唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素-15蛋白的核酸适配体及其应用

技术领域

本发明涉及唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素-15(Sialic acid-bindingimmunoglobulin-like lectin-15，Siglec-15)蛋白的核酸适配体及其应用。

背景技术

癌症是是全球性的公共健康问题，是全人类健康的重大威胁。随着科学的进步及癌症相关学科的发展，肿瘤免疫研究和免疫治疗得到高速发展。其中以PD-1/L1为代表的免疫抑制剂，在肿瘤免疫治疗中最引人瞩目，为广大肿瘤患者带来了新的希望，但这种免疫疗法并不是对所有肿瘤病人都有效，单用情况下PD-1/L1抗体对实体瘤的总体有效率仍在只有20％左右。

唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素-15(Sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin-15，Siglec-15)可通过识别含有唾液酸的糖链结构，介导细胞与细胞或病原体间的相互作用，在固有免疫和适应性免疫中发挥重要的调控作用。研究表明Siglecl-15mRNA在众多癌症中表达上调，包括肺癌、肾癌、肝癌、结肠癌、膀胱癌、子宫内膜癌等，Siglecl-15在肿瘤细胞、与肿瘤相关的间质细胞、肿瘤浸润的巨噬细胞/骨髓细胞也均有检测到，其与T细胞表面受体相互作用会抑制T细胞增殖活性，最终导致肿瘤细胞发生“免疫逃逸”。同时Siglecl-15的表达与PD-L1相互排斥，提示这两种分子可能通过完全不同的机制介导免疫抑制。阻断Siglecl-15可以让肿瘤微环境的免疫正常化，不会引起严重的自身免疫反应，且可能对抗PD-L1治疗无效的患者有效。

目前，包括Siglec-15在内的诸多免疫检查点抗体仍未上市，因为抗体的生产周期慢长，加上抗体存在不稳定、易失活以及成本高的缺点，因此亟需发展其他更稳定，更有效和更低成本免疫治疗药物。核酸适体，是从人工合成的随机寡核苷酸文库中体外筛选得到的能够高亲和性和高特异性地与靶标分子结合的寡核苷酸，大多数的核酸适体都是通过指数富集配体进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)筛选获得。核酸适体作为一种特异的识别分子，由于其对靶标具有较高特异性和亲和力，与抗体相比合成简单、修饰方便、体积小、免疫原性低、价格低廉，引起了基础研究和应用研究的广泛关注，在生物传感器、成像探针、疾病早期检测、药物制剂等方面具有巨大的应用潜力。因此，开发Siglecl-15核酸适体用于肿瘤免疫治疗具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的主要目的，在于提供Siglec-15蛋白的核酸适配体，所述的核酸适配体包括如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：7任一所示的核苷酸序列。

优选地，所述的核酸适配体为SEQ ID NO：3。

本发明的另一目的，在于提供所述的Siglec-15蛋白的核酸适配体，在Siglec-15蛋白识别中的应用。

本发明的另一目的，在于提供所述的Siglec-15蛋白的核酸适配体，在表达Siglec-15蛋白肿瘤细胞、与肿瘤相关的间质细胞、肿瘤浸润的巨噬细胞/骨髓细胞的检测方面的应用。

本发明的另一目的，在于提供所述的Siglec-15蛋白的核酸适配体，在表达Siglec-15蛋白肿瘤细胞、与肿瘤相关的间质细胞、肿瘤浸润的巨噬细胞/骨髓细胞的成像方面的应用。

本发明的另一目的，在于提供所述的Siglec-15蛋白的核酸适配体，在制备相关免疫治疗药物方面的应用。

本发明通过提供以上核苷酸序列，作为核酸适配体，为Siglecl-15高表达的肿瘤检测及Siglecl-15介导的肿瘤免疫治疗提供新方法，补充现有肿瘤诊疗体系。

本发明SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，其与Siglec-15结合能力强。尤其是，SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，对Siglec-15蛋白具有高亲和力，其中，对Siglec-15蛋白琼脂糖微球解离常数为K

SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，对高表达Siglec-15的人脑胶质瘤细胞系(U87)也能保持良好的结合能力与亲和力，解离常数为K

SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，能在复杂环境中识别Siglec-15。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1为His-tag Siglec-15修饰的Ni琼脂糖微球来监测富集的过程。随着筛选轮数的增加库与Siglec-15-Ni-beads结合的荧光强度明显增加(图1A)，然而，Ni-beads荧光强度未增加(图1B)。

图2为随机DNA序列，富集文库和筛选出的7条核酸适体与Siglec-15-Ni琼脂糖微球结合的荧光强度。表明了同浓度的不同核酸适体虽对Siglec-15蛋白的结合能力不同，但均对Siglec-15有结合(图2A)；同时筛选得到的核酸适体对高表达Siglec-15的人脑胶质瘤细胞系(U87)也能保持良好的结合能力(图2B)，其中序列WXY3与U87细胞结合能力较好，且选择性最佳。

图3为WXY3在复杂体系中的与U87细胞结合能力。与缓冲液相比，在DMEM完全培养基条件下，与U87细胞结合的适体数量没有明显减少(图3A)；此外，在100％的人血清培养条件下，与缓冲液相比，约75％的结合适体保持不变(图3B)。

图4为WXY3与Siglec-15-Ni-beads、U87细胞的结合亲和力。WXY3与Siglec-15蛋白的结合解离常数为3.2nM(图4A)，与U87细胞的结合解离常数为34.1nM(图4B)。

图5为WXY3在免疫治疗中的应用。Siglec-15抑制约50％CD8

具体实施方式

实施例1Siglec-15核酸适配体的筛选

化学合成一个85个碱基的DNA初始文库，DNA初始文库的两端为固定序列，其中包括中间为45个碱基的随机序列，即为5’-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-45N-TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3’，库容量为10

2)通过多组氨酸标记表达的重组Siglec-15蛋白(购买自Sino Biological)作为适配体的筛选靶标。Siglec-15蛋白修饰于Ni琼脂糖微球，通过His-tag的表位与Ni相互作用形成Siglec-15-Ni琼脂糖微球。

3)得到的预处理初始文库溶液与Siglec-15-Ni琼脂糖微球一起于25℃下孵育30min；去除上清液回收微球，用结合缓冲液清洗两次，回收的Siglec-15-Ni琼脂糖微球加入到包含正向引物(5’-fam-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-3’)、生物素化的反向引物(5’-biotin-ACCACGACGACACACCCTAA-3’)，dNTPs，Taq DNA聚合酶及PCR缓冲液的PCR混合物中，扩增目标的序列(94℃预变性3min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，扩增10个循环，最后72℃延伸5min)。为获得单链的文库，PCR产物与链霉亲和素包被的琼脂糖微球孵育，然后用0.1MNaOH处理1min变性。使用3K超滤管脱盐纯化后，产物即次一级单链DNA文库，可用于下一轮筛选。

4)从第3轮开始使用Ni琼脂糖微球用作负筛的靶标，以排除与Ni琼脂糖微球结合的序列。重复进行以上筛选步骤，并在筛选过程中逐步降低文库以及蛋白Siglec-15-Ni琼脂糖微球的投入量，并且逐步增加Ni琼脂糖微球的投入量以及洗涤次数以增强筛选强度。

5)本实施例之中，共进行11轮经典的SELEX筛选方法以保证Siglec-15蛋白与DNA链的多个拷贝结合。

实施例2通过流式细胞术考察核酸适配体与Siglec-15的结合能力与亲和力

1)使用His-tag Siglec-15修饰的Ni琼脂糖微球来监测富集的过程。流式的结果表明，随着筛选轮数的增加库与Siglec-15-Ni-beads结合的荧光强度明显增加(图1A)，而Ni-beads荧光强度未增加(图1B)，表明11轮筛选之后，DNA文库成功地富集了Siglec-15蛋白的识别序列。

2)通过富集文库TA克隆测序获得一些序列，即SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：7所示的WXY1、WXY2、WXY3、WXY4、WXY5、WXY6和WXY7(表1)。图2A为初始文库，富集文库和筛选出的7条核酸适体与Siglec-15-Ni琼脂糖微球的结合情况。不同核酸适体虽对Siglec-15蛋白的结合能力不同，但均在200nM的浓度时对Siglec-15有结合。图2B为DNA随机序列和筛选出的7条核酸适体与Siglec-15阳性的人脑胶质瘤细胞系(U87)的结合情况。其中SEQ ID NO：3核酸适体对高表达Siglec-15的人脑胶质瘤细胞系(U87)也能保持良好的结合能力，且选择性最佳。

3)对所选适体SEQ ID NO：3在DMEM完全培养基、100％人血浆中与高表达Siglec-15的人脑胶质瘤细胞系(U87)的结合性能进行了评价，以探讨所选适体的实际应用价值。与缓冲液相比，在DMEM完全培养基条件下，与U87细胞结合的适体数量没有明显变化(图3A)。此外，在100％的血浆培养条件下，与缓冲液相比，约75％的结合适体保持不变(图3B)。这些结果表明，SEQ ID NO：3不仅能在缓冲溶液中与U87细胞高亲和力的结合，而且能在复杂环境中识别Siglec-15，具有很好的应用前景。

4)使用0，3，5，7.5，10，20，35，50，80，100，150，200，300nmol/L浓度梯度的SEQ IDNO：3与Siglec-15蛋白琼脂糖微球、Siglec-15阳性的人脑胶质瘤细胞系(U87)来测定解离常数(K

实施例3核酸适配体在Siglec-15/CD8

1)CFSE染色CD8

2)使用CCK-8检测核酸适体对CD8

表1

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围。

序列表

<110> 厦门大学

<120> 唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素-15蛋白的核酸适配体及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

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<210> 2

<211> 85

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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