这种信号的活化是一把双刃剑，在清除病原体的同时，过多的促炎症细胞因子产生会导致各种炎症性疾病和自身免疫病。

Toll样受体(TLR)家族的核酸受体(如TLR3、TLR7、TLR8和TLR9)、细胞质RNA受体(如RIG-I和MDA5)和细胞质DNA受体(如cGAS和其他几种STING-相关DNA受体)的异常活化与炎症性疾病和自身免疫疾病的密切相关并且已被广泛研究【Yin,Q.等，Annu.RevImmunol.2015；33,393-416；Cao,X，Nat.Rev.Immunol.2016；16,35-50；Chen Q.等，Nat.Immunol.2016；17:1142–49；Crowl,J.等，Annu.Rev.Immunol.2017；35,313-336】。天然免疫核酸识别信号通路的活化必须受到严格的调控，防止其过度活化，尤其是导致炎性因子的过度产生。因此，寻找炎症调节分子，发现新的抑炎靶点一直是天然免疫研究的重点。

泛素(Ub)修饰在天然免疫和获得性免疫的调控中起着至关重要的作用。TRIM家族蛋白被定义为E3泛素连接酶，其特征在于N末端RING-指结构域、一个或两个锌指结构域(称为B1和/或B2 BOX)、一个卷曲螺旋结构以及不同的C末端结构域。TRIM家族蛋白质调控着重要的细胞生命活动，如细胞内信号传导、天然免疫调控、转录调控、自噬和肿瘤等【Ozato,K.等，Nat.Rev.Immunol.2008；8,849-860；Hatakeyama,S等，Trends Biochem.Sci.2017；42,297-311】。

TRIM41也是含有PRY-SPRY结构域的TRIM蛋白。然而，TRIM41的生物学和免疫学功能知之甚少。据报道，TRIM41可能与PKC激酶和NOD2相互作用，并且可能可以抑制乙肝病毒基因的转录【Chen,D.等，J.Biol.Chem.2007；282,33776-33787；Zhang,S，PLoS One.2013；8,e70001；Thiébaut,R.等，PLoS One.2016；11,e0165420】。最近，TRIM41被发现可以作为甲型流感病毒核蛋白的E3泛素连接酶，导致甲型流感病毒核蛋白降解【Patil,G.等，J.Virol.2018；492,e00905-e00918】。

综上所述，本领域迫切需要开发出一种可有效抵抗炎性疾病和/或症状(例如病毒或细菌感染过程中促炎症细胞因子过度产生)的免疫学活性物质。

发明内容

本申请提供了TRIM41蛋白的小干扰RNA在有效抑制炎性疾病和/或症状(例如病毒或细菌感染后促炎症细胞因子产生)中的新用途。

在本申请的第一方面，提供了TRIM41的抑制物在制备用于预防和/或治疗对象中炎性疾病和/或征状的产品中的用途。

在一些实施方式中，TRIM41为选自下组的物质：Trim41基因、Trim41的mRNA、cDNA、TRIM41前体、TRIM41蛋白。

在一些实施方式中，抑制物选自针对TRIM41的：小干扰RNA(siRNA)、shRNA、miRNA、反义寡核苷酸、锌指蛋白、CRISPR/Cas9基因编辑产品、抗体、化学抑制剂。

在一些实施方式中，抑制物选自天然纯化物质、经修饰的天然纯化物质、半合成物质、化学合成物质。

在一些实施方式中，抑制物源自哺乳动物。

在一些实施方式中，抑制物源自：人、非人灵长类动物(例如猩猩、猿)、啮齿动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠)、宠物(例如猫、狗)、家畜(例如马、牛、羊、猪、兔)。

在一些实施方式中，所述抑制物为TRIM41的siRNA，其选自：

(a)具有SEQ ID NO：1～12中任一对所示序列的RNA分子；

(b)与(a)中的RNA序列同源，其具有抑制TRIM41作用的RNA分子；和/或

(c)(a)或(b)的RNA序列中经过取代、缺失或添加一个或几个碱基、且具有抑制TRIM41作用的由(a)或(b)衍生的RNA分子。

在一些实施方式中，所述抑制物为TRIM41的siRNA，其选自：SEQ ID NO：1～12中任一对所示序列的RNA分子。

在一些实施方式中，所述抑制物为TRIM41的siRNA，其序列选自：SEQ ID NO:1和2、SEQ ID NO:3和4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和10、SEQ ID NO:11和12。

在一些实施方式中，炎性疾病和/或症状为：病原体感染所致，例如病毒(例如DNA病毒或RNA病毒)、细菌、立克次体、支原体、真菌、螺旋体和/或寄生虫所致；物理因素所致，例如高温、低温、放射性物质损伤、机械损伤所致；化学因素所致，例如外源性毒素、内源性毒素所致；变态反应所致，例如超敏反应、自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、慢性肾炎、溃疡性结肠炎等)。

在一些实施方式中，炎性疾病和/或症状包括选自下组中的一种或多种：促炎症细胞因子(例如IL-6、TNFα、I型干扰素(如IFNβ)、IL-1)的过量产生，如炎症因子风暴；病毒性或内毒素性休克或死亡；器官的炎性损伤或多器官功能衰竭，例如所述器官选自：肝脏、脾脏、脑、肾、心脏、肺、胃、肠；病毒感染导致的慢性炎症性疾病。

在一些实施方式中，病原体可选自但不限于：病毒、细菌、立克次体、支原体、真菌、螺旋体和寄生虫。例如，病原体可为选自下组中的一种或多种：流感病毒、水泡性口炎病毒、单纯疱疹病毒、李斯特菌、冠状病毒、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌。

在一些实施方式中，被施用的对象为哺乳动物，例如人、非人灵长类动物(例如猩猩、猿)、啮齿动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠)、宠物(例如猫、狗)、家畜(例如马、牛、羊、猪、兔)。

在一些实施方式中，对象为具有天然免疫缺陷/受损和/或干扰素抗病毒感染治疗无效或效果不佳或易产生副作用的对象，如患有自身免疫性疾病或易患自身免疫性疾病的对象，如IFN功能不全或过激对象(如患有炎症性肠病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、慢性肾炎、结核病、慢性胃肠道疾病的对象)。

在一些实施方式中，产品为药物组合物或药盒，例如其形式适于通过选自下组方式给予的药物组合物或药盒：口服、注射(例如直接裸DNA或蛋白质注射法、脂质体包裹DNA、RNA或蛋白质注射法)、金包被基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法或目的基因所编码蛋白质、电致孔、鼻腔给药、肺部给药、口服给药、透皮给药。

在本文的另一方面中，提供了TRIM41的抑制物在制备用于治疗或辅助治疗病原体感染性疾病和/或病症的产品中的用途。其中，所述TRIM41的抑制物如前文中所描述。

在一些实施方式中，产品的用途如前文所述。所述病原体为选自下组的一种或多种：病毒、细菌、立克次体、支原体、真菌、螺旋体和/或寄生虫，例如选自流感病毒、水泡性口炎病毒、单纯疱疹病毒、李斯特菌、冠状病毒(例如COVID-19)、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌。

在另一方面中，提供了一种药物组合物或药盒，其包含：

(A)治疗和/或预防有效量的TRIM41的抑制物；

(B)药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂；

(C)可任选的，一种或多种用于预防和/或治疗炎性疾病和/或征状的其它活性物质。

在一些实施方式中，所述TRIM41的抑制物、药物组合物或药盒及其用途如文本中所述。

在一些实施方式中，其它活性物质可选自但不限于下组：临床常用抗病毒药，如三环胺类、焦磷酸类、蛋白酶抑制药、核苷类药物、反义寡核苷酸类、干扰素、利巴韦林、金刚烷胺、奥司他韦等；抗生素，例如β-内酰胺类(青霉素类和头孢菌素类)、氨基糖甙类、四环素类、氯霉素类、大环内酯类、抗真菌抗生素、抗结核类抗生素；临床常用免疫抑制剂，例如糖皮质激素、环磷酰胺、氯喹、环孢霉素A、雷公藤、中药制剂、抗TNF单克隆抗体。

在其他方面中，本文还提供了一种用于预防和/或治疗炎性疾病和/或征状的方法，所述方法包括给予有需要的对象有效量的本文所述的TRIM41抑制物或药物组合物或药盒。

在其他方面中，本文还提供了一种用于治疗或辅助治疗病原体感染性疾病和/或病症的方法，所述方法包括给予有需要的对象有效量的本文所述的TRIM41抑制物或药物组合物或药盒。

本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本发明的发明构思和保护范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。

图1：利用小干扰RNA干扰小鼠腹腔巨噬细胞的TRIM41后，能明显降低病毒刺激后促炎症细胞因子的产生。其中：

图1a、1b为病毒刺激后TRIM41表达量变化；

图1c为TRIM41小干扰RNA的效率验证；

图1d、1e为荧光定量PCR检测促炎症细胞因子的mRNA水平；

图1f、1g为ELISA检测促炎症细胞因子蛋白水平。

**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001。Ctrl代表对照组，Trim41KD代表Trim41干扰组，Mock为重悬病毒用的同种DMEM培养液组。

图2：Trim41缺陷小鼠来源的骨髓来源巨噬细胞，在用病原体来源核酸或病原体处理后，促炎症细胞因子的产生明显减少。

图2a为病原体来源核酸处理细胞后，ELISA检测炎症因子；其中，Liposome为转染核酸用脂质体，此处作为对照组；

图2b为病原体直接处理细胞后，ELISA检测促炎症细胞因子；其中，Mock为重悬病原体用的DMEM培养液，此处作为对照组。

***，P<0.001；****，P<0.0001。Trim41

图3：Trim41缺陷的小鼠感染病毒后炎症反应更弱。

图3a为外周血血清ELISA分析；

图3b为小鼠肺脏HE染色分析。

****，P<0.0001。Trim41

图4：Western Blot分析Trim41缺陷小鼠来源的骨髓来源巨噬细胞，在用病毒处理后，炎症相关信号通路的活化明显减弱。

图5：ELISA分析显示利用小干扰RNA干扰人来源巨噬细胞系THP1的TRIM41后，能明显降低病毒刺激后促炎症细胞因子的产生。

***，P<0.001；****，P<0.0001。Ctrl代表对照组，Trim41 KD代表Trim41干扰组；Mock为重悬病原体用的DMEM培养液，此处作为对照组。

具体实施方式

本申请人通过大量的研究和动物模型试验，发现干扰或敲除TRIM41的表达在炎性疾病或病症(例如细菌或病毒感染)中，能有效抑制促炎症细胞因子的产生、改善器官功能状态。在此，基础上本申请人完成了本申请。

具体而言，针对炎症相关基因进行应用研究是炎症分子生物学和细胞生物学研究的热点，利用小干扰RNA将炎症促进基因的表达敲低，应用于炎症的预防和治疗是人工干预细菌性感染的有效技术，因此无论是在功能基因组研究，还是炎症相关地基因治疗方面均具有广阔地应用前景。

发明人通过研究发现：Trim41缺陷或敲低明显抑制炎性反应。在VSV和HSV-1的感染模型中，观察到Trim41缺陷能够显著抑制促炎症细胞因子和I型干扰素产生，Trim41缺陷小鼠对VSV和HSV-1诱导的肺脏损伤更为轻微，提示干扰敲低Trim41可能具备治疗感染相关炎症性疾病的应用前景。由此，本申请提供了将Trim41的小干扰RNA应用于感染性疾病相关炎症的预防和治疗中的方法和策略，特别是可用感染所导致的肺脏损伤。

本申请针对具有抗炎作用的新型Trim41小干扰RNA，对免疫细胞中巨噬细胞在微生物成分作用下的促炎症细胞因子的产生进行了研究，并且验证了应用该小干扰RNA对感染相关炎症的治疗作用。实验证明：1)巨噬细胞中干扰敲低Trim41能抑制病毒诱导的促炎症细胞因子和I型干扰素的产生；2)Trim41缺陷的巨噬细胞在病原体感染时产生更少的促炎症细胞因子和I型干扰素；3)Trim41缺陷小鼠在VSV和HSV-1感染模型中，外周血促炎症细胞因子子和I型干扰素更少，肺脏炎症损伤也更轻；4)干扰敲低Trim41抑制巨噬细胞炎症相关信号转导；5)干扰敲低人巨噬细胞系中的Trim41能抑制病毒刺激后促炎症细胞因子和I型干扰素的产生。

本申请中证明了Trim41的抑制物能够抑制促炎症细胞因子的表达、减少炎症和器官损伤。这些发现证实了Trim41的抑制物(例如小干扰RNA)可望成为治疗和预防炎性疾病(例如感染相关炎症)的有效手段。

本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，术语“TRIM41”具有其广义的含义，包括Trim41基因、Trim41的mRNA、cDNA、TRIM41前体、TRIM41蛋白、其修饰或剪切产物、或活性片段。

TRIM41可来源于人、非人灵长类动物(例如猩猩、猿)、啮齿动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠)、宠物(例如猫、狗)、家畜(例如马、牛、羊、猪、兔)等。

Trim41的序列可为例如：在人[Homo sapiens(human)]中对应于NCBI Gene ID：90933；在小鼠[Mus musculus(house mouse)]中对应于NCBI Gene ID：211007；在大鼠[Rattus norvegicus(Norway rat)]中对应于NCBI Gene ID：303088。TRIM41的蛋白质序列可为例如：GI：42516572/116242826、GI：81889232/124358936、GI:197927145等中所示。

如本文所用，术语“TRIM41的抑制物”或“抑制物”具有其广义的含义，是指能够降低或削弱或消除TRIM41的水平或功能的物质。抑制物可包括但不限于：降低Trim41转录、翻译表达水平的物质(例如敲减或敲除Trim41表达的物质)，抑制Trim41功能的物质等。

在一些实施方式中，TRIM41的抑制物包括但不限于：抑制TRIM41的物质(如化合物，例如小分子化合物)，针对TRIM41或其前体生成的上游代谢酶的抗体(例如针对IRG1或OGDH的抗体)、siRNA(例如SEQ ID NO:1～12中任一所示的针对TRIM41的siRNA)、miRNA、反义寡核苷酸、CRISPR/Cas9基因编辑产品、锌指蛋白、抑制TRIM41或其前体功能和/或活性的化合物、下调TRIM41的基因或mRNA或蛋白表达水平的启动子元件和/或表达载体。

本领域普通技术人员可针对TRIM41设计或获得其相应的抑制物，以通过阻断或抑制该酶的表达或活性，从而产生预防和/或治疗炎性疾病和/或病症的效果。

本公开还提供了一种产品，其可为药物组合物或药盒，其中含有有效量的本公开的TRIM41抑制物，以及药学上或免疫学上可接受的载体。如本文所用，术语“活性物质”或“活性成分”可互换使用，是指TRIM41抑制物。

本公开的抑制物和产品可用于预防和/或治疗炎症或与之相关的疾病和/或病症。例如，感染引起的炎症，所述感染可为DNA病毒和/或RNA病毒感染，例如由选自下组的一种或多种病毒引起的感染：单纯疱疹病毒、水泡性口炎病毒、流感病毒、脑心肌炎病毒、仙台病毒、乙型肝炎病毒、腺病毒、痘病毒、小DNA病毒、腺相关病毒。

炎性疾病和/或症状可包括但不限于选自下组中的一种或多种：促炎症细胞因子(例如IL-6、TNFα、I型干扰素(如IFNβ)、IL-1)的过量产生，如炎症因子风暴；病毒性或内毒素性休克或死亡；器官的炎性损伤或多器官功能衰竭，例如所述器官选自：肝脏、脾脏、脑、肾、心脏、肺、胃、肠；病毒感染导致的慢性炎症性疾病。如本文所用，术语“促炎症细胞因子”、“前炎症因子”和“炎症因子”可互换使用。

本公开的抑制物或产品可用于不同的对象，优选哺乳动物对象，例如人、宠物、家畜。并且，本公开的抑制物或产品在预防或治疗具有天然免疫缺陷的对象时具有优势，例如具有天然免疫缺陷/受损和/或干扰素抗病毒感染治疗无效或效果不佳或易产生副作用的对象，如患有自身免疫性疾病或易患自身免疫性疾病的对象，如IFN功能不全或过激对象(如患有炎症性肠病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、慢性肾炎、结核病、慢性胃肠道疾病的对象)。

如本文所用，术语“药学上/免疫学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。如本文所用，术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于预防和/或治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的，在《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。

在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

本公开的产品中还可包含免疫上可接受的佐剂，例如所述佐剂选自：铝佐剂、霍乱毒素及其亚单位、寡脱氧核苷酸、锰离子佐剂、胶体锰佐剂、弗氏佐剂、MF59佐剂、QS-21佐剂、Poly I:C及其他TLR配体、GM-CSF、IL-2、IL-3、IL-7、IL-11、IL-12、IL-18、IL-21。

本公开的产品中的活性物质占组合物总重量的0.001～99.9wt％；优选为组合物总重量的1～95wt％，较优选为5～90wt％，更优选10～80wt％。余量可为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。

如本文所用，术语“单位剂型”是指为了服用方便，将本公开的产品制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。

在本公开的另一些实施方式中，所述产品为单位剂型或多剂型。在本公开的另一些实施方式中，每天施用1～6剂本公开的组合物，如1～3剂，或1剂。

应理解，所用抑制物或药物的有效剂量可随待施用或治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据对象的个体情况(例如对象体重、年龄、身体状况、所需达到的效果)来决定，这在熟练医师可以判断的范围内。

本公开的产品可以为固态(如颗粒剂、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含片)或液态(如口服液)或其它合适的形状。给药途径可根据抑制物的种类采用但不限于：口服、注射(例如直接裸DNA或蛋白质注射法、脂质体包裹DNA或蛋白质注射法)、金包被基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法或目的基因所编码蛋白质、电致孔、鼻腔给药、肺部给药、口服给药、透皮给药等。

此外，本公开的产品中还可含有用于改善和治疗炎性疾病或症状的其它活性物质，所述的其它活性物质包括但不限于：临床常用抗病毒药，如三环胺类、焦磷酸类、蛋白酶抑制药、核苷类药物、反义寡核苷酸类、干扰素、利巴韦林、金刚烷胺、奥司他韦等；抗生素，例如β-内酰胺类(青霉素类和头孢菌素类)、氨基糖甙类、四环素类、氯霉素类、大环内酯类、抗真菌抗生素、抗结核类抗生素；临床常用免疫抑制剂，例如糖皮质激素、环磷酰胺、氯喹、环孢霉素A、雷公藤、中药制剂、抗TNF单克隆抗体。

并且，本公开的抑制物或产品相互间可以联合应用，还可以与其它药物和治疗手段联合，用于炎性疾病或病症的治疗。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例中所用小干扰RNA的序列如下所示：

C57BL/6J小鼠，雄性，周龄6-8周，购买自上海必凯实验动物有限公司。用3％的巯基乙酸钠肉汤(购自merck)对小鼠进行腹腔注射，注射四天后，小鼠断颈处死，剪开表皮暴露腹膜，用无血清DMEM培养基反复冲洗腹腔，获取小鼠腹腔巨噬细胞，按4×10

水泡口炎病毒(VSV，ATCC VR-1238)和单纯疱疹病毒(HSV-1，F-strain，ATCC VR-260)均购自ATCC。将不同病毒计算出不同的MOI值(见下述)加入细胞培养液进行刺激。

鼠源TRIM41小干扰RNA购自上海吉玛基因，按照说明书步骤与LipofectamineRNAiMAX脂质体(购自life techonology公司)共孵育后，加入细胞培养液进行RNA干扰实验，小干扰RNA终浓度为20nM，干扰时间为48小时。

Western blot根据实验室常用方法进行，细胞因子mRNA水平利用荧光定量PCR进行检测，培养上清中细胞因子蛋白水平用相应因子的ELISA检测试剂盒(购自Biolegend)按照说明书步骤进行检测。

首先用VSV病毒(MOI＝1)及HSV-1病毒(MOI＝5)处理小鼠腹腔巨噬细胞不同时间(如图示)后，收集RNA和蛋白质，通过荧光定量PCR和Western blot实验检测TRIM41的表达量变化。然后验证Trim41小干扰RNA的敲低效率后，用于后续实验，并检测干扰Trim41后，病毒感染巨噬细胞时促炎症细胞因子mRNA和蛋白水平。

Trim41表达量分析的结果分别如图1a、1b所示。结果显示：病毒感染后TRIM41的表达量明显降低。

Trim41的小干扰RNA的效率验证结果如图1c所示。结果显示：各siRNA对Trim41均具有干扰作用，其中siRNA1的干扰效率最强，用于后续实验。

病毒刺激后促炎症细胞因子mRNA水平如图1d、1e所示：干扰Trim41抑制促炎症细胞因子及I型干扰素的mRNA的产生。

ELISA结果如图1f、1g所示：干扰Trim41抑制促炎症细胞因子及I型干扰素的蛋白产生。图中的Mock为重悬病原体用的DMEM培养液，此处作为对照组。

本实施例的结果表明：Trim41的小干扰RNA可以抑制病毒感染巨噬细胞后促炎症细胞因子及I型干扰素的产生。

Trim41缺陷小鼠委托上海南方模式生物科技发展有限公司构建，基于S129胚胎干细胞打靶，植入C57假孕小鼠体内获得F1代。在SPF环境下饲养，F1代小鼠与C57BL/6J杂交培育10代以上后，进行基因型鉴定，鉴定出Trim41

取6-8周上述小鼠骨髓细胞，Tris-NH

水泡口炎病毒(VSV，ATCC VR-1238)、仙台病毒(SeV，ATCC VR-105)、单纯疱疹病毒(HSV-1，F-strain，ATCC VR-260)、痘苗病毒(VACV，ATCC VR-1536)和李斯特菌(LM，ATCC19115)均购自ATCC。不同病毒计算出不同的MOI值(见下述)加入细胞培养液进行刺激。

病毒核酸类似物poly(I:C)(tlrl-picwlv)、5’ppp-dsRNA(tlrl-3prna)、HSV-60(tlrl-hsv60n)、ISD(tlrl-isdn)均购自InvivoGen公司，按脂质体interferin(购自polyplus公司)说明书与核酸类似物共孵育，并加入巨噬细胞培养上清进行刺激。

细胞培养液中的细胞因子ELISA检测方法同实施例1。

按上述方法将核酸类似物及脂质体混合物加入巨噬细胞培养上清(图2a)或用RNA病毒VSV、SeV病毒及李斯特菌(MOI＝1)，DNA病毒HSV-1、VACV病毒(MOI＝5)处理不同组的骨髓来源巨噬细胞，对细胞培养上清中促炎症细胞因子TNFα、IL-6以及IFN-β产量的ELISA分析。图2a中Liposome代表单加脂质体对照组，图2b中Mock为重悬病原体用的DMEM培养液，此处作为对照组。

结果如图2a和2b所示。

结果显示：核酸类似物刺激或病原体感染骨髓来源巨噬细胞后，Trim41的缺陷能明显抑制促炎症细胞因子及I型干扰素的产生。

本实施例的结果表明：Trim41缺陷细胞在感染时产生更少的促炎症细胞因子及I型干扰素。

缺陷小鼠的获得、病原体来源以及细胞因子水平检测同实施例2，小鼠组织器官HE染色交由谷歌生物公司完成。

给Trim41缺陷小鼠腹腔注射1×10

Trim41缺陷对小鼠感染后外周血促炎症细胞因子产生的影响如图3a所示，对肺脏炎症损伤如图3b所示。

结果显示：Trim41缺陷小鼠在病原体感染时产生显著更低的促炎症细胞因子；同时肺脏炎症损伤也更轻。在野生型小鼠肺脏中，能观察到更多核深染的炎症细胞的浸润及组织损伤。图3b中模拟物为稀释病原体用的平衡盐PBS溶液，作为无感染对照。

该结果表明：Trim41缺陷抑制病原体感染小鼠后的促炎症细胞因子及炎症损伤。

缺陷小鼠的获得、骨髓来源巨噬细胞的培养、病原体来源同实施例2，Westernblot检测仍按照实验室常规流程进行。

用RNA病毒VSV(MOI＝1)和DNA病毒HSV-1(MOI＝5)处理Trim41

Western blot分析结果如图4所示。

结果显示：病毒感染骨髓来源巨噬细胞后，Trim41的缺陷能明显抑制炎症相关信号通路NF-κB、TBK1-IRF3、JNK及P38的活化，对ERK信号无明显影响。并且Trim41缺陷对未刺激组无明显影响。

THP1细胞系(ATCC TIB-202)购自ATCC。人源TRIM41小干扰RNA由上海吉玛基因设计合成。病毒来源、处理方式同实施例1。

THP1细胞按3×10

对Trim41的人源小干扰RNA的效率进行验证。选取其中干扰效率最强的H-siRNA1用于后续实验。

用Trim41的小干扰RNA处理THP1细胞，用RNA病毒VSV(MOI＝1)和DNA病毒HSV-1(MOI＝5)处理不同组的THP1细胞，对细胞培养上清中促炎症细胞因子TNFα、IL-6以及IFN-β产量进行ELISA分析。

ELISA结果如图5所示。

结果显示：干扰THP1中Trim41极为有效地抑制了促炎症细胞因子及I型干扰素蛋白的产生。

在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本申请的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 苏州系统医学研究所

<120> TRIM41抑制物、其抗炎作用及应用

<130> 210422 1CNCN

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccaucugccu cgauuacuut t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

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<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

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<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

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<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

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<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

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<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ugaaagucuc cuugauguct t 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

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