一种鹅等级卵泡石蜡切片的优化制备方法

技术领域

本发明涉及显微组织切片技术领域，具体的说涉及一种鹅等级卵泡石蜡切片的优化制备方法。

背景技术

为研究鹅等级卵泡发育过程以及决定其发育过程的卵泡颗粒细胞层的形态、结构变化规律，制备符合要求的鹅等级卵泡石蜡切片，成为进行该项研究首先必须解决的问题。

从鹅卵巢上分离的等级卵泡中含有较多量的卵黄物质，采用单一固定剂的固定方法和常规的石蜡切片制作技术难以制作出符合其天然结构特征的卵泡切片，往往表现出卵泡皱缩、变形，结构层次混乱，切片呈撕裂状等不足，严重影响了对结果的评价与判断。

因此提供一种鹅等级卵泡石蜡切片的优化制备方法以解决上述问题，是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种鹅等级卵泡石蜡切片的优化制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种鹅等级卵泡石蜡切片的优化制备方法，包括以下步骤：

(1)取材与固定：从鹅的卵巢上分离完整的等级卵泡并置于Bouin氏固定液中进行固定72h；

(2)脱水：等级卵泡固定后用水洗涤2h后擦干；依次置于梯度浓度酒精中进行浸泡脱水，得到脱水等级卵泡；

(3)透明：将脱水后的等级卵泡依次放入二甲苯和无水酒精混合液中1h、二甲苯Ⅰ液30min、二甲苯Ⅱ液30min，得到透明等级卵泡；

(4)浸蜡与包埋：将透明后的等级卵泡于65℃烘箱中依次浸入二甲苯和石蜡混合液30min，石蜡Ⅰ液1.5h，石蜡Ⅱ液12h，然后于室温下放入包埋盒中包埋24h，得到包埋蜡块；

(5)切片与展片：包埋蜡块于室温下冷却后进行连续切片，在水浴中展片后置于37℃烘箱中烘干12h，得到干燥切片；

(6)脱蜡和复水：取已干燥的切片放入二甲苯中脱蜡15min，然后放入梯度酒精中复水，再在水中洗3-5s，得到复水切片；

(7)染色：将复水切片放入苏木精染液中浸染，切片变为绛紫色时用水冲洗至颜色变蓝，放入伊红染液中浸染，切片变为紫红色用水洗3min，然后依次放入70％、80％酒精各30s，95％酒精2min，100％酒精3min，用吸水纸吸干多余的酒精，将切片放入二甲苯中浸泡5min，用中性树胶封片，室温晾干，即得鹅等级卵泡石蜡切片。

进一步，上述步骤(1)中鹅为麻醉后处死的鹅；

Bouin氏固定液组成为苦味酸饱和水溶液、40％甲醛和冰醋酸，且苦味酸饱和水溶液、40％甲醛和冰醋酸的体积比为75:25:5；

采用上述进一步方案的有益效果在于：采用混合固定剂Bouin氏液可以使鹅等级卵泡中所含蛋白和脂肪较好地保存和固定下来，同时由于其中所含的冰醋酸具有膨胀作用不会导致单独使用苦味酸饱和水溶液、4％甲醛、4％多聚甲醛固定所产生的卵泡皱缩变形问题，因而较之于常规的固定方法更适于鹅等级卵泡的固定。

进一步，上述步骤(2)中梯度酒精浸泡方法为50％酒精1h，70％酒精24h，80％酒精2h，95％酒精2次每次2h，无水酒精2次每次1h。

采用上述进一步方案的有益效果在于：本发明上述限定方案能够使体积较大且内含卵黄的鹅等级卵泡中的水分完全脱净，采用了较之于常规方法更长的脱水时间，并在高浓度酒精环节增加了脱水次数。

进一步，上述步骤(3)中二甲苯和无水酒精混合液中二甲苯和无水酒精的体积比为1:1；所述二甲苯Ⅰ液中二甲苯浓度为100％，二甲苯Ⅱ液中二甲苯浓度为100％。

采用上述进一步方案的有益效果在于：由于鹅等级卵泡膜组织结构致密，加之卵黄较多，本发明为了使透明剂能够较充分地溶入等级卵泡组织中，增强卵泡组织块的折光系数，因而较之于透明其他组织所用的常规方法应适当延长二甲苯透明时间。

进一步，上述步骤(4)中二甲苯石蜡混合液中二甲苯与石蜡的体积比为1:1。

采用上述进一步方案的有益效果在于：上述限定方案能够使蜡液能够较多地透过卵泡膜并充分浸入卵泡内，将脱水后松散的卵黄进行有效地支持并固定，因而较之于常规方法应适当延长浸蜡时间。

进一步，上述步骤(5)中切片厚度为5μm，水浴温度为50℃，烘箱温度为37℃。

采用上述进一步方案的有益效果在于：由于切片十分薄，本发明为保证卵黄和卵泡膜组织结构层次清晰可辨，防止温度过高引起的卵黄和卵泡膜膨胀分离，因而较之于常规方法应适当降低展片和烘干温度。

进一步，上述步骤(6)中梯度酒精复水方法为依次放入100％、100％、95％、80％、70％的酒精中各2min。

采用上述进一步方案的有益效果在于：上述方案能够使步骤(4)中为达到充分浸蜡而侵入的过多石蜡能被有效脱除，便于后续水溶性染液的染色，因而较之于常规方法增加了无水酒精的脱蜡环节。同时为了防止切片组织在梯度酒精复水中出现松散变形，较之常规方法减少了复水时间。

进一步，上述步骤(7)中苏木精染液中浸染时间为5min；伊红染液中浸染时间为2min。

更进一步，上述步骤(7)中95％酒精和100％酒精浸泡时分别浸泡2次；二甲苯浸泡时浸泡2次。

采用上述进一步方案的有益效果在于：上述方案能使鹅等级卵泡染色后的切片折射率增强，透明度更好，因而较之于常规方法在染色后采用了高浓度酒精脱水和二甲苯重复透明环节。

本发明的有益效果在于：本发明采用的Bouin氏固定液是良好的混合固定剂，穿透速度快，组织收缩性较小，固定均匀，固定后组织有适当的硬度，对于切片和染色均有良好的效果。

由于等级卵泡中含有大量卵黄等液体物质，常规固定和脱水时间难以彻底置换出卵泡内全部液体，经反复试验后认为在Bouin氏液中至少应固定72h，脱水程序也较常规方法作了优化，可获得较好的脱水效果。脱水卵泡放入二甲苯后仍会皱缩，重新脱水也不可恢复，通过试验可采取二甲苯：乙醇(1:1)过渡的方法解决这一问题。由于石蜡分子较大，不易透过卵泡膜，透蜡时适当延长时间，并首先把经透明处理的卵泡浸入二甲苯：石蜡(1:1)中，采用低熔点石蜡，效果更佳。Bouin氏固定液不仅能充分固定卵泡，且对卵泡造成的收缩小，黄色背景还能防止在脱水、透明、透蜡和包埋时小卵泡样本的丢失，固定后经水洗对染色并无明显影响。

附图说明

图1是从产蛋期鹅卵巢上获取的连续卵泡；

图2是本发明对鹅连续卵泡切片后的H&E染色结果。

图2可看出图中双箭头表示颗粒细胞层形态。从所示结果可见卵泡壁层、颗粒细胞层结构层次清晰、完整，无皱缩。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种鹅等级卵泡石蜡切片的优化制备方法，包括以下步骤：

(1)取材与固定：从麻醉后处死的鹅的卵巢上分离完整的等级卵泡并置于Bouin氏固定液中进行固定72h；Bouin氏固定液组成为味酸饱和水溶液75mL、40％甲醛25mL、冰醋酸5mL；

(2)脱水：等级卵泡固定后用水洗涤2h后擦干；依次置于梯度浓度酒精(50％酒精1h，70％酒精24h，80％酒精2h，95％酒精2次每次2h，无水酒精2次每次1h)中进行浸泡脱水，得到脱水等级卵泡；

(3)透明：将脱水后的等级卵泡依次放入1：1(V/V)的二甲苯和无水酒精混合液中1h、二甲苯Ⅰ液(100％二甲苯)30min、二甲苯Ⅱ液(100％二甲苯)30min，得到透明等级卵泡；

(4)浸蜡与包埋：将透明等级卵泡依次浸入1:1(V/V)的二甲苯和石蜡混合液30min，石蜡Ⅰ液1.5h，石蜡Ⅱ液12h，然后放入包埋盒中包埋，得到包埋蜡块；

(5)切片与展片：包埋蜡块于室温下冷却后进行连续切片，切片厚度为5μm，在50℃水浴中展片后置于37℃烘箱中烘干12h，得到干燥切片；

(6)脱蜡和复水：取已干燥的切片放入二甲苯中脱蜡15min，然后放入梯度酒精(依次放入100％、100％、95％、80％、70％的酒精中各2min)中复水，再在水中洗3-5s，得到复水切片；

(7)染色：将复水切片放入苏木精染液中浸染5min，切片变为绛紫色时用水冲洗至颜色变蓝，放入伊红染液中浸染2min，切片变为紫红色用水洗3min，然后依次放入70％、80％酒精各30s，95％酒精2次每次2min，100％酒精2次每次3min，用吸水纸吸干多余的酒精，将切片放入二甲苯中浸泡5min，用中性树胶封片，室温晾干，即得鹅等级卵泡石蜡切片。

对比例1

与实施例1的区别为以4％甲醛固定等量的卵泡，其余步骤与实施例1完全相同。

对比例2

与实施例1的区别为以4％多聚甲醛固定等量的卵泡，其余步骤与实施例1完全相同。

试验例1

使用Bouin氏液、4％甲醛、4％多聚甲醛分别固定等量的卵泡，固定72h后，经相同的程序脱水和透明后观察。结果如表1所示。由表1可知，在同样的固定时间和相同的脱水、透明操作后，Bouin氏液组较之其它两组更适合于用作鹅等级卵泡的固定。

表1不同固定液对鹅等级卵泡的固定效果

试验例2脱水方法确定

在确定Bouin氏固定液后，对脱水过程中发生皱缩的环节进行优化，增加二甲苯：乙醇(1:1)过渡环节，将之与不过渡平行组进行比较，结果如表2所示。由表2可知，增加二甲苯：乙醇(1:1)过渡环节，可以更好地保持卵泡的外观形态，未发生可见的明显皱缩。

表2增加二甲苯：乙醇(1:1)过渡环节对卵泡形态的影响

试验例3浸蜡时间确定

由于石蜡分子较大，不易透过卵泡膜，浸蜡时应适当延长时间。将经过透明处理后的卵泡采用两种不同的浸蜡时间程序，比较切片的完整性和层次。A组：石蜡Ⅰ液1.5h，石蜡Ⅱ液12h；B组：石蜡Ⅰ液1h，石蜡Ⅱ液2h，结果如表3所示。由表3可知，采用较长时间的浸蜡过程，可以获得更好的切片效果。

表3不同浸蜡时间对鹅等级卵泡切片质量的影响

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。