蛋白POX01387及其相关生物材料与应用
文献发布时间：2023-06-19 12:05:39
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及蛋白POX01387及其相关生物材料与应用。
背景技术
植物生物质降解酶如纤维素酶、木聚糖酶等，广泛应用在食品、饲料、纺织和生物炼制等方面，在世界酶市场上份额占比最大。植物生物质降解酶主要来源于丝状真菌，但是产量低。研究表明，丝状真菌分泌植物生物质降解酶受到严格地调控，尤其是在转录水平。目前基于转录调控网络，通过基因改造真菌菌株从而提高酶产量是最有效的途径。
草酸青霉(Penicillium oxalicum)能分泌含有高活力β-葡萄糖苷酶的完整纤维素酶系和木聚糖酶系，有希望成为潜在的工业生产菌株。目前，在草酸青霉中，鉴定了多个调控纤维素酶和木聚糖酶产量的转录因子，如转录激活因子ClrB、CxrA和XlnR等，和转录抑制因子如CreA等(Yan YS，et al.Transcriptomic profiling and genetic analysesreveal novel key regulators of cellulase and xylanase gene expression inPenicillium oxalicum[J].Biotechnol Biofuels 2017，10：279；Li ZH etal.Synergistic and dose-controlled regulation of cellulase gene expression inPenicillium oxalicum[J].PLoS Genet.2015，11：e1005509)。基于鉴定的调控因子，构建的草酸青霉基因工程菌明显提高了纤维素酶和木聚糖酶的产量。例如，Yao等缺失cre1和bgl2，过量表达clrB，构建了草酸青霉突变株RE-10，其纤维素酶产量比野生型的提高了20倍(Yao GS，et al.，Redesigning the regulatory pathway to enhance cellulaseproduction in Penicillium oxalicum[J].Biotechnol Biofuels 2015，8：71)。Gao等在草酸青霉中过量表达clrB、xlnR和araR，构建了突变株MCAX，其木质纤维素降解酶提高了3.1-51倍(Gao LW，et al.Combinatorial engineering of transcriptional activatorsin Penicillium oxalicum for improved production of com-fiber-degradingenzymes[J].J Agric Food Chem 2021，69：2539-2548)。但是，草酸青霉纤维素酶和木聚糖酶的产量仍远远不能满足木质纤维素工业规模生物炼制的需求。因此，鉴定调控植物生物质降解酶基因表达的新关键调控因子，尤其是转录抑制因子，为通过合成生物学方法改造真菌菌株从而提高其纤维素酶和木聚糖酶产量具有重要的理论意义和潜在的应用价值。
发明内容
本发明提供了一种蛋白质，所述蛋白质是如下(a1)或(a2)：
(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个或一段氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。
将上述蛋白质命名为蛋白POX01387。
为了使(a1)中蛋白POX01387便于纯化和检测，可在序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
上述(a2)中蛋白POX01387可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(a2)中蛋白POX01387的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个或一段氨基酸残基对应的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其氨基末端和/或羧基末端连上表1所示的标签的编码序列得到。
本发明还提供了与蛋白POX01387相关的生物材料，所述生物材料为下述任一种：
(b1)编码蛋白POX01387的核酸分子；(b2)含有b1所述核酸分子的表达盒；(b3)含有b1所述核酸分子的重组载体、或含有b2所述表达盒的重组载体；(b4)含有b1所述核酸分子的重组微生物、或含有b2所述表达盒的重组微生物、或含有b3所述重组载体的重组微生物；(b5)降低或抑制b1所述核酸分子表达的核酸分子；(b6)含有b5所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。
上述生物材料中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达基因的DNA，该DNA不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
可选地，b1所述核酸分子为如下任一种：
(1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；(2)如序列表的序列3所示的DNA分子；(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA分子序列杂交且编码蛋白POX01387或蛋白POX01387的衍生蛋白的DNA分子；(4)与(1)或(2)或(3)限定的DNA分子序列具有80％以上同源性的DNA分子。
上述严格条件可用0.1％SDS，0.5×SSC的洗膜缓冲液II，在DNA或RNA杂交实验中68℃洗膜。
蛋白POX01387或上述生物材料的应用也属于本发明的保护范围之内，所述应用为如下至少一种：
(fl)在调控微生物生物量中的应用；(f2)在调控微生物纤维素酶产量中的应用；(f3)在调控微生物木聚糖酶产量中的应用；(f4)在调控微生物纤维素酶基因的表达量中的应用；(f5)在调控微生物木聚糖酶基因的表达量中的应用。
所述调控可为提高或降低。
本发明还提供了降低微生物中蛋白POX01387的含量和/或活性或者抑制微生物中编码蛋白POX01387的核酸分子表达的物质的应用，所述应用为如下至少一种：
(e1)在提高微生物生物量中的应用；(e2)在提高微生物纤维素酶产量中的应用；(e3)在提高微生物木聚糖酶产量中的应用；(e4)在提高微生物纤维素酶基因的表达量中的应用；(e5)在提高微生物木聚糖酶基因的表达量中的应用。
抑制微生物中编码蛋白POX01387的核酸分子表达的物质可为干扰编码蛋白POX01387的核酸分子表达的同源重组片段，例如POX01387基因敲除盒，更具体为下述实施例所构建的POX01387基因敲除盒。
本发明还提供了一种制备重组微生物的方法，包括降低出发微生物中蛋白POX01387活性和/或含量，或者抑制出发微生物中编码蛋白POX01387的核酸分子表达，得到重组微生物，
所述重组微生物和所述出发微生物相比，所述重组微生物至少具有如下一种特征：
(c1)微生物生物量提高；(c2)微生物纤维素酶产量提高；(c3)微生物木聚糖酶产量提高；(c4)微生物纤维素酶基因的表达量提高；(c5)微生物木聚糖酶基因的表达量提高。
可选地，所述降低出发微生物中蛋白POX01387的含量和/或活性或者抑制出发微生物中编码蛋白POX01387的核酸分子表达，通过向所述出发微生物导入降低蛋白POX01387的含量和/或活性的物质或者抑制编码蛋白POX01387的核酸分子表达的物质实现。
可选地，所述微生物生物量为菌丝体干重。
可选地，所述纤维素酶选自滤纸酶、羧甲基纤维素酶、外切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶中的至少一种；所述纤维素酶基因选自内切-1，4-β-D-葡聚糖酶基因、纤维二糖水解酶基因和β-葡萄糖苷酶基因中的至少一种；所述木聚糖酶基因为内切-β-1，4-木聚糖酶基因。
所述纤维素酶基因具体可为POX05571、POX06147、POX07535、POX05587、POX04786、POX06835。
所述内切-1，4-β-D-葡聚糖酶基因具体可为POX05571、POX06147、POX07535。
所述纤维二糖水解酶基因具体可为POX05587、POX04786。
所述β-葡萄糖苷酶基因具体可为POX06835。
所述内切-β-1，4-木聚糖酶基因具体可为POX06783。
上述方法中，所述降低蛋白POX01387含量和/或活性的物质可为敲除蛋白POX01387的编码基因的物质和/或调控蛋白POX01387的编码基因表达的物质。
上述方法中，所述调控蛋白POX01387的编码基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
上述方法中，所述调控蛋白POX01387的编码基因表达可为抑制或降低所述基因表达，所述抑制或降低所述基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。
所述基因敲除(gene knockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。
所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变DNA序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。
上述方法中，所述抑制编码蛋白POX01387的核酸分子表达的物质可为抑制或降低所述核酸分子表达的试剂。所述抑制或降低所述核酸分子表达的试剂可为敲除所述核酸分子的试剂，如通过同源重组敲除所述核酸分子的试剂，或通过CRISPR-Cas9敲除所述核酸分子的试剂。所述抑制或降低所述核酸分子表达的试剂可以包含靶向所述核酸分子的多核苷酸，例如siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
采用上述制备重组微生物的方法制备得到的重组微生物也属于本发明的保护范围之内。
上文中，所述微生物可为青霉属微生物或草酸青霉。例如，所述出发微生物可为草酸青霉HP7-1，也可为敲除草酸青霉HP7-1中的PoxKu70基因得到的重组菌(草酸青霉突变株ΔPoxKu70)。
上文中，术语“同源性”指与天然序列的序列相似性。同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。
上文中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
本发明实施例通过同源重组的方法敲除草酸青霉突变株ΔPoxKu70中POX01387基因(将所有敲除POX01387基因的重组菌株均命名为突变株ΔPOX01387)。突变株ΔPOX01387具有如下特点：
(1)在葡萄糖培养条件下，突变株ΔPOX01387能够正常生长且后期生物量增多。
(2)在Avicel诱导培养条件下，相对于出发菌株ΔPoxKu70，突变株ΔPOX01387的滤纸酶产量、羧甲基纤维素酶产量、外切纤维素酶产量、β-葡萄糖苷酶产量和木聚糖酶产量均显著上升。
(3)在Avicel诱导培养条件下，相对于出发菌株ΔPoxKu70，突变株ΔPOX01387中的关键纤维素酶基因和木聚糖酶基因的转录水平显著升高。
本发明提供了草酸青霉的一个功能蛋白POX01387，通过实验证明功能蛋白POX01387在调控纤维素酶和木聚糖酶基因的表达过程中起关键性作用，在提高纤维素酶产量和木聚糖酶产量中具有应用潜力。
附图说明
图1为实施例2草酸青霉POX01387基因缺失突变株ΔPOX01387的构建示意图，其中，箭头为相应引物的扩增方向。
图2为草酸青霉突变株ΔPOX01387的PCR验证电泳图。
图3为草酸青霉突变株ΔPOX01387的Southern杂交验证图。
图4为实施例3草酸青霉互补菌株CPOX01387的构建示意图，其中，箭头为相应引物的扩增方向。
图5为草酸青霉互补株CPOX01387的PCR验证电泳图。
图6为草酸青霉出发菌株ΔPoxKu70和突变株ΔPOX01387在葡萄糖培养条件下的生物量检测结果。
图7为草酸青霉出发菌株ΔPoxKu70、突变株ΔPOX01387和互补株CPOX01387在Avicel诱导培养条件下的滤纸酶产量检测结果。
图8为草酸青霉出发菌株ΔPoxKu70、突变株ΔPOX01387和互补株CPOX01387在Avicel诱导培养条件下的羧甲基纤维素酶产量检测结果。
图9为草酸青霉出发菌株ΔPoxKu70、突变株ΔPOX01387和互补株CPOX01387在Avicel诱导培养条件下的外切纤维素酶产量检测结果。
图10为草酸青霉出发菌株ΔPoxKu70、突变株ΔPOX01387和互补株CPOX01387在Avice1诱导培养条件下的β-葡萄糖苷酶产量检测结果。
图11为草酸青霉出发菌株ΔPoxKu70、突变株ΔPOX01387和互补株CPOX01387在Avicel诱导培养条件下的木聚糖酶产量检测结果。
图12为草酸青霉突变株ΔPOX01387相对出发菌株ΔPoxKu70在Avicel诱导条件下纤维素酶和木聚糖酶基因的RT-qPCR检测结果。
其中，“*”表示P≤0.05，“**”表示P≤0.01。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
采用Excel软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用Student’s t test检验。
草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株HP7-1：参考文献：Zhang Z eta1.Predominance of Trichoderma and Penicillium in cellulolytic aerobicfilamentous fungi from subtropical and tropical forests in China.and theiruse in finding highly efficient β-glucosidase[J].Biotechnol Biofuels 7，107(2014)；公众可以从广西大学获得。在此菌株基础上获得的所有突变菌株均可以从广西大学获得。
下述实施例使用的突变菌种ΔPoxKu70于2016年4月21日收藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为CGMCC No.3.15650。
下述实施例使用的突变菌株ΔPOX01167于2016年9月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为CGMCCNo.12965，公布于中国发明专利《功能蛋白POX01167及其编码基因与应用》，授权公告号为CN 106749570B。
质粒pCPXG418：参考文献：ZhaoSet a1.Comparative genomic，transcriptomicand secretomic profiling of Penicillium oxalicum HP7-1 and its cellulase andxylanase hyper-producing mutant EU2106.and identification of two novelregulatory genes of cellulase and xylanase gene expression[J].BiotechnolBiofuels 2016，9：203)；公众可以从广西大学获得。实施例中质粒pCPXG418用于POX01387基因敲除盒构建中G418基因扩增的模板。
质粒pZTBle：参考文献：Yan YS et al.Transcriptomic profiling and geneticanalyses reveal novel key regulators of cellulase and xylanase geneexpression in Penicillium oxalicum[J].Biotechnol Biofuels 2017，10：279；公众可以从广西大学获得。实施例中质粒pZTBle用于POX01387基因回补盒构建中博来霉素基因扩增的模板。
实施例中所用CM培养基：葡萄糖10.0g/L，蛋白胨2.0g/L，酵母提取物1.0g/L，酸水解酪蛋白1.0g/L，FeSO
实施例中所用产酶培养基母液：(NH
实施例中所用Avicel培养基：在上述产酶培养基母液中添加终浓度为20g/LAvicel，121℃灭菌20min。
实施例中所用葡萄糖培养基：在上述产酶培养基母液中添加终浓度为10g/L葡萄糖，115℃灭菌20min。
DNA纯化试剂盒：购自天根生化科技有限公司，货号：DP214。
PDA培养基：称取7.8g PDA至200mL去离子水中，混匀，121℃灭菌20min。
0.2％吐温80溶液：称取2g吐温80加入适量去离子水，混匀后定容至1L，121℃灭菌20min。
0.6M MgSO
酶解液：分别称取0.3g裂解酶、0.2g溶菌酶和0.3g蜗牛酶，加至50mL OM buffer溶液中，28℃，180rpm混匀30min后离心取上清，经0.22μm滤膜过滤除菌。
OM buffer溶液：分别称取295.2g MgSO
Trappingbuffer溶液：分别称取72.9g山梨醇(0.4M)和12.1g Tris(0.1M)加入适量去离子水，混匀，用HCl调节pH至7.0后定容至1L，121℃灭菌20min。
1M山梨醇溶液：称取182.2g山梨醇加入适量去离子水，混匀，定容至1L，121℃灭菌20min。
STC溶液：分别称取182.2g山梨醇(1M)、12.1g Tris(0.1M)和11.1g CaCl
PTC溶液：分别称取400g PEG 3350、12.1g Tris(0.1M)和11.1g CaCl
100mM亚精胺溶液：称取0.15g亚精胺加至10mL去离子水中，混匀，经0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃保存备用。
OCM培养基：分别称取0.05g酸水解酪蛋白、0.05g酵母提取物、17.1g蔗糖和1.5g琼脂粉加至50mL去离子水中，121℃灭菌20min。
200mg/mL G418溶液：分别称取4g G418和0.5g HEPES加至20mL去离子水中，混匀，经0.22μm滤膜过滤除菌后-20℃保存备用。
蛋白提取液：称取0.4g EDTA(1mM)加入适量PBS缓冲液，混匀后定容至1L，121℃灭菌20min后4℃保存备用。
PBS缓冲液：分别称取8.5g NaCl、2.2g Na
Southern杂交实验方法参考罗氏(Roche)公司的DIG High Prime DNA Labelingand Detection Starter Kit II试剂盒说明书。需要另外配制的试剂如下：
脱嘌呤溶液：量取11～15mL浓盐酸(0.125M)加入适量去离子水，混匀后定容至1L，室温保存备用。
变性液：分别称取20g NaOH(0.5M)和87.7g NaCl(1.5M)加入适量去离子水，混匀后定容至1L，室温保存备用。
中和液：分别称取60.5g Tris(0.5M)和87.7gNaCl(1.5M)加入适量去离子水，混匀，用HCl调节pH至7.5后定容至1L，室温保存备用。
20×SSC：分别称取175.3gNaCl(3M)和88.2g二水合柠檬酸三钠(0.3M)加入适量去离子水，混匀，用HCl调节pH至7～8之间后定容至1L，室温保存备用。
20％SDS：称取20gSDS加入适量去离子水，混匀后定容至100mL。
洗膜缓冲液I：量取25mL 20×SSC(2×SSC)，1.25mL 20％SDS(0.1％SDS)，定容至250mL，现配现用，常温放置。
洗膜缓冲液II：量取6.25mL 20×SSC(0.5×SSC)，1.25mL 20％SDS(0.1％SDS)，定容至250mL，现配现用，需预热至68℃后使用。
Washing buffer溶液：量取3mL吐温20至适量马来酸缓冲液中，混匀，定容至1L。
马来酸缓冲液：分别称量8.8g NaCl(0.15M)和11.6g马来酸(0.1M)加入适量去离子水，混匀，用10M NaOH调节pH至7.5后定容至1L，室温保存备用。
Blocking buffer溶液：量取10mL DIG High Prime DNA Labeling andDetection Starter Kit II试剂盒中的6号试剂加至90mL马来酸缓冲液中，混匀，现配现用。
Antibody solution溶液：量取1.5μL DIG High Prime DNA Labeling andDetection Starter Kit II试剂盒中的4号试剂加至20mL blocking buffer溶液中，混匀，现配现用。
Detection buffer溶液：分别称取5.85gNaCl(0.1M)和12.114gTris(0.1M)加入适量去离子水，混匀，用HCl调节pH至9.5后定容至1L。
实施例1、草酸青霉功能蛋白POX01387及其编码基因的发现
通过比较分析草酸青霉出发菌株ΔPoxKu70和突变菌株ΔPOX01167在Avicel诱导条件下的转录组，发现了一个表达水平差异较大的新基因POX01387，将该基因编码的蛋白命名为POX01387。
新基因POX01387的cDNA序列如序列表的序列2所示，含2775个碱基；
新基因POX01387的基因组DNA如序列表的序列3所示，含2998个碱基，其中包括3个内含子，自氨基端算分别位于第32-93、921-1013、1896-1963处；
新基因POX01387编码蛋白POX01387，该蛋白的氨基酸序列如序列表的序列1所示，由924个氨基酸残基组成。
实施例2、草酸青霉POX01387基因缺失突变株ΔPOX01387的构建与验证
如图1所示，本实施例通过同源重组的方法用POX01387基因敲除盒敲除草酸青霉突变株ΔPoxKu70中POX01387基因。
总共分为三步：
(一)草酸青霉POX01387基因敲除盒的构建
POX01387基因敲除盒的元件示意图见图1。
1、提取草酸青霉HP7-1的基因组DNA。
2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，按图1所示将POX01387基因5’上游DNA片段(2549bp)和3’下游DNA片段(2775bp)分别扩增出来；以质粒pCPXG418为模板，将G418基因DNA片段(1890bp)扩增下来，经DNA纯化试剂盒纯化回收后，按照摩尔比1∶1∶2混合进行普通PCR扩增，得到PCR融合产物。
3、以步骤2得到的PCR产物为模板，用POX01387基因5’上游引物POX01387-N-F(2151bp)和3’下游引物POX01387-N-R(2288bp)对其进行普通PCR扩增，得到预计6329bp的PCR产物，经DNA纯化试剂盒纯化回收。
4、将步骤3纯化回收后的DNA测序，该DNA分子的核苷酸序列同序列表的序列4，即将序列表的序列4所示的DNA分子命名为POX01387基因敲除盒。序列4中，自5’端第1-2151位核苷酸为POX01387基因5’上游DNA区段(POX013875’flank)，第2152-4041位核苷酸为G418抗性基因DNA区段(G418)，第4042-6329位核苷酸为POX01387基因3’下游DNA区段(POX013873’flank)。
实际应用中，也可以人工合成序列4所示DNA分子。
(二)草酸青霉缺失突变株ΔPOX01387的构建
1、出发菌株草酸青霉突变株ΔPoxKu70的构建
记载敲除PoxKu70基因具体步骤的文献如下：Zhao S et al.Comparativegenomic，transcriptomic and secretomic profiling of Penicillium oxalicum HP7-1and its cellulase and xylanase hyper-producing mutant EU2106，andidentificatian of two novel regulatory genes of cellulase and xylanase geneexpression[J].Biotechnol Biofuels 2016，9：203
将敲除PoxKu70基因的草酸青霉突变株命名为草酸青霉突变株ΔPoxKu70。
草酸青霉突变株ΔPoxKu70为构建缺失突变株ΔPOX01387的出发菌株。
2、草酸青霉突变株ΔPoxKu70原生质体的制备
(1)将步骤1得到的草酸青霉突变株ΔPoxKu70接种在PDA培养基平板上，28℃静置培养5天，用灭菌的0.2％吐温80溶液将平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液，将其终浓度调至1×10
(2)取2mL步骤(1)的孢子悬浮液，接种至200mL CM培养基中，28℃、180rpm培养9-12h，待从孢子萌发的菌丝体长度为孢子直径3-4倍即可。
(3)完成步骤(2)后，3500rpm离心20min，弃上清，收集菌丝体沉淀，用0.6MMgSO
(4)取步骤(3)得到的菌丝体，用酶解液重悬，28℃、180rpm条件下酶解菌丝体2-3h；显微镜镜检观察到视野大部分为球状原生质体时，按每管12.5mL分装到无菌50mL离心管中，加入2倍体积的Trapping buffer溶液，4℃、3500rpm离心30min，溶液分为三层，其中原生质体至于中间层。
(5)用巴氏吸管小心地吸出步骤(4)中间层的原生质体至新的无菌50mL离心管中，加入2倍体积1M山梨醇溶液漂洗2次，每次4℃、3500rpm离心15min，弃上清，再用20mL STC溶液漂洗2次，每次为4℃、3500rpm离心15min，弃上清，最后按4∶1比例加入STC和PTC溶液重悬原生质体，混匀，得到ΔPoxKu70原生质体溶液，ΔPoxKu70原生质体溶液浓度为1×10
3、草酸青霉POX01387基因敲除盒转化ΔPoxKu70原生质体
用实施例2(一)得到的POX01387基因敲除盒转化ΔPoxKu70的原生质体(方法参照文献：Churchill ACL et al.Transformation of the fungal pathogen Cryphonectriaparasitica with a variety of heterologous plasmids[J].Current Genetics 1990，17：25-31)，具体步骤如下：
(1)将15μg POX01387基因敲除盒和5μL 100mM亚精胺溶液混合，加入100μL上述制备的ΔPoxKu70原生质体溶液，轻弹管壁混匀，冰上反应30min；
(2)沿管壁向溶液中缓慢加入1mLPTC溶液，勿晃动，室温静置25min，让其自然混匀；
(3)向(2)中加入2mL STC溶液，缓慢吸打混匀，将其全部转入到20mL 50℃预热的OCM培养基中，混合均匀后迅速倒入到无菌培养皿中；室温孵育60min，加入35mL含有G418抗生素(终浓度500μg/mL)与潮霉素抗生素(终浓度250μg/mL)的PDA培养基，覆盖在OCM培养基的上面，完全凝固后28℃倒置培养5天，得到转化双层板。
(三)草酸青霉POX01387基因缺失突变株ΔPPOX01387的验证
1、将上述(二)的3得到的转化双层板的孢子用灭菌的0.2％吐温80洗脱，梯度稀释后涂布在含有G418抗生素(终浓度500μg/mL)的PDA培养基平板上，28℃培养5天，随机挑选若干个单个菌落进行基因组DNA的提取和PCR验证，具体如下：
如图1和2所示：分别用引物对POX01387-F/POX01387-R(2791bp、图2-A)、POX01387-L-F/G418-V-R(2796bp、图2-B)和G418-V-F/POX01387-R-R(3000bp、图2-C)对三个候选突变株ΔPOX01387-8、ΔPOX01387-14、ΔPOX01387-20和出发菌株ΔPoxKu70的基因组DNA进行PCR验证，其中ΔPOX01387-8、ΔPOX01387-14和ΔPOX01387-20突变株的POX01387基因扩增不出来，POX01387基因的5’上游DNA片段和G418基因的5’端部分DNA片段以及G418基因的3’端部分DNA片段和POX01387基因的3’下游DNA片段能够扩增出来，出发菌株ΔPoxKu70与之相反，阴性对照(不加DNA模板)扩增不出任何条带。图2中，泳道M：1kb DNAmarker，泳道1：ΔPOX01387-8，泳道2：ΔPOX01387-14，泳道3：ΔPOX01387-20，泳道4：ΔPoxKu70，泳道5：ddH
所使用的引物序列具体如下：
POX01387-F：GCTATCATGCTGGGCCTTTT
POX01387-R：TCCGAGATCGGTCATTTGC
POX01387-L-F：TGCCGCTGCGTGTTTACT
G418-V-R：GCCCTGGGTTCGCAAAGATA
G418-V-F：AATAATGTCCTCGTTCCTGTCTGC
POX01387-R-R：TGACGGAGGTGAATCCAATAAG。
2、提取三个候选突变株(ΔPOX01387-8、ΔPOX01387-14和ΔPOX01387-20)和出发菌株ΔPoxKu70的基因组DNA，将基因组DNA采用BglII酶切后进行Southern杂交分析，所用探针为以出发菌株ΔPoxKu70的基因组DNA为模板进行普通PCR扩增后纯化回收的POX01387基因的3’下游DNA片段(1309bp)，其位置为图1中Probe所示。结果如图3所示：ΔPOX01387-8、ΔPOX01387-14和ΔPOX01387-20均得到与预计大小相符(5198bp)的杂交带，出发菌株ΔPoxKu70也得到与预计大小相符(3085bp)的杂交带。图3中，泳道M：1kbDNAmarker，泳道1：ΔPoxKu70，泳道2：ΔPOX01387-8，泳道3：ΔPOX01387-14，泳道4：ΔPOX01387-20。
以上结果表明，将POX01387基因敲除盒导入草酸青霉突变株ΔPoxKu70得到的三个转化子(ΔPOX01387-8、ΔPOX01387-14和ΔPOX01387-20)均为POX01387基因被敲除的突变菌株。将敲除POX01387基因的突变株ΔPOX01387-20命名为突变株ΔPOX01387并对其做进一步实验和检测。突变株ΔPOX01387是将草酸青霉突变株ΔPoxKu70中的POX01387基因替换为G418抗性基因所获得的菌株。
实施例3、草酸青霉互补菌株CPOX01387的构建与验证
如图4所示，本实施例采用POX01387基因互补盒(即图4中的POX01387互补表达盒)通过同源重组的方法敲除草酸青霉突变株ΔPOX01387中的蛋白酶编码基因POX05007，同时将POX01387基因完整表达框导入至POX05007基因位点，从而获得互补菌株CPOX01387。POX05007基因的缺失对草酸青霉的生长、纤维素酶和木聚糖酶产量无影响，参考文献：WangL et a1.Secretory overproduction of a raw starch-degrading glucoamylase inPenicillium oxalicum using strong promoter and signal peptide.Appl MicrobiolBiotechnol.2018，102(21)：9291-9301。
(一)草酸青霉POX01387基因互补盒的构建
POX01387基因互补盒的元件示意图见图4。
1、提取草酸青霉突变株ΔPoxKu70的基因组DNA。
2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，按图4所示将蛋白酶编码基因POX05007基因5’上游DNA片段(2457bp)和3’下游DNA片段(2500bp)、以及POX01387基因完整表达框(POX01387基因5’上游DNA(1338bp)、POX01387基因(2998bp)、POX05554基因3’下游DNA片段(713bp)分别扩增出来；以质粒pZTBle为模板，将博来霉素基因DNA片段(1733bp)扩增下来，经DNA纯化试剂盒纯化回收后，按照摩尔比1∶1∶2∶2混合进行普通PCR扩增，得到PCR融合产物。
3、以步骤2得到的PCR产物为模板，用POX05007基因5’上游引物POX05007-N-F(2376bp)和3’下游引物POX05007-N-R(2402bp)对其进行普通PCR扩增，得到预计11560bp的PCR产物，经DNA纯化试剂盒纯化回收。
4、将步骤3纯化回收后的DNA测序，若测序所得核苷酸序列同序列表的序列5一致，即将序列表的序列5所示的DNA分子命名为POX01387基因互补盒。序列5中，自5’端第1-2376位核苷酸为POX05007基因5’上游DNA区段(POX05007上游同源序列)，第2377-4109位核苷酸为博来霉素抗性基因DNA区段(Ble)，第4110-8445位核苷酸为POX01387基因5’上游DNA片段(POX01387上游同源序列)和POX01387基因(POX01387)，第8446-9158位核苷酸为POX05554基因3’下游DNA区段(POX05554下游同源序列)，第9159-11560位核苷酸为POX05007基因3’下游DNA区段(POX05007下游同源序列)。
实际应用中，也可以人工合成序列5所示DNA分子。
(二)草酸青霉互补株CPOX01387的构建
1、以草酸青霉ΔPOX01387为出发菌株，按实施例2的方法制备ΔPOX01387的原生质体。
2、草酸青霉POX01387基因互补盒转化ΔPOX01387的原生质体：具体步骤参考实施例2的3，不同的是将POX01387基因敲除盒替换为草酸青霉POX01387基因互补盒，ΔPoxKu70原生质体替换为ΔPOX01387的原生质体。
(三)草酸青霉POX01387基因互补株CPOX01387的验证
1、将步骤(二)的转化双层板的孢子用灭菌的0.2％吐温80溶液洗脱，梯度稀释后涂布在含有博来霉素抗生素(终浓度100μg/mL)的PDA培养基平板上，28℃培养4-5天，随机挑选若干个单个菌落进行基因组DNA的提取和PCR验证，如图4和5所示：分别用引物对POX05007-F/POX05007-R(1326bp、图5-A)、POX05007-L-F/Ble-V-R(2814bp、图5-B)和Ble-V-F/POX05007-R-R(7824bp、图5-C)对三个候选互补株CPOX01387-2、CPOX01387-3、CPOX01387-4和突变株ΔPoxKu70以及出发菌株ΔPOX01387的基因组DNA进行PCR验证，其中CPOX01387-2、CPOX01387-3和CPOX01387-4互补株的POX05007基因扩增不出来，POX05007的5’上游DNA片段和博来霉素基因的5’端部分DNA片段以及博来霉素基因的3’端部分DNA片段和POX01387基因完整表达框(POX01387基因5’上游DNA片段、POX01387基因、POX05554基因3’下游DNA片段)以及POX05007的3’下游DNA片段能够扩增出来，突变株ΔPoxKu70和出发菌株ΔPOX01387与之相反。图5中，泳道M：1kb DNA marker，泳道1：ΔPoxKu70，泳道2：ΔPOX01387，泳道3：CPOX01387-2，泳道4：CPOX01387-3，泳道5：CPOX01387-4。
上述所使用的的引物具体序列如下：
POX05007-F：ATGGTTGTCTTCAGCAAGGTTA
POX05007-R：CTATGCCTGAGCAGCGAAAC
POX05007-L-F：TGAGGGCAGGTGAAGTAG
Ble-V-R：ACTGAGGAATCCGCTCTTGG
Ble-V-F：TGATAATAATGTCCTCGTTCCTGTC
POX05007-R-R：CAAGACAAAGAATATAACGGGGA。
这些结果表明菌株CPOX01387-2、CPOX01387-3和CPOX01387-4中POX05007基因已被敲除，且POX01387基因完整表达框回补至POX05007基因位点，它们均为草酸青霉缺失突变株ΔPOX01387的互补菌株。将互补菌株CPOX01387-4命名为互补株CPOX01387并对其做进一步实验和检测。
实施例4、草酸青霉突变株ΔPOX01387在葡萄糖培养基中生物量的测定
待测菌株为：草酸青霉出发菌株ΔPoxKu70和突变株ΔPOX01387。
1、将待测菌株分别接种在PDA培养基平板上，28℃静置培养5天，用灭菌的0.2％吐温80溶液将平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液，将其终浓度调至1×10
2、每瓶100mL葡萄糖培养基中接种1mL步骤1得到的孢子悬浮液，在28℃、180rpm条件下培养84h。每隔12h收集100mL培养基中的所有菌丝体，50℃烘干至恒重，称量菌丝体干重。每个时间点的不同菌株各接三瓶做组内生物学重复。此实验重复三次。
结果如图6所示：在培养前期(≤48h)，突变株APOX01387在葡萄糖培养基中生物量与ΔPoxKu70的无显著差异，但在培养后期(＞48h)，突变株ΔPOX01387生物量与ΔPoxKu70比较显著增加10.4-24.4％。例如，突变株APOX01387和出发菌株ΔPoxKu70培养72小时时，生物量分别为5.2g/L和4.2g/L。
实施例5、草酸青霉突变株ΔPOX01387纤维素酶产量的测定
待测菌株为：草酸青霉出发菌株ΔPoxKu70、突变株ΔPOX01387和互补株CPOX01387。
1、将待测菌株分别接种在PDA培养基平板上，28℃静置培养5天，用灭菌的0.2％吐温80溶液将平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液，将其终浓度调至1×10
2、将1mL步骤1得到的孢子悬浮液接种至100mL葡萄糖培养基中，28℃、180rpm培养24h，无菌环境下收集菌丝体。
3、将步骤2得到的菌丝体用无菌水洗涤2-3次，抽干水分。称取湿重约1g的菌丝体接入100mL 2％Avicel培养基中，28℃、180rpm培养96h。
4、收集培养第48h和96h的含菌丝体的培养物，8000rpm离心10min，上清液即为粗酶液，沉淀为菌丝体，粗酶液用于纤维素酶和木聚糖酶产量的检测，菌丝体用于总胞内蛋白的测定。
5、检测步骤4得到粗酶液的纤维素酶和木聚糖酶产量，检测方法参考文献：GhoseTK.Measurement of cellulase activities[J].Pure and Applied Chemistry 1959，(59)：257-268；Gokhale et al.Production of cellulolytic enzymes by mutants ofAspergillus niger NCIM 1207[J].Enzyme and Microbial Technology 1988，10：442-445。其中纤维素酶包括滤纸酶(FPase)、羧甲基纤维素酶(CMCase)、外切纤维素酶(pNPCase)、β-葡萄糖苷酶(pNPGase)。
6、测定步骤4得到菌丝体的总胞内蛋白。方法参照以下步骤：
(1)将步骤4得到菌丝体置入预冷的研钵中，加入适量液氮迅速研磨成粉末。
(2)将其转至50mL离心管中，混匀。离心管内提前加入15mL预冷的蛋白提取液(现加入终浓度为0.5mM的蛋白酶抑制剂)和6g直径为3mm的玻璃珠。
(3)迅速在涡旋振荡仪上振荡1min，再放置冰上1min，重复3次。4℃，4000rpm，离心10min，收集上清液，即可检测菌体胞内蛋白浓度。总胞内蛋白检测方法参照文献：Zor T，etal.Linearization of the Bradford protein assay increase its sensitivity：theoretical and experimental studies[J].Analytical Biochemistry 1996，(236)：302-308。
草酸青霉待测菌株的纤维素酶或木聚糖酶产量(U/g胞内蛋白)＝步骤5检测的纤维素酶或木聚糖酶产量(U)/步骤6检测的总胞内蛋白(g)。
结果如图7-11所示：与出发菌株ΔPoxKu70相比，突变株ΔPOX01387的滤纸酶产量(图7)、羧甲基纤维素酶产量(图8)、外切纤维素酶产量(图9)、β-葡萄糖苷酶产量(图10)和木聚糖酶产量(图11)均显著升高，第二天依次提升32.4％、17.9％、194％、766.9％和24.1％；第四天依次提升226.1％、148.9％、218.7％、2387.3％和51.9％，而互补株CPOX01387的上述5种酶产量均回复到出发菌株水平。
实施例6、POX01387基因的缺失对草酸青霉纤维素酶和木聚糖酶基因转录水平的影响
待测菌株为：草酸青霉出发菌株ΔPoxKu70和突变株ΔPOX01387。
1、将待测菌株分别接种在PDA培养基平板上，28℃静置培养5天，用灭菌的0.2％吐温80溶液将平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液，将其终浓度调至1×10
2、将1mL步骤1得到的孢子悬浮液接种至100mL葡萄糖培养基中，28℃、180rpm培养24h，无菌环境下收集菌丝体。
3、将步骤2得到的菌丝体用无菌水洗涤2-3次，抽干水分，称取湿重约1g菌丝体接入100mL 2％Avicel培养基中，28℃、180rpm培养48h。
分别离心收集诱导培养第4h、第12h、第24h和第48h的菌丝体置入预冷的研钵中，加入适量液氮迅速研磨成粉末，提取总RNA并反转录为eDNA，以eDNA为模板，进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)试验。
其中检测了3个内切-1，4-β-D-葡聚糖酶基因POX05571、POX06147和POX07535，2个纤维二糖水解酶基因POX05587和POX04786，1个β-葡萄糖苷酶基因POX06835和1个内切-β-1，4-木聚糖酶基因POX06783。
所用RT-qPCR引物序列如下：
结果如图12所示：在整个培养过程中，突变株ΔPOX01387中所检测的纤维素酶基因和木聚糖酶基因的mRNA/转录水平均显著升高，表明在Avicel诱导条件下，调控基因POX01387对草酸青霉关键纤维素酶基因和木聚糖酶基因的表达起负调控作用。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 广西大学
<120> 蛋白POX01387及其相关生物材料与应用
<130> 211584
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 924
<212> PRT
<213> 草酸青霉(Penicillium oxalicum)
<400> 1
Met Ser Gly Tyr His Ala Gly Pro Phe Gly His Ser Gly Asp Asn Pro
1 5 10 15
Tyr Gln Leu Pro Pro Pro Arg Thr Pro Ala Asn Leu Gln Tyr Gly Pro
20 25 30
Asp Ser Phe Leu Arg Gln Arg Asp Ser Glu Arg Ser Asp Leu Val Arg
35 40 45
Glu Ala Val Pro Ala Asp Ala Ala Ser Val Arg Gln Pro Asn Glu Pro
50 55 60
Leu Pro Ser Val Arg Ser Leu Leu Thr Pro Thr Thr Gly Pro Gly Ser
65 70 75 80
Pro Pro Ala Phe Arg Gln Pro Arg Tyr Gly Ile Gln Thr Pro Ala Glu
85 90 95
Ser His Arg Asp Met Gly Tyr Pro Phe Arg Pro Gln Glu Thr Val Phe
100 105 110
Pro Pro Leu Gln Met Gly Thr Leu Asp Arg Arg Arg Ser Glu Ser Leu
115 120 125
Pro His Ser Gln Pro Thr Ser Leu Pro Pro Leu Ser His Val Ala Met
130 135 140
Gly Gly Ser Ala Glu Val Asp His His His His Thr Thr Arg Ser Asp
145 150 155 160
Pro Ser Thr Ala Lys Ser Ser His Ala His Leu Ser Pro Arg Asn Asn
165 170 175
Ser His Ser Glu Leu Met Pro Ser Ala Glu Ile Ser Ser Pro Glu Ser
180 185 190
Val Thr Arg Ala Asn Ala Pro Ala Val Leu Pro His Val Val Asp Glu
195 200 205
Arg Tyr Ile Asp Gly Glu Leu Cys Phe Val Tyr Ala Asp Gly Ser His
210 215 220
Gln Pro Lys Ile Val Asp Gly Lys Pro Val Asn Pro Asn Trp Gly Val
225 230 235 240
Thr Lys Ala Gly Lys Pro Arg Lys Arg Leu Ala Gln Ala Cys Leu Thr
245 250 255
Cys Arg Glu Lys Lys Ile Lys Cys Gln Pro Asn Arg Pro Lys Cys Asp
260 265 270
Gln Cys Gln Lys Ser Gly Arg Glu Cys Arg Phe Glu Asn Ala Leu Arg
275 280 285
Gly Asn Arg Pro Arg Gly Ser His Ser Val Gly Pro Ser Gly Asn Ala
290 295 300
Thr Ser Glu Ile Ile Gly Ala Val Tyr Asp Ile Thr Arg Ala Ser Asp
305 310 315 320
Ser Gly Ala Ser Leu Pro Gly Ser Gly His Ser Pro Ile Ser Glu Ser
325 330 335
Val Gly Leu Thr Pro Ser Gly Ile Glu Ile Thr His Asp Pro Met Leu
340 345 350
Asp Ala Glu Arg Ala Tyr Arg Gln Arg Ala Tyr Arg Ile Pro Arg Pro
355 360 365
Phe Glu Glu Asp Ser His Ile Arg His Thr Thr Tyr Pro Glu Thr Asn
370 375 380
Arg Leu Pro Glu Tyr Gln Glu Ile Leu Gly Glu Met Arg Asp Thr Gly
385 390 395 400
Pro Asp Asp Pro Leu Leu Ala Ser Trp Asn Val Asp Pro Phe Asp His
405 410 415
Asp Pro Glu Met Thr Leu His Tyr Val Asp Thr Phe Phe Thr Tyr Val
420 425 430
Asn Asp Gly Leu Tyr His Ile Phe Pro His Ala Arg Phe Ile Leu Trp
435 440 445
Leu Lys Ser Cys Asn Thr Lys Ser Gln Glu Asp Lys Met Val Leu Tyr
450 455 460
Ser Met Met Ala Leu Gly Ser Ile Phe Ser Asp Arg Pro Asp Lys Val
465 470 475 480
Ser Ala Leu Arg Arg Tyr Ser Arg Ile Ala Arg Phe Ala Ile Gln Arg
485 490 495
Ser Gln His Asn Leu Cys Leu Gln Leu Val Gln Ser His Leu Leu Met
500 505 510
Gly Leu Leu Tyr Tyr Ala Ala Gly Ser Leu Val Ala Ala Trp Asp Ala
515 520 525
Val Gly Ser Ala Gly Arg Ala Val Ser Gly Leu Arg Phe Asn Ile Glu
530 535 540
Ser Gly Gly Val Ile Val Gly Gln Asn Gln Pro Cys Glu Tyr Gly Leu
545 550 555 560
His Pro Gln Ala Leu Ile Glu Cys Arg Arg Arg Thr Phe Trp Val Ala
565 570 575
Phe Ile Leu Asp Arg Ile Ser Ser Leu Phe Ser Val Pro Ser Thr Thr
580 585 590
Ile Pro Ser Glu Ser Ala Leu Ile Arg Leu Pro Cys Arg Glu Asp Ile
595 600 605
Tyr Glu Ala Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Pro Tyr Phe Gln Asn Ile Leu
610 615 620
Asn Gln Ala Ser Arg Phe Ser Glu Asp Asp Arg His Ser Leu Ser Pro
625 630 635 640
Met Ala Phe Val Ile Gln Ile Leu Ser Ile Trp Gly Asp Val Ser Phe
645 650 655
Gln Thr Leu Arg Leu Ser His Ala Pro Thr Glu Cys Trp Leu Gln Leu
660 665 670
Ala Glu Asp Phe His Thr Glu Ile Ile Gln Arg Thr Asp Asp Trp Ile
675 680 685
Asn Gln Leu Pro Glu His Leu Thr Phe Ser Val Ala Asn Met Glu Arg
690 695 700
Ala Ser Gln Ala Lys Lys Val Asp Ala Phe Val Gly Ile His Met Phe
705 710 715 720
Tyr His Ala Thr Leu Met Lys Leu Tyr Arg His Ala Arg Tyr Gln Ser
725 730 735
Leu Arg Pro Glu Val Leu Ala Arg His Ile His Arg Ala Arg Tyr His
740 745 750
Ala Val Glu Ile Leu Arg Ile Ala Leu Ala Val Val Gln Tyr Ala His
755 760 765
Asp Val Gln Ala Ser Arg Ser Thr Ser Asp Ser Ser Ser Ala His Gly
770 775 780
Thr Leu Leu Gly Pro Phe Leu Ala His Val Val Val Ser Ala Val Asp
785 790 795 800
Val Leu Ser Ala Gly Gly Met Val Thr Glu Leu Pro Asp Cys Ile Ser
805 810 815
Phe Thr Asn Gly Ala Tyr Gly Met Val Gln Leu Leu Gly His His Trp
820 825 830
Glu Ser Ser Ile Cys Leu Ala Asn Leu Ile Lys Lys Arg Leu Asp Ala
835 840 845
Met Ile Asp Cys Ala Asn Asp Arg Ser Arg Asn Gln Glu Lys Ile Cys
850 855 860
Phe Ala Val Asp Gly Pro Ser Leu Glu Thr Arg Ile Pro Thr Gly Thr
865 870 875 880
Pro Ser Pro Pro Gln Gly Thr Leu Asp Glu Asp Leu Phe Tyr Gly Ala
885 890 895
Leu Pro Arg Asp Val Leu Leu Lys Ala Met Arg Gly Asp Asp Thr Leu
900 905 910
Ser Ala Asp Lys Asn Ile Ala Trp Phe Asn Asp Gln
915 920
<210> 2
<211> 2775
<212> DNA
<213> 草酸青霉(Penicillium oxalicum)
<400> 2
atgtcgggct atcatgctgg gccttttggt cactcgggag ataatccata ccagcttcct 60
ccgccacgga caccggcaaa cttgcaatat ggacccgatt cattcctccg acaacgggac 120
tcggagagat cagacctggt tcgagaggct gtaccagcag atgctgcctc tgtccgccag 180
cccaacgaac cattgccgtc cgtccgatcg ctgttgacac caaccacggg cccgggatca 240
ccaccggcat ttcgtcaacc acgatatggc atccaaacgc cagctgaatc gcaccgggac 300
atgggctatc cgtttcgccc gcaggagacc gtgtttcctc cgctacagat gggcacgctg 360
gaccggcgtc gctccgagtc tctaccgcac tctcaaccca ccagccttcc acctctatcg 420
cacgtagcca tgggagggtc ggcggaggtc gaccaccatc atcacaccac acgcagtgat 480
ccgtccaccg caaagtcatc gcacgctcat ctctcccccc gcaacaactc gcattcagaa 540
ctgatgccgt cggccgagat atcatcaccc gaaagtgtta cacgagccaa tgcccccgcg 600
gttcttcccc acgtggttga tgaacgatac atcgacggtg agctgtgctt cgtgtatgca 660
gatgggtcac atcagcccaa gatcgtggac gggaagccag tcaatcccaa ttggggcgtg 720
accaaggcag ggaagccgcg aaagcgactc gcacaggcgt gcctgacctg tcgtgaaaag 780
aagatcaaat gtcaaccgaa tcggccaaaa tgcgatcagt gccaaaagtc gggacgcgag 840
tgtcgattcg aaaacgcgct ccgagggaat cgccccagag gctcgcattc agtgggaccg 900
tccgggaacg cgacctcgga aatcatcggt gctgtgtacg acatcactcg tgcatcggac 960
agtggagcat cacttccggg aagcggccat tcgcccattt cggaaagtgt tggcctgact 1020
ccatctggca tagaaattac gcacgatccc atgctagacg cagaacgagc ttatcgacag 1080
cgggcctatc gaatcccccg cccctttgag gaagacagtc acatccgaca cacgacctac 1140
cccgagacga atcgcctgcc tgagtatcag gagatcctcg gtgaaatgag agataccggc 1200
ccggacgatc ccctgctggc ctcgtggaac gtggacccgt tcgatcatga cccagaaatg 1260
actctgcact acgtcgacac tttcttcacc tatgtcaatg atggtttgta ccatatcttt 1320
ccccatgctc gatttatcct gtggctcaag tcctgcaaca ccaagtcgca agaagacaag 1380
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gccaaagttg gcccagggct tcccggtatc aacagggaca ccaggattta tttattctgc 3180
gaagtgatct tccgtcacag gtatttattc ggtcgaaaag tgctcatcat tggaaaatat 3240
tatgagctgt atctggaaga ggtaaacccg aaacgcgttt tattcttgtt gacatggagc 3300
tattaaagga tctctcatga gatgcctgca agcaattcgt tctgtatcag gcgcaggagc 3360
gtcccgtccg ggtcgaccaa agcggccatc gtgcctcccc actcttgcag ttcgggggca 3420
tggatgcgcg gatagccgct gctggtttcc tggatgccga cggatttgca ctgccggtag 3480
aactccgcga ggtcgtccag cctcaggcag cagctgaacc aactcgcgag gggatcgagg 3540
ccggggtggg cgaagaactc cagcatgaga tccccgcgct ggaggatcat ccagccggcg 3600
tcccggaaaa cgattccgaa gcccaacctt tcatagaagg cggcggtgga atcgaaatct 3660
cgtgatggca ggttgggcgt cgcttggtcg gtcatttgag atccttgggt agaataggta 3720
agtcagattg aatctgaaat aaagggagga agggcgaact taagaaggta tgaccgggtc 3780
gtccacttac cttgcttgac aaacgcacca agttatcgtg caccaagcag cagatgataa 3840
taatgtcctc gttcctgtct gctaataaga gtcacacttc gagcgccgcc gctactgcta 3900
caagtggggc tgatctgacc agttgcctaa atgaaccatc ttgtcaaacg acacaaattt 3960
tgtgctcacc gcctggacga ctaaaccaaa ataggcattc attgttgacc tccactagct 4020
ccagccaagc ccaaaaatgc tccttcaggt accaatattc gttcttcggg gcgaaaactc 4080
tcaaggatct taccgctgtt gagatccagc actcacaacc cacccactct cttcctccct 4140
ccctttctct ctctctctct cttgctctct ctctctctct tgctctctca ctagaaatta 4200
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tccggtgggc cttttcctcc ccccccacca cagaacagta cagtcgggct caagtgcagt 4320
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ctctctctct cgccctttct ttctcattcc atctctcttt ctctttctct ctttctcttt 4920
ctgtttttta atctccccct tcctccacca ctcgatacac ttggatgatc gtcaagcgca 4980
tcgccatctc gatttgattt tttccccacc gttcggtgcc tggatagccc gccgcttcga 5040
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