一种TNF-α纳米抗体的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种TNF-α纳米抗体的制备方法及其应用。

背景技术

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种易复发的自身免疫性疾病，属于炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)的一种。溃疡性结肠炎在临床上的典型症状表现为血性腹泻、夜间排便、急症和里急后重，在最初的隐匿期后，它表现出粘膜炎症反复发作和缓解的特征。IBD的致病机制尚不明确，遗传、免疫和环境因素，如饮食、压力、吸烟和自由基等，都参与了其发展。

在世界范围内，UC的发病率呈现出逐年上升的趋势。随着UC患病率的上升，整体医疗成本也会上升。因此，开发新型的高效低毒的治疗药物成为需求。

anti-TNF-α抗体药物在20世纪90年代后期开发，在治疗自身免疫性疾病如炎症性肠病，强直性脊柱炎，牛皮癣和类风湿性关节炎方面取得了巨大成功。目前常见的TNF-α抗体药物包括英夫利昔单抗、阿达木单抗、戈利木单抗、赛妥珠单抗和依那西普。

由于市售的TNF-α抗体由于分子量大、结构复杂，只能由哺乳动物细胞表达，因此，TNF-α抗体药物价格昂贵，一直高居全球各类药物销售的榜首。研发高活性、低成本的TNF-α抗体药物、使之成为“老百姓用得起的药物”一直成为全球制药行业的努力目标。

目前，缺乏一种成本低廉的、适于在大肠杆菌中制备高活性的TNF-α纳米抗体的制备方法及其应用。

发明内容

本发明的目的在于为了解决现有技术中的问题，而提出的一种具有高活性、适于在大肠杆菌中表达和纯化高活性的TNF-α纳米抗体的制备方法及其应用。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明的所述的TNF-α纳米抗体的制备方法，在大肠杆菌中进行表达和分离纯化，具体包括如下步骤：

(1)通过酶切和酶联反应将TNF-α纳米抗体基因导入pET28a载体，构建表达质粒；

(2)将目的质粒转入BL21(DE3)感受态细胞，转化后取适量菌液涂布在含有卡那霉素的LB平板上37℃过夜培养；

(3)挑取阳性克隆在含卡那霉素的LB培养基中进行扩大培养，在15℃条件下加入5mM的IPTG诱导20h；通过离心收取细胞沉淀，向体系中加入蛋白缓冲液，使用匀浆机破碎细胞，离心后收取上清液；通过柱层析进行分离纯化，制得TNF-α纳米抗体。

在步骤(1)中，所述的TNF-α纳米抗体为具有如下氨基酸序列：

(1)由SEQ ID No.1或2或3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(2)与序列SEQ ID No.1或2或3限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或

(3)SEQ ID No.1或2或3所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。

在步骤(1)中，所述的TNF-α纳米抗体为TNF-α纳米抗体V19或TNF-α纳米抗体V7或TNF-α纳米抗体V1，所述的TNF-α纳米抗体V19为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，所述的TNF-α纳米抗体V7为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，所述的TNF-α纳米抗体V1为SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

进一步地，在步骤(1)中，通过酶切酶联反应将如SEQ ID No.1或SEQ IDNo.2或SEQID No.3所述的TNF-α纳米抗体基因导入pET28a载体，构建质粒；

(2)将目的质粒转入BL21(DE3)感受态细胞轻轻混匀后冰浴30min，42℃热激45s，冰上静置2min后加入600μl无抗生素LB培养基后37℃震荡1h，离心后弃上清，留下少许培养基重悬菌液；转化后取适量菌液涂布在含有卡那霉素的LB平板上37℃过夜培养；

(3)挑取阳性克隆在含卡那霉素的LB培养基中进行扩大培养，在15℃条件下加入5mM的IPTG诱导20h；表达的TNF-α纳米抗体蛋白中包含His标签；

通过离心收取细胞沉淀，向体系中加入蛋白缓冲液，使用匀浆机破碎细胞，离心后收取上清液，表达的TNF-α纳米抗体以可溶性形式存在于上清液中；

使用蛋白缓冲液平衡含有Ni-NTA树脂的柱子后，使上清液缓慢通过Ni-NTA从而将目的TNF-α纳米抗体结合在Ni-NTA上，之后使用蛋白洗脱液进行洗脱；蛋白缓冲液由如下组分组成：300mM NaCl，50mM Tris-HCl，0.5mMβ-巯基乙醇，pH 7.8；蛋白洗脱液由如下组分组成：80mM imidazole，300mM NaCl，50mM Tris-HCl，0.5mMβ-巯基乙醇，pH 7.8；

(4)在4℃条件下使用HRV3C酶剪切TNF-α纳米抗体上的His标签12h；将溶液重新通过Ni-NTA以得到不含His标签的TNF-α纳米抗体，使用PBS缓冲液过夜透析后浓缩并保存；制得TNF-α纳米抗体；用12％ SDS-PAGE验证TNF-α纳米抗体的分子量和纯度。

进一步地，在步骤(3)中，所述的第一次离心的速率为2500rpm，离心的时间为5min；在步骤(3)中，所述的第二次离心的速率为4000rpm，离心的时间为20min，离心的温度为4℃；所述的第三次离心的速率为12000rpm，离心的时间为30min，离心的温度为4℃。

更进一步地，在步骤(3)中，所述的蛋白缓冲液由300mM NaCl，50mM Tris-HCl，0.5mMβ-巯基乙醇组成，所述的蛋白缓冲液的pH为7.8。

进一步地，在步骤(3)中，所述的蛋白洗脱液由80mM imidazole，300mM NaCl，50mMTris-HCl和0.5mMβ-巯基乙醇组成，所述的蛋白洗脱液的pH为7.8；在步骤(4)中，用12％SDS-PAGE验证TNF-α纳米抗体的分子量和纯度。

本发明所述的TNF-α纳米抗体在制备炎症药物中的应用。

本发明所述的TNF-α纳米抗体在制备溃疡性结肠炎药物中的应用。

有益效果：本发明建立了适于在大肠杆菌中表达和制备高活性的TNF-α纳米抗体的制备方法，纳米抗体亲和力可以高达6.5pM(V19)、146nM(V7)远好于目前上市的TNF-α抗体药物的亲和力。具有高活性的TNF-α纳米抗体能够在大肠杆菌中进行表达和分离纯化，成功避免了大肠杆菌表达系统难以可溶性表达抗体类蛋白质；即使能够表达，也因为蛋白质折叠不安全的原因、其活性较低的难题。

与现有技术相比，本发明具备以下优点：

(1)本发明制备的TNF-α纳米抗体与现有的哺乳动物系统表达的TNF-α抗体药物相比，不仅具有优越的亲和力，而且展现出显著的治疗效果(以溃疡性结肠炎为例)。

(2)本发明表达和制备的TNF-α纳米抗体还能够在大肠杆菌中以可溶性形式表达，存在于细胞裂解上清液中，具有生物活性高的特点。

(3)本发明表达和制备的TNF-α纳米抗体能够在大肠杆菌中可溶性形式表达和分离纯化，避免了复杂和昂贵的哺乳动物细胞表达及其繁琐、高成本的分离制备；明显降低了生产成本。

附图说明

图1为本发明的TNF-α纳米抗体的纯化与表征；A：通过亲和层析表达和纯化TNF-α纳米抗体；B：通过MST检测TNF-α纳米抗体与鼠源s-TNF-α的亲和力。

图2为本发明的不同剂量TNF-α纳米抗体对DSS小鼠体重及结肠长度的影响。A：TNF-α纳米抗体治疗DSS诱导的结肠炎期间的一系列体重变化；B：第8天各组的代表性结肠的长度比较。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

所述的TNF-α纳米抗体为TNF-α纳米抗体V19或TNF-α纳米抗体V7或TNF-α纳米抗体V1，所述的TNF-α纳米抗体V19为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，所述的TNF-α纳米抗体V7为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，所述的TNF-α纳米抗体V1为SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

由于TNF-α作为炎症因子，在炎症性疾病中发挥核心作用，因此，TNF-α抗体被广泛用于治疗炎症性肠病，强直性脊柱炎，牛皮癣和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病。本发明中仅以炎症性肠病作为TNF-α纳米抗体的疾病治疗模型，所述的TNF-α纳米抗体在治疗其他自身免疫性疾病，例如，强直性脊柱炎、过敏性鼻炎等模型中也均表现出优异的治疗效果。同时，TNF-α纳米抗体能够像目前临床使用的TNF-α抗体药物一样与其他治疗药物获治疗方法联合使用。

本发明所述的TNF-α纳米抗体制备方法所制备的TNF-α纳米抗体在制备炎症药物中的应用。

本发明所述的TNF-α纳米抗体制备方法所制备的TNF-α纳米抗体在制备溃疡性结肠炎药物中的应用。

本发明三种TNF-α纳米抗体均可在大肠杆菌中可溶性表达和分离纯化，因此，本发明中仅以其中的TNF-α纳米抗体V7为例。

实施例1

如图1至图2所示，本发明首先在大肠杆菌中原核表达TNF-α纳米抗体V7，具体步骤为：通过酶切和酶联反应将如SEQ ID No.2所示的TNF-α纳米抗体V7基因导入pET28a载体，构建表达质粒。

将目的质粒转入BL21(DE3)感受态细胞轻轻混匀后冰浴30min，42℃热激45s,冰上静置2min后加入600μl无抗LB培养基后37℃震荡1h，离心(2500rpm，5min)后弃上清，留下少许培养基重悬菌液。

转化后取适量菌液涂布在含有卡那霉素的LB平板上37℃过夜培养。

挑取阳性克隆在含卡那霉素的LB培养基中进行扩大培养，在15℃条件下加入5mM的IPTG诱导20h。表达的TNF-α纳米抗体V7蛋白中包含His标签。

通过离心(4000rpm，20min，4℃)收取细胞沉淀，向体系中加入蛋白缓冲液，使用匀浆机破碎细胞，离心(12000rpm，30min，4℃)后收取上清液，表达的TNF-α纳米抗体以可溶性形式存在于上清液中。

蛋白缓冲液配方：①300mM NaCl，②50mM Tris-HCl，③0.5mMβ-巯基乙醇。④pH7.8。

使用蛋白缓冲液平衡含有Ni-NTA树脂的柱子后，使上清液缓慢通过Ni-NTA从而将目的TNF-α纳米抗体V7结合在Ni-NTA上，之后使用洗脱液进行洗脱。

蛋白洗脱液配方：①80mM imidazole，②300mM NaCl，③50mM Tris-HCl，④0.5mMβ-巯基乙醇，⑤pH 7.8。

在4℃条件下使用HRV3C酶剪切TNF-α纳米抗体V7蛋白上的His标签12h。

将溶液重新通过Ni-NTA以得到不含His标签的TNF-α纳米抗体V7，使用PBS缓冲液过夜透析后浓缩并保存(-80℃)。

用12％ SDS-PAGE验证TNF-α纳米抗体V7的分子量和纯度。

如图1A所示，孔道中为纯化后切除His标签后的TNF-α纳米抗体V7的蛋白，约为15kDa。

实施例2

本发明通过MST实验检测了纯化的TNF-α纳米抗体V7对可溶性TNF-α(s-TNF-α)的亲和力，具体步骤为：

使用MST缓冲液(50mM HEPES，100mM KCl，0.05％ Tween-20)配制100nM的TNF-α纳米抗体V7溶液。

使用PBST缓冲液制备10μM的人源或鼠源的TNF-α溶液。

TNF-α溶液的最高配体浓度为5μM，并按照16步梯度稀释法进行稀释，每个稀释系列样品的最终体积为10μl。

将10μl 100nM的TNF-α纳米抗体V7与各浓度梯度TNF-α样品混合并摇匀，室温孵育5min后将样品吸到毛细管中，并将毛细管放置于Monolith NT.115仪器中进行检测。

如图1B所示，TNF-α纳米抗体V7及TNF-α纳米抗体V7和鼠源s-TNF-α的解离常数达到146nM，说明本发明在大肠杆菌中制备的TNF-α纳米抗体具有高生物活性，即具有完整、正确的空间折叠的蛋白质结构。TNF-α纳米抗体V19纳米抗体亲和力可以高达6.5pM。

实施例3

本发明证明了TNF-α纳米抗体V7在10mg/kg的剂量下对3％葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的急性结肠炎小鼠具有明显的治疗效果，具体步骤如下：

选用7-9周C57BL/6雌性小鼠(体重18～20g)进行模型诱导。空白对照组小鼠每日喂养正常饮用水，DSS造模组和各给药治疗组小鼠自由饮用含有3％DSS的饮用水，共诱导8天。

从造模第二天开始，小鼠腹腔注射1mg/kg，5mg/kg，10mg/kg TNF-α纳米抗体V7，给药周期为三天一次。

每天记录小鼠的体重和粪便隐血的情况。

如图2A所示，10mg/kg(18.40g±0.9959g，P＝0.0304)和5mg/kg(18.15g±0.5949g，P＝0.014)组的小鼠体重显著高于DSS组(17.03g±2.443g)，而1mg/kg(18.01g±1.674g，P＝0.3397)组的小鼠体重无显著变化。如图2B所示，治疗后，与DSS组相比，10mg/kg和5mg/kg组的结肠损伤更少。这表明在10mg/kg的剂量下，TNF-α纳米抗体V7对DSS小鼠有良好的治疗效果，为TNF-α纳米抗体V7的最佳治疗剂量。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。