用于精准快速鉴定水稻转基因后代纯合株系的扩增引物及其鉴定方法

技术领域

本发明涉及植物转基因技术领域，特别涉及用于精准快速鉴定水稻转基因后代纯合株系的扩增引物及其鉴定方法。

背景技术

植物转基因技术在基因功能研究和分子育种领域发挥着重要作用。如何快速有效地从转基因后代中检测出纯合的植株，是鉴定目标基因效应的必需环节，也是转基因植物研究的重要环节。现有常规的的鉴定方法为先对转基因植株进行拷贝数的鉴定，找出单拷贝的株系，再通过PCR检测或qPCR技术，分析其T1代植株中的纯合体和杂合体；或者对T2代转基因苗的转入基因分离情况进行分析。

目前拷贝数的鉴定方法有两种：一种是直接通过后代植株携带转入基因的分离比例来推算T

发明内容

鉴于此，本发明提出一种用于精准快速鉴定水稻转基因后代纯合株系的扩增引物及其鉴定方法。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种用于精准快速鉴定水稻转基因后代纯合株系的扩增引物，根据载体插入基因组的情况，在单拷贝株系中T-DNA插入位点的两侧侧翼序列分别设计跨插入位点的引物wing F/R，同时在T-DNA区域设计一对引物mcherry F/R。

进一步说明，所述引物mcherry F/R的核苷酸序列如：SEQ ID NO.1-2所示。

进一步说明，在单拷贝株系中T-DNA插入位点的两侧侧翼500bp序列上设计跨插入位点的引物wing F/R。

进一步说明，根据M2单拷贝株系和M7单拷贝株系的不同载体插入基因组的情况，所述跨插入位点的引物wing F/R分别为引物M2 wing F/R和M7 wing F/R。

进一步说明，所述M2单拷贝株系的载体插入基因组的情况为：载体的RB-LB区间插入基因组中的单拷贝转基因植物；所述M7单拷贝株系的载体插入基因组的情况为载体整个序列都插入了基因组中的单拷贝转基因植物。

进一步说明，所述引物M2 wing F/R的核苷酸序列如：SEQ ID NO.3-4所示；所述M7wing F/R的核苷酸序列如：SEQ ID NO.5-6所示。

一种水稻转基因后代纯合株系的鉴定方法，包括如下步骤：

步骤1：通过采用全基因组测序和CTREP-finder平台分析，确定T

步骤2：根据载体插入基因组的情况，在单拷贝株系中T-DNA插入位点的两侧侧翼500bp序列上设计wing F/R引物对，同时联合在T-DNA区域设计mcherry F/R引物对；

步骤3：采用步骤2获得的2对引物组合，对转基因后代不同基因型的基因组DNA进行一次PCR扩增，即可在T1代单株中鉴定获得纯合株系。

进一步说明，根据M2单拷贝株系的载体插入基因组的情况，所述引物组合为M2wing F/R和mcherry F/R。

进一步说明，根据M7单拷贝株系的载体插入基因组的情况，所述引物组合为M7wing F/R和mcherry F/R。

进一步说明，所述PCR扩增的程序为：95℃3min预变性；95℃，15s，60℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃延伸7min；PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过采用了全基因组测序与CTREP-finder平台分析，确定T0代转基因植物的T-DNA插入的拷贝数、准确位置和侧翼序列的基础上，再根据插入位点的两侧侧翼序列设计获得跨插入位点的引物wing F/R，并在T-DNA区域设计引物mcherry F/R，从而实现通过1次PCR扩增即可在T1代单株中快速精准地鉴定获得水稻转基因后代单拷贝纯合株系。本发明通过以M2和M7的2种单拷贝纯系的鉴定，筛选得到了最优的引物组合，实现T1后代中的野生型、杂合株系和纯合株系的快速精确地鉴别区分，结果清晰，纯系与杂合植株的PCR结果差异显著，无需分析计算或特殊仪器。

附图说明

图1为本发明表达载体pCUBi1390的图谱；

图2为本发明M2和M7两个株系的转基因载体在水稻基因组中的插入位点示意图；

图3为本发明不同引物组合对M2和M7两个株系的基因组DNA的PCR扩增示意图；其中，P1、P2为引物mcherry F和mcherry R，P3、P4为引物wing F和wing R；

图4为本发明采用不同引物组合对转基因后代不同基因型的基因组DNA进行PCR电泳检测的结果示意图；

图5为本发明M2和M7两个株系T1后代植株的PCR电泳检测结果示意图，其中，M2,M7代表2个UBI:mcherry的单拷贝株系后代；星号代表纯系植株；M:DNA Marker。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1-DNA提取及全基因组测序

取转基因T0代植株的叶片或T1后代群体的叶片混样(约0.2g组织)，用CTAB法提取基因组DNA。

以“锡稻1号”背景上的UBI:mcherry(表达载体为pCUBi1390)转基因植株为例。载体图谱如图1所示，其mcherry基因的克隆序列如下：

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA

将提取的基因组DNA，送交武汉华大基因有限公司进行全基因组重测序(15×深度)。

实施例2-拷贝数及插入位点分析

将重测序结果上传CTREP-finder网站分析(https://doi.org/10.1016/j.cropd.2022.03.001)，输出拷贝数及插入位点示意图、序列等信息。M2和M7两个株系的转基因载体在水稻基因组中的T-DNA插入位点如附图2所示，T-DNA插入位置、两侧序列信息如下表1所示：

实施例3-引物的设计

根据实施例2所得到的序列结果，查找单拷贝转基因株系中T-DNA插入的两侧侧翼序列。

根据载体插入基因组的情况，单拷贝株系可分为2种：一种以M2为代表，系载体的RB-LB区间插入基因组中的单拷贝转基因植物；另一种以M7为代表，系载体整个序列都插入了基因组中的单拷贝转基因植物。根据插入位点的两侧侧翼500bp序列上设计跨插入位点的wing F/R引物对，即，上下游引物分别设计在T-DNA插入位点的两侧；其中，M2和M7两个株系分别设计的引物序列为M2 wing F/R和M7 wing F/R，同时在T-DNA区域设计一对引物mcherry F/R，如下表2所示：

表2M2和M7两个株系的引物序列

实施例4-PCR扩增

本发明根据实施例3设计的不同引物对，对转基因后代M2和M7两个株系的不同基因型的基因组DNA进行一次PCR扩增，筛选区别其野生型、纯合体和杂合体，PCR反应体系和程序如下：

PCR反应体系

PCR程序为：95℃3min预变性；95℃，15s，60℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃延伸7min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，其结果如图4所示。

根据图4中的不同引物组合的PCR扩增电泳检测结果显示：P1+P2(mcherry F/R)可以区分野生型与阳性苗，P3+P4(M2 wing F/R、M7 wing F/R)可以区分阳性苗中的纯系和杂合体。即，转基因后代M2和M7两个株系由P1+P2(mcherry F/R)和P3+P4(M2 wing F/R、M7wing F/R)两个引物组合扩增时，可有效鉴定出野生型、纯合体和杂合体；而其他的引物组合方式下，则无法有效鉴定野生型、纯合体和杂合体。

此外，对于以M2为代表的RB-LB质粒区间插入基因组的株系而言，当同管扩增引物组合为P1+P2+P3+P4时，也可以一次性鉴定出野生型、纯合体和杂合体。以M7为代表的整个质粒插入基因组的株系中，则分别由P1+P2和P3+P4两个引物组合，才能达到良好的野生型、纯合体和杂合体区分度。

由此，可以筛选得到依次由P1+P2和P3+P4两个引物组合为最佳的引物组合。

实施例5

采用实施例4筛选得到的最优引物组合，采用引物组合P1+P2(mcherry F/R)和P3+P4(M2 wing F/R、M7 wing F/R)，分别对M2和M7的T1代植株的叶片DNA进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，拍照记录并分析结果，结果如图5所示，采用由P1+P2和P3+P4引物组合，可以有效实现单拷贝株系的野生、纯合和杂合体的快速精准鉴别。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。