一株副球菌及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株副球菌及其应用。

背景技术

米氏凯伦藻常见于温带和热带浅海水域，是一种典型的鱼毒性赤潮藻。近几年来，米氏凯伦藻与其他藻类多次在渤海引发赤潮，污染面积和次数逐渐增大。作为一种有毒藻类，米氏凯伦藻能分泌溶血性毒素，危害鱼类和无脊椎动物，引起养殖生物死亡，造成渔业经济损失，严重破坏了海洋生态系统，甚至通过食物链的传播，威胁到人类的健康。

由于生物方法资源广泛、生态安全性高等特点，近年来逐渐成为了防治有害赤潮研究的热点，而微生物因其资源广泛、生长周期短而逐渐在生物方法防治有害赤潮的研究中脱颖而出。

冷冻干燥就是把含有大量水分物质，预先进行降温冻结成固体，然后在真空的条件下使固态水直接升华出来，而物质本身剩留在冻结时的冰架中，因此它干燥后体积不变。固态水在升华时要吸收热量，引起产品本身温度的下降而减慢升华速度，为了增加升华速度，缩短干燥时间，必须要对产品进行适当加热。整个干燥是在较低的温度下进行的。冷冻干燥在低温下进行，因此对于许多热敏性的物质特别适用。如蛋白质、微生物之类不会发生变性或失去生物活力。因此在医药上得到广泛地应用。在低温下干燥时，物质中的一些挥发性成分损失很小，适合一些化学产品，药品和食品干燥。在冷冻干燥过程中，微生物的生长和酶的作用无法进行，因此能保持原来的性状。由于在冻结的状态下进行干燥，因此体积几乎不变，保持了原来的结构，不会发生浓缩现象。干燥后的物质，加水后溶解迅速而完全，几乎立即恢复原来的性状。由于干燥在真空下进行，氧气极少，因此一些易氧化的物质得到了保护。干燥能排除95-99%以上的水份，使干燥后产品能长期保存而不致变质。

因此，冷冻干燥在医药工业，食品工业，科研和其他部门得到广泛的应用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明通过筛选获得一株对抑制米氏凯伦藻效果非常突出的副球菌菌株，经过鉴定，确定所筛选的菌株为副球菌。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一株副球菌（

所述的副球菌，经实验证明，对抑制米氏凯伦藻效果非常突出，因此，可以将副球菌直接应用于抑制米氏凯伦藻，或者以副球菌为原料制备用于抑制米氏凯伦藻的制剂，比如：培养该菌获得培养物，并添加或不添加其它药物、辅料等加工制备成菌剂。本发明为研究副球菌的抑制米氏凯伦藻的机制、用途、菌剂开发等提供了优良的菌种资源。

本申请中将副球菌制成副球菌冻干粉生物抑藻剂，其制备方法包括以下步骤：

（1）使用2216E培养基活化保藏编号为CGMCC No.23109的副球菌，吸取菌种放入锥形瓶，在恒温震荡培养箱中培养3d；

（2）使用2216E培养基发酵3d进行扩大培养，得到发酵液；

（3）将发酵液蒸发至晶体析出，将析出的晶体溶于蒸馏水检测抑藻活性，当析出的晶体开始具有抑藻效果时停止蒸发，收集上清液，将析出的晶体和沉淀的菌体去除；

（4）将收集到的上清液在冻干机中冻干至重量不再变化，得到副球菌冻干粉生物抑藻剂。冻干过程中应每隔4h进行称重，待冻干至恒重时停止冻干，收集粉末。

进一步地，步骤（1）所述的吸取菌种的体积为培养基体积的1%。

进一步地，步骤（1）所述的2216E培养基，其配方为：蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，磷酸高铁0.01g，琼脂16.0g，海水1000ml，调pH至7.6-7.8，培养条件为29℃，120r/min。

进一步地，步骤（2）所述的扩大培养的培养条件为29℃，转子转速为180r/min，pH控制在7.6-7.8,接种量为1%。

进一步地，步骤（3）所述的蒸发的温度为60℃-70℃。

有益效果

本发明提供了一株能有效抑制有害赤潮米氏凯伦藻暴发的菌株—副球菌的冻干粉剂，其效果好，环境友好性高，制备简单成本较低，为开发新型的米氏凯伦藻抑制剂提供理论支持，奠定基础。

菌种保藏信息

保藏时间：2021年8月4日；

保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心；

保藏编号：CGMCC No. 23109 ；

保藏单位地址：保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

分类命名：

附图说明

图1 对比例1中制备的副球菌冻干粉生物抑藻剂抑藻效果；

图 2 实施例1中制备的副球菌冻干粉生物抑藻剂抑藻效果；

图 3实施例2中制备的副球菌冻干粉生物抑藻剂抑藻效果；

图4为副球菌的显微结构。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

以下实施例中的副球菌于黄河入海口处的泥中分离得到，采用2216E培养基分离培养获得其纯培养，其保藏的分类学名称为副球菌

显微结构特征：（附图4）

菌种分子鉴定：序列如下：

CGGAAGCGAAAGACCTTCGGGTCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAACGTGCCCTTTGCTACGGAATAGTCCCGGGAAACTGGGTTTAATACCGTATGTGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGGCAAAGGATCGGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTAGACAATGGGGGCAACCCTGATCTAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCAGCTGGGAAGATAATGACGGTACCAGCAGAAGAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGACTGGAAAGTTGGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCTCGGAACTGCCTTCAAAACTATCAGTCTGGAGTTCGAGAGAGGTGAGTGGAATACCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGTGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGTCGTCGGGTTGCATGCAATTCGGTGACACACCTAACGGATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAACCCTTGACATCCCTGGACCGATCCGGAGACGGATCTTTCACTTCGGTGACCAGGTGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTCGGTTAAGTCCGGCAACGAGCGCAACCCACGTCCCTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTATGGAAACTGCCGATGATAAGTCGGAAGGAAGGTGTGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGGGGTGACAGGGGGTTAATCCCCCAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGGCCTCTGCAACT

正反向测序并拼接后获得该菌的16SrDNA序列，将该序列于NCBI数据库进行Blast比对，比对结果显示，与副球菌同源性最高，达99％，菌株命名为副球菌(

供试样品

副球菌，由曲阜师范大学实验室提供。

供试样品

米氏凯伦藻，由中国海洋大学惠赠。

药品与试剂

表1 药品

仪器

对比例1

副球菌冻干粉生物抑藻剂，制备方法主要其具体制备步骤如下：

①使用2216E培养基活化副球菌，甘油管保存的温度应为-80℃，吸取甘油管中菌体的体积，应为培养基体积的1%，活化培养基应为“甘油-硫酸铵”培养基，其配方为：K

②将活化的副球菌作为菌种，在大型培养装置中使用2216E培养基发酵3d，得到大量发酵液。大型培养装置是指培养体积超过5L的微生物发酵系统，培养条件为29℃，转子转速为180r/min，pH控制在7.6-7.8之间，接种量为1%。

③将收集到的发酵液使用恒温蒸发器高温蒸发至有大量晶体析出，蒸发器的温度应保持在60℃，将析出的晶体溶于蒸馏水检测抑藻活性，当析出的晶体开始具有抑藻效果时停止蒸发，收集上清液，将析出的晶体和沉淀的菌体去除。蒸发过程中，应每半小时采集一次晶体进行抑藻实验，收集的上清液应清澈透明，必要时可采用离心等方式提高上清液的纯净度。

④将收集到的上清液在冻干机中冻干至重量不再变化，冻干过程中应每隔4h进行称重，待冻干至恒重时停止冻干，收集粉末，得到具有抑藻效果的副球菌冻干粉生物抑藻剂。

实施例1

副球菌冻干粉生物抑藻剂，制备方法主要其具体制备步骤如下：

①使用2216E培养基活化副球菌，甘油管保存的温度应为-80℃，吸取甘油管中菌体的体积，应为培养基体积的1%，活化培养基应为2216E培养基，其配方为：蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，磷酸高铁0.01g，琼脂16.0g，陈海水1000ml，调pH至7.6-7.8，培养条件为29℃，120r/min，使用300ml锥形瓶，在恒温震荡培养箱中培养3d。

②将活化的副球菌作为菌种，在大型培养装置中使用2216E培养基发酵3d，得到大量发酵液。大型培养装置是指培养体积超过5L的微生物发酵系统，培养条件为29℃，转子转速为180r/min，pH控制在7.6-7.8之间，接种量为1%。

③将收集到的发酵液使用恒温蒸发器高温蒸发至有大量晶体析出，蒸发器的温度应保持在60℃，将析出的晶体溶于蒸馏水检测抑藻活性，当析出的晶体开始具有抑藻效果时停止蒸发，收集上清液，将析出的晶体和沉淀的菌体去除。蒸发过程中，应每半小时采集一次晶体进行抑藻实验，收集的上清液应清澈透明，必要时可采用离心等方式提高上清液的纯净度。

④将收集到的上清液在冻干机中冻干至重量不再变化，冻干过程中应每隔4h进行称重，待冻干至恒重时停止冻干，收集粉末，得到具有抑藻效果的副球菌冻干粉生物抑藻剂。

实施例2

副球菌冻干粉生物抑藻剂，制备方法主要其具体制备步骤如下：

①使用2216E培养基活化副球菌，甘油管保存的温度应为-80℃，吸取甘油管中菌体的体积，应为培养基体积的1%，活化培养基应为2216E培养基，其配方为：蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，磷酸高铁0.01g，琼脂16.0g，陈海水1000ml，调pH至7.6-7.8，培养条件为29℃，120r/min，使用300ml锥形瓶，在恒温震荡培养箱中培养3d。

②将活化的副球菌作为菌种，在大型培养装置中使用2216E培养基发酵3d，得到大量发酵液。大型培养装置是指培养体积超过5L的微生物发酵系统，培养条件为29℃，转子转速为180r/min，pH控制在7.6-7.8之间，接种量为1%。

③将收集到的发酵液使用恒温蒸发器高温蒸发至有大量晶体析出，蒸发器的温度应保持在80℃，将析出的晶体溶于蒸馏水检测抑藻活性，当析出的晶体开始具有抑藻效果时停止蒸发，收集上清液，将析出的晶体和沉淀的菌体去除。蒸发过程中，应每半小时采集一次晶体进行抑藻实验，收集的上清液应清澈透明，必要时可采用离心等方式提高上清液的纯净度。

④将收集到的上清液在冻干机中冻干至重量不再变化，冻干过程中应每隔4h进行称重，待冻干至恒重时停止冻干，收集粉末，得到具有抑藻效果的副球菌冻干粉生物抑藻剂。

2.结果与分析

图1为对比例1中制备的粉剂抑藻效果，图2为实施例1中抑藻效果，可见对比例1中使用的“甘油-硫酸铵”培养基制备的副球菌冻干粉生物抑藻剂也具有明显的抑藻效果，但效果不如2216E培养基。而在实施例2中提高了蒸发温度，其抑藻效果大打折扣，抑藻效果几乎消失（图 3），从而确认60℃的蒸发条件更为恰当。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110>曲阜师范大学

<120> 一株副球菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1184

<212> DNA

<213> Paracoccus sp.

<400> 1

cggaagcgaa agaccttcgg gtctagcggc ggacgggtga gtaacgcgtg ggaacgtgcc 60

ctttgctacg gaatagtccc gggaaactgg gtttaatacc gtatgtgccc ttcgggggaa 120

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ggttgcatgc aattcggtga cacacctaac ggattaagca ttccgcctgg ggagtacggt 780

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gtgagatgtt cggttaagtc cggcaacgag cgcaacccac gtccctagtt gccagcattc 1020

agttgggcac tctatggaaa ctgccgatga taagtcggaa ggaaggtgtg gatgacgtca 1080

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